劉群秀，蔣韋斌，馬碩嘉，袁耀華

（1.上海城建職業(yè)學院，上海，201415；2.上海師范大學生命科學學院，上海，200223；3.嘉興凱實生物技術有限公司，嘉興，314000；4.上海動物園，上海，200335）

野生動物體內類固醇激素的分泌對生殖和應激等生理活動具有重要的調控作用，監(jiān)測各激素的變化特征是掌握動物繁殖狀況及健康程度的重要途徑［1］。生殖類固醇代謝物水平可以反映動物性腺的活動規(guī)律，在野生動物的生殖參數(shù)和發(fā)情周期等研究中得到廣泛應用［2?3］。血液激素的測定一直被認為是測定動物生殖激素最直接有效的方法，然而對于野生動物而言，血液樣品往往較難獲得，或是對動物損傷較大，因此，基于尿樣或糞樣監(jiān)測動物的內分泌指標，在不觸及動物的前提下測定個體生理狀態(tài)，越來越成為準確、實用的新方法［4］。研究表明，動物糞樣中含有大量微生物，如果新鮮糞樣未及時提取或處理，糞樣內外微生物將會分解糞樣中所含類固醇激素的代謝產物［5］，影響檢測結果的準確性。同樣，采取的糞樣保存方法及保存時間等因素也會影響糞樣激素檢測結果［2］。因此，如何科學有效地保存糞樣，從而客觀真實地反應動物的生理狀態(tài)？是專家和學者重點關注的科學問題。

赤斑羚（Naemorhedus baileyi）又名紅斑羚，為國家一級重點保護野生動物，IUCN 將其評估為易危（VU）［6］。由于棲息地資源的破壞和非法捕獵，赤斑羚種群數(shù)量極其稀少，生物學信息匱乏亟待制定保護策略和項目實施開展科學研究［7-8］。上海動物園有國內唯一的圈養(yǎng)赤斑羚種群，根據(jù)動物園記載，目前存活的赤斑羚數(shù)量稀少且性比嚴重失衡，平均增長率逐年下降［9］，科學的飼養(yǎng)和繁育是保證種群延續(xù)的必要條件。本研究以圈養(yǎng)赤斑羚為研究對象，基于糞便樣本測定生殖激素水平，同時探討不同糞樣保存方法對激素檢測結果的影響，以期為糞便類固醇激素檢測技術在野生動物中的準確應用提供借鑒，并為確定赤斑羚繁殖生物學信息以及科學繁育提供重要參考。

1 材料與方法

1.1 樣本采集

2018 年1 月—2019 年12 月，采集上海動物園健康成年赤斑羚（1，1♀）的新鮮糞便樣本，裝入離心管中，根據(jù)試驗設計分組。

1.2 樣本分組

將雌、雄糞樣分開，按每份5 g 裝入離心管中保存。選取雌性糞樣分別測定雌二醇和孕酮激素，選取雄性糞樣測定睪酮，每個測試類別設置3 個重復。其余樣本分為未處理組（Ⅰ）、乙醇浸泡組（Ⅱ）、干燥組（Ⅲ）、冷凍組（Ⅳ）和抗生素組（V）5 個處理組，以新鮮糞樣即時處理為對照，每個測試類別設置3 個重復。除冷凍組外，其余4 組皆置于室溫中通風保存（表1），環(huán)境溫度為（25±5）℃。

表1 赤斑羚糞樣5種不同保存方法Tab.1 Five different preservation methods for Naemorhedus baileyi fecal samples

將各處理組劃分為4個時間點：15、30、90、150 d，在達到不同時間點時處理糞樣，測定激素雌二醇、孕酮和睪酮水平，并與對照組比較。

1.3 生殖激素測定

1.3.1 生殖激素提取

將不同保存方式下離心管中的糞便（每份5 g）按時間點放入烘箱中完全干燥，研磨，取0.5 g 干燥糞便加入5.0 mL 95%乙醇充分震蕩30 min，然后離心15 min（5 000 r/min），取上清液1.8 mL于真空干燥機中干燥3 h，待干燥完成后在樣品中加入100 μL 95%乙醇和400 μL Assay Buffer（Assay Buffer∶純水=1∶4），震蕩直至充分混合后，離心4 min（1 500 r/min），取上清液用Assay Buffer進行10倍稀釋［V（上清液）∶V（Assay Buffer）=9∶1］，稀釋完成后將樣品置 于-20 ℃保存，待上機測定。

1.3.2 生殖激素水平測定

采用ELISA 法測定雌性赤斑羚的孕酮和雌二醇，以及雄性個體睪酮水平。測定儀器為邁瑞（Min?dray）酶標儀（MR-96A），試劑盒為北京北方生物技術研究所有限公司生產。

