藍(lán)俊麟，艾仁達(dá)，劉小龍，3，黃俊愷，楊云，陳明，魏平凡，袁智勇，3

（1.西南林業(yè)大學(xué)云南省高校極小種群野生動物保育重點實驗室，昆明，650224；2.云南文山國家級自然保護(hù)區(qū)，文山，663099；3.西南大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院淡水魚類資源與生殖發(fā)育教育部重點實驗室，重慶，400715；4.廣西師范大學(xué)珍稀瀕危動植物生態(tài)與環(huán)境保護(hù)教育部重點實驗室，桂林，541004）

1838 年Tschudi 建立棱皮樹蛙屬（Theloderma），該屬物種主要分布在斯里蘭卡、印度東北部、中國南方和東南亞，目前該屬共有26 個種，其中在中國記錄的有白斑棱皮樹蛙（Th.albopunctatum）、背崩棱皮樹蛙（Th.baibungense）、雙色棱皮樹蛙（Th.bicolor）、北部灣棱皮樹蛙（Th.corticale）、印支棱皮樹蛙（Th.gordoni）、河口棱皮樹蛙（Th.hekouense）、磚背棱皮樹蛙（Th.lateriticum）、棘棱皮樹蛙（Th.moloch）、緬甸棱皮樹蛙（Th.pyaukkya）和紅吸盤棱皮樹蛙（Th.rhodo?discus）10個種，云南省有白斑棱皮樹蛙、雙色棱皮樹蛙、印支棱皮樹蛙、河口棱皮樹蛙、棘棱皮樹蛙、緬甸棱皮樹蛙和紅吸盤棱皮樹蛙7個種［1?3］。

2022年3月和7月，在云南省文山壯族苗族自治州兩棲動物多樣性調(diào)查中，采集到2 號棱皮樹蛙屬物種標(biāo)本，經(jīng)外部形態(tài)特征對比及分子系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系分析，鑒定其為河江棱皮樹蛙（Th.khoii），為中國兩棲動物分布新紀(jì)錄種。本研究對該物種進(jìn)行了相應(yīng)形態(tài)特征測量，并對采集地的生境作了描述，為進(jìn)一步探討該物種的分布情況提供基礎(chǔ)性研究資料。

1 材料與方法

1.1 樣本采集

2022年3月和7月，在云南省文山壯族苗族自治州西疇縣文山國家級自然保護(hù)區(qū)小橋溝片區(qū)內(nèi)（23°21′38.89″ N，104°45′57.28″ E，海拔1 524 m），先后采集到棱皮樹蛙雄性（SWFU 21369）和雌性（SWU 0002984）標(biāo)本各1 號。組織樣品儲存在95%乙醇中以用于后續(xù)的分子實驗，標(biāo)本固定后浸泡在75%乙醇中，保存于西南林業(yè)大學(xué)生物多樣性保護(hù)學(xué)院。

1.2 形態(tài)學(xué)測量

依據(jù)Ninh等［4］和費梁等［5］的測量方法，使用精確度為0.1 mm 的游標(biāo)卡尺測量采集到的標(biāo)本形態(tài)指 標(biāo)：體 長（snout-vent length，SVL）、頭 長（head length，HL）、頭寬（head width，HW）、前眼角距（dis?tance between anterior corners of eyes，DAE）、后眼角距（distance between posterior corners of eyes，DPE）、眼徑（eye diameter，ED）、前眼至鼻孔間距（distance from anterior corner of the eye to the nostril，EN）、第三指盤寬（width of discs of fingers Ⅲ，F(xiàn)D3）、股長（fe?mur length，F(xiàn)EL）、前臂長（forelimb length，F(xiàn)LL）、第四趾長（fourth toe length，F(xiàn)TL）、腳長（foot length，F(xiàn)OL）、手長（hand length，HAL）、鼻間距（internarial dis?tance，IN）、眼間距（interorbital distance，IOD）、下頜角與前眼角之間的距離（distance between angle of jaw and anterior corner of the eye，MBE）、下頜骨后部至鼻孔間距（distance from the back of the mandible to the nostril，MN）、下頜角與后眼角之間的距離（dis?tance between angle of jaw and posterior corner of the eye，MPE）、鼻孔至鼻尖間距（distance from nostril to the tip of the snout，NS）、吻長（snout length，SNL）、脛長（tibia length，TBL）、脛寬（maximum tibia width，TBW）、第三指長（third finger length，TFL）、鼓膜徑（tympanum diameter，TYD）、鼓膜前緣至后眼角間距（distance from anterior margin of tympanum to posterior corner of the eye，TYE）和上眼瞼最大寬度（maximum width of upper eyelid，UEW）。同時基于Ninh等［4］對河江棱皮樹蛙的形態(tài)描述與采集標(biāo)本進(jìn)行形態(tài)比較。