1.4 數(shù)據(jù)分析

分別統(tǒng)計、比較和分析雌二醇、孕酮和睪酮在4種糞樣保存方式、4個時間梯度下所測定的數(shù)據(jù)。將各組別在不同時間梯度（15、30、90、150 d）的測定結果與參照組比較，并比較不同時間梯度各組別之間的差異性。應用Shapiro-Wilk 分析檢驗每種糞樣保存方法的激素測定值是否符合正態(tài)分布，符合正態(tài)分布則應用單因素方差分析（one-way ANOVA test），不符合正態(tài)分布則應用卡方檢驗（chi-square test）［10］。數(shù)據(jù)分析應用SPSS 25.0軟件完成，顯著水平設定為α=0.05。

2 結果

共采集赤斑羚有效糞樣410 份，其中2018 年雄性62份，雌性65份，2019年雄性137份，雌性146份。所測定的生殖激素數(shù)據(jù)值均符合正態(tài)分布（Shapiro-Wilk test，p>0.05）。

2.1 糞樣保存時效性

糞樣雌二醇檢測結果表明，未處理組（Ⅰ）檢測值隨時間推移波動性較大，在15 d 和90 d 與參考值［（1.05±0.38）ng/mL］對比呈現(xiàn)顯著差異（p<0.05），并且樣本之間檢測值差異很大。乙醇浸泡組（Ⅱ）檢測值隨保存時間延長逐漸降低，至150 d時低于參考值，但未呈現(xiàn)顯著差異（p>0.05）。干燥組（Ⅲ）和冷凍組（Ⅳ）在各時間點的測定值均位于參考值范圍內，兩者的波動幅度均較?。▓D1A）。

孕酮檢測結果表明，隨時間延長，未處理組（Ⅰ）在15 d時測定值［（25.55±12.06）ng/mL］顯著高于參考值［（6.30±3.94）ng/mL］（p<0.05）；在30 d 和90 d時，測定值均高于參考值。乙醇浸泡組（Ⅱ）和冷凍組（Ⅳ）在各保存時間點均位于參考值范圍內，波動幅度小。干燥組（Ⅲ）糞樣測定的孕酮水平出現(xiàn)不規(guī)則波動（圖1B）。

睪酮檢測結果表明，未處理組（Ⅰ）和冷凍組（Ⅳ）中睪酮水平始終在參考值范圍內［（25.67±7.58）ng/mL］。乙醇浸泡組（Ⅱ）起伏較大，在30 d時測定值較低，為（12.78±4.29）ng/mL，與參考值間存在顯著差異（p<0.05）。干燥組（Ⅲ）測定值與乙醇浸泡組呈現(xiàn)相似的波動趨勢（圖1C）。

圖1 保存時間對不同保存方式糞樣中激素質量濃度的影響Fig.1 Changes in testosterone at varying storage time under four storage methods

抗生素組在15 d 時糞樣已全部融化，且液面表面長滿絮狀真菌，無法進行激素測定，視為保存失敗。

2.2 發(fā)情周期判定

基于糞樣保存時效性的研究結果，采用冷凍法保存赤斑羚糞便并測定生殖激素。雌二醇于2018年1 月上旬及12 月出現(xiàn)波峰，其余月份相對平穩(wěn)。2019 年2—4 月激素水平較高，并于10 月初和11 月中下旬—12月出現(xiàn)高峰（圖2A）。

孕酮水平在2018 年1 月初出現(xiàn)高峰，在2018 年11 月—12 月中旬出現(xiàn)多個峰值，持續(xù)時間較短；2019 年1 月初及1 月中旬出現(xiàn)短暫高峰，2 月保持穩(wěn)定，但水平較高，2019年9月下旬—12月中旬出現(xiàn)波動（圖2B）。

睪酮水平在2018 年1 月初出現(xiàn)高峰，在2018 年11 月—2019 年2 月末，以及10 月和11 月出現(xiàn)峰值（圖2C）。

圖2 赤斑羚糞便激素水平變化曲線（2018—2019年）Fig.2 Fecal testosterone level of red goral from 2018 to 2019

根據(jù)雌二醇和孕酮2 年的波動數(shù)據(jù)，初步預測雌性赤斑羚發(fā)情期為10月—翌年3月末，其中12月—翌年1月為發(fā)情高峰期，雄性赤斑羚發(fā)情期為10月—翌年2月末。

3 討論

研究表明，類固醇激素在排出體外前會在動物消化器官內進行生物轉化或滅活［5］，排出后，所含的腸道細菌和外界微生物可能與糞樣中類固醇激素發(fā)生反應［11］，導致試驗結果產生波動［12］。環(huán)境溫度、樣品新鮮程度、保存試劑選用，以及動物繁殖狀態(tài)等多種因素均會影響激素檢測的準確性［2，5，13?16］。本研究首次嘗試探討不同赤斑羚糞樣保存方法（無處理、乙醇浸泡、干燥和冷凍）對生殖激素檢測結果準確性的影響，其中未經(jīng)處理的赤斑羚糞樣在不同保存時間點激素含量起伏很大，與參考值差異顯著（p<0.05）。Millspaugh等［17］嘗試對麋鹿（Elaphurus davidianus）糞樣不做任何處理，常溫運輸6 d，發(fā)現(xiàn)其中的糖皮質激素含量明顯下降。Yamauchi等［15］研究發(fā)現(xiàn)，梅花鹿（Cervus nippon）糞樣在20 ℃保存時，孕酮含量會在24 h 內顯著上升。因此建議，新鮮動物糞樣應及時提取或適當處理，以減少糞樣中類固醇激素的異常波動或損失。

乙醇具有殺菌、抑制微生物代謝及分解酶活動的作用［18?19］，有助于輔助類固醇激素穩(wěn)定［3］。乙醇浸泡法易于操作，對于糞樣保存是很好地選擇。殷亞杰等［20］在對馴鹿（Rangifer tarandus）糞便類固醇激素保存時效的研究中發(fā)現(xiàn)，應用95%乙醇保存的糞便樣本，睪酮、孕酮和雌二醇保存時長分別為20、15、45 d。黃英等［21］采用95%乙醇和低溫保存川金絲猴（Rhinopithecus roxellana）的糞樣，樣本中睪酮和雌二醇可保存30 d，孕酮可保存10 d。需要強調的是，隨著時間推移，乙醇的揮發(fā)會導致類固醇共軛鍵斷裂，使糞樣內共軛類固醇代謝物分解或重新結合成單軛或無軛代謝物，并逐漸被微生物分解［22］。本研究中，應用乙醇浸泡保存的糞樣隨著時間的延長，對于孕酮檢測結果尚可，但對于雌二醇和睪酮檢測結果并不準確，因此認為乙醇浸泡法適合短期的糞樣保存（少于15 d），建議綜合應用抗生素或乙醇洗脫劑等抑制糞便中微生物的增殖［15］。

本研究中，干燥保存法對雌二醇檢測結果較為理想。Brockman等［23］應用干燥法保存維氏冕狐猴（Propithecus verreauxi）糞樣，發(fā)現(xiàn)雌二醇和睪酮含量可以穩(wěn)定儲存3 周。然而，糞便中類固醇分布都具有不均勻性且水分含量各不相同，不同物種糞便烘干最佳時長與溫度也不相同，不適當?shù)暮娓蓷l件會導致糞便內類固醇激素流失［1］，即干燥糞樣保存法的時間和溫度選取尚處于摸索階段。冷凍糞樣保存是最簡單快速的保存方法，廣泛應用于糞樣類固醇激素的保存［24］。研究表明，相對于多種糞樣保存方法，低溫冷凍糞樣中微生物稍有波動，與新鮮樣本最為相似，未經(jīng)冷凍的糞樣中類固醇激素會升高［25?26］，因此低溫保存是最為理想的糞樣保存方式［22］。在不具備冷凍條件情況下，干燥法為較好的替代方式，也可綜合應用幾種方法，如同時使用有機溶劑和冷凍保存法，以延長糞樣保存時效。對于糞便樣本保存，抗生素可以起到良好抑菌作用［12］。本研究亦嘗試使用抗生素（乳酸左氧氟沙星）保存糞樣，但出現(xiàn)了大量白毛狀真菌，無法進行激素檢測?？股啬軌蛞种撇糠治⑸锷L［27?28］，但對于赤斑羚糞便，乳酸左氧氟沙星不足以抑制更廣譜的微生物在糞樣中的生長繁殖。本研究中，試驗設定的保存時間較長，抗生素并不適用，在后續(xù)研究中應對抗生素短時保存糞樣效果進行評估。

動物繁殖行為的變化是其生殖生理狀況的外在表現(xiàn)，而生殖內分泌系統(tǒng)的調控作用主要是通過性腺分泌性激素來實現(xiàn)［29］。上海動物園赤斑羚合籠主要依據(jù)行為來判斷，如雌、雄個體隔欄頻繁接觸，雌性個體表現(xiàn)出邀配行為等，通常合籠時間為12 月—翌年2 月，然而行為觀察主要由經(jīng)驗豐富的保育員在晝間工作時隨機發(fā)現(xiàn)，缺少系統(tǒng)觀察和記錄，加之工作時間以外很多行為可能被錯過，因此僅僅基于行為判定赤斑羚的發(fā)情狀況存在很大誤差。本研究中，依據(jù)激素水平的年度波動，發(fā)現(xiàn)雌性赤斑羚在10月—翌年4月都可能存在發(fā)情，發(fā)情高峰為12月和1月，因此建議在日常飼養(yǎng)過程中，延長雌、雄合籠時間（10 月—翌年3 月），并加強合籠期間行為觀察和記錄，從而提升繁殖成功率。本試驗樣本采集在部分月份出現(xiàn)缺失，有待于在后續(xù)工作中補充。在不同保存條件下，赤斑羚糞便中3種生殖激素水平呈現(xiàn)不同波動趨勢，因此認為糞便內激素含量除了受保存方法的影響外，還需考慮其他因素。糞便中類固醇激素含量反映的是一段時間內的平均水平，應持續(xù)采集、長期監(jiān)測，從而獲得更加客觀、準確的研究結果。

致謝：研究的開展得到上海動物園繁殖場主管周鋒、保育員李海國，以及科研中心的大力支持，在此一并表示感謝。