1.3 分子系統(tǒng)發(fā)育分析

使用Thermo Fisher Scientific 公司提供的DNA提取試劑盒（Pure Link）對SWFU 21369 與SWU 0002984 的組織提取DNA，然后在冰箱中?20 ℃保存?zhèn)溆谩?6S rRNA 基因的擴(kuò)增引物參照Simon等［6］的16S-1（5′-CGCCTGTTTACCAAAAACAT-3′）和16S-2（5′-CCGGTCTGAACTCAGATCACGT-3′）。PCR 反應(yīng)程序：95 ℃預(yù)熱5 min；95 ℃變性40 s，53 ℃退火 40 s，72 ℃延伸1 min，35 個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物使用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，產(chǎn)物最后送至北京擎科生物科技有限公司測序。根據(jù)Ninh等［4］對棱皮樹蛙屬的最新研究結(jié)果，從NCBI 數(shù)據(jù)庫下 載棱皮樹蛙屬物種的16S rRNA 基因序列與本研究 測定的序列進(jìn)行整合分析，外群選取Nyctixalus pic?tus［7］（表1）。

表1 樣品分子分析信息Tab.1 Sample information used for the molecular analysis.

使用MEGA 7.0［8］對樣本的序列進(jìn)行比對，用Kimura雙參數(shù)模型計算物種間的遺傳距離。系統(tǒng)發(fā)育分析分別采用貝葉斯分析法（BI）和最大似然法（ML），以一個特定的替代模型分析既定的Th.khoii16S rRNA 基因序列，“最佳”序列演化模型使用jModelTest 2［9］中實施的Akaike信息準(zhǔn)則（AIC）推斷。通過使用16S數(shù)據(jù)恢復(fù)的最佳模型是GTR+G。使用RAxML 8.2.10 進(jìn)行ML 搜索［10］，并用1 000 個重復(fù)的非參數(shù)自舉重采樣評估ML分析下的自舉支持。最后采用MrBayes 3.2進(jìn)行貝葉斯系統(tǒng)發(fā)育分析［11］。本研究設(shè)置GTR+G 模型為核苷酸替換模型，使用馬爾科夫鏈蒙特卡洛（MCMC）鏈獨立運算4 次，共執(zhí)行 2 000 萬代，每1 000 代抽樣1 次，拋棄前25%。通過查看分散頻率的平均標(biāo)準(zhǔn)差（<0.01）確定取樣是否達(dá)到穩(wěn)定，然后通過Tracer v1.5 軟件檢測有效樣本量（ESS>200）來檢查各運行參數(shù)值是否收斂。

2 結(jié)果

2.1 形態(tài)描述

采集到的標(biāo)本為成年雄性(SWFU 21369)和成年雌性(SWU 0002984)，相較于雄性(體長38.3 mm)，雌性體型更大(體長42.4 mm)；頭部長度小于頭部寬度，吻棱圓，吻端鈍尖且短，眼大(雄性眼徑長4.6 mm，雌性眼徑長5.4 mm)，瞳孔黑色呈圓形，虹膜黃綠色，有不規(guī)則的黑色網(wǎng)狀，眼瞼有小刺。該標(biāo)本各個部位度量數(shù)據(jù)見表2。

表2 河江棱皮樹蛙成體測量值Tab.2 Measurements of adult Theloderma khoii

成年雄性(SWFU 21369)鼓膜明顯呈深綠色，直徑小于眼睛直徑，周圍有小疣粒。有顳褶，有犁骨齒，舌后端游離有缺刻。身體側(cè)面圖案有清晰的深棕色斑點，腹側(cè)連接黃綠色帶，腹部具有不規(guī)則黑色、黃綠色圖案，喉上有少量較小的藍(lán)色斑點，股后部黑色，有黃綠色條紋和一些紅棕色疣(圖1A-C)。前肢和后肢背表面有深綠色條紋，手指和腳趾盤均為綠色；有婚墊，婚墊呈淡黃色；有蹼，指末端膨大成吸盤；有趾溝，關(guān)節(jié)下瘤大而明顯，第四指外側(cè)面有緣膜，第四指外邊緣有明顯鋸齒，指序為Ⅰ<Ⅱ<Ⅳ<Ⅲ。趾上有吸盤，趾末端膨大成吸盤并有趾溝，關(guān)節(jié)下瘤大且圓，第五趾外側(cè)面有緣膜，趾序為Ⅰ<Ⅱ<Ⅴ<Ⅲ<Ⅳ(圖1D-G)。

圖1 河江棱皮樹蛙形態(tài)（云南省西疇縣法斗鄉(xiāng)，SWFU 21369，雄性；艾仁達(dá) 攝影）Fig.1 Morphology of Theloderma khoii （Fadou Town of Xichou County，Yunnan Province，SWFU 21369，male.Photoed by AI Renda）

2.2 系統(tǒng)發(fā)育分析

采集的棱皮樹蛙屬標(biāo)本與Th.khoii模式產(chǎn)地（越南東北部地區(qū)）標(biāo)本聚在一個支系內(nèi)（圖2）。通過計算的遺傳距離分析結(jié)果顯示，棱皮樹蛙屬標(biāo)本與Th.khoii遺傳距離為0，共享同一單倍型，表明所采棱皮樹蛙屬標(biāo)本為Th.khoii。

圖2 基于線粒體16S rRNA 基因序列構(gòu)建的棱皮樹蛙屬部分物種貝葉斯系統(tǒng)發(fā)育樹（云南省西疇縣法斗鄉(xiāng)）Fig.2 Bayesian phylogenetic tree for Theloderma constructed based on 16S rRNA gene sequences （Fadou Town of Xichou County，Yunnan Province）

2.3 生境描述

云南文山國家級自然保護(hù)區(qū)為亞熱帶常綠闊葉林生態(tài)系統(tǒng)，受北部灣和孟加拉灣暖濕氣流的影響，處于東亞季風(fēng)與南亞季風(fēng)過渡轉(zhuǎn)變地區(qū)，呈現(xiàn)東部濕潤、西部干燥，迎風(fēng)坡濕潤、背風(fēng)坡干燥等氣候特點；保護(hù)區(qū)為中山山地，區(qū)內(nèi)河流較多，地形復(fù)雜，多為短小的山間溪流，氣溫空間變化也十分復(fù)雜，呈現(xiàn)西高東低的特點［12］。此次采集地位于云南文山國家級自然保護(hù)區(qū)的小橋溝片區(qū)，海拔1 524 m，采集到的標(biāo)本與模式標(biāo)本采集點海拔（1 320～1 750 m）相吻合。采集地有一條溪流，植被茂密以喀斯特地貌的常綠闊葉林為主，常年濕度較大（圖3）。

圖3 河江棱皮樹蛙棲息地環(huán)境（艾仁達(dá) 攝影）Fig.3 Habitat of Theloderma khoii（Photoed by AI Renda）

3 討論

系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果顯示，采集自云南文山國家級自然保護(hù)區(qū)的標(biāo)本與河江棱皮樹蛙的模式標(biāo)本聚為一個支系，且遺傳距離接近0，應(yīng)為同一物種，證實了該物種在中國的分布。采集自云南文山國家級自然保護(hù)區(qū)的標(biāo)本與河江棱皮樹蛙模式標(biāo)本在形態(tài)描述上基本一致，但在形態(tài)測量值上也存在一定的差異。二者的形態(tài)測量值差異主要表現(xiàn)在體長，頭長，頭寬，下頜骨后部至鼻孔間距，下頜角與前眼角、后眼角之間的距離，吻長，這些表型變化是物種地理種群變異的結(jié)果。云南文山國家級自然保護(hù)區(qū)標(biāo)本采集地與河江棱皮樹蛙模式產(chǎn)地緯度相差0.3°，直線距離超過50 km，由于河江棱皮樹蛙樹棲的生物學(xué)特征和喀斯特地區(qū)復(fù)雜的孤島生境［13］，使得不同群體之間存在地理隔離，從而導(dǎo)致形態(tài)性狀存在差異。

中國南部的棱皮樹蛙屬物種多樣性較高，僅次于越南，迄今為止，共有10個種被紀(jì)錄，云南多達(dá)7個種［2］。但該屬目前的物種豐富度可能仍然是被低估的，結(jié)合形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)的數(shù)據(jù)，將有助于更好地揭示中國南部其他缺乏研究的地區(qū)的棱皮樹蛙屬物種豐富度。本次發(fā)現(xiàn)為我國棱皮樹蛙屬增加了一個物種新紀(jì)錄。河江棱皮樹蛙在云南文山國家級自然保護(hù)區(qū)的首次發(fā)現(xiàn)，進(jìn)一步豐富了云南文山國家級自然保護(hù)區(qū)的生物多樣性，同時對于保護(hù)區(qū)的生態(tài)保護(hù)和生物進(jìn)化研究也具有十分重要的意義。

致謝：感謝西南林業(yè)大學(xué)康澤沼、李先琦同學(xué)在標(biāo)本采集以及分子鑒定方面給予的幫助。