龔志海，朱利永，任小冬 ，饒偉強(qiáng)，雷勝橋，吳莉莉，劉力軍，張燕，李秋明，陳斌，謝和平

（1.廣東粵北華南虎省級(jí)自然保護(hù)區(qū)管理處，韶關(guān)，512023；2.廣東省嶺南院勘察設(shè)計(jì)有限公司，廣州，510500；3.杭州艾迪康醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)中心有限公司，杭州，310030）

華南虎（Panthera tigris amoyensis）是我國(guó)特有的虎亞種，野外已多年未發(fā)現(xiàn)蹤跡。我國(guó)在20 世紀(jì)五六十年代，先后從野外捕獲到18 頭華南虎，但僅6 頭（2，4♀）有繁殖記錄。全國(guó)各地圈養(yǎng)的華南虎都是這6 頭繁殖的后代［1］。目前國(guó)內(nèi)圈養(yǎng)的華南虎種群是一個(gè)高度近親的種群，遺傳多樣性大大降低，種群生育率和幼崽成活率均較低。染色體作為生物遺傳物質(zhì)，是染色質(zhì)在細(xì)胞分裂中期的特殊形態(tài)，是生物細(xì)胞遺傳學(xué)的主要研究對(duì)象。染色體顯帶反映了調(diào)節(jié)DNA 復(fù)制、修復(fù)、轉(zhuǎn)錄和遺傳重組的基因組功能結(jié)構(gòu)。核型分析可用于探討物種親緣關(guān)系與進(jìn)化、遠(yuǎn)緣雜種的鑒定以及遺傳病的機(jī)制［2］，是評(píng)估染色體畸變的一種常規(guī)有效方法［3?4］，與熒光原位雜交、單核苷酸多態(tài)性陣列和基因組測(cè)序等其他更敏感的技術(shù)相比，核型分析的分辨率較低［4?5］。

華南虎作為瀕危物種，在核型分析方面研究較少。張錫然等［6?7］對(duì)華南虎染色體核型進(jìn)行了分組，報(bào)道了染色體臂比值等數(shù)據(jù)，并對(duì)東北虎（P.t.altaica）和華南虎染色體進(jìn)行了比較，但對(duì)華南虎染色體帶型的研究并不深入。本研究針對(duì)華南虎染色體核型和帶型做進(jìn)一步研究，利用G 帶技術(shù)分析華南虎染色體核型及帶型，初步建立華南虎染色體G 帶核型模式圖，以期充實(shí)華南虎染色體研究的基礎(chǔ)資料，為虎亞種分類提供遺傳學(xué)證據(jù)，同時(shí)為進(jìn)一步研究華南虎種群遺傳基因提供新的參考。

1 材料與方法

1.1 樣本采集

以華南虎繁育研究基地的飼養(yǎng)華南虎外周血為研究對(duì)象。將成年虎麻醉保定（舒泰0.02 mg/kg+多咪靜0.02 mL/kg），幼虎人工保定，從后肢或尾部采集外周血液樣本。將外周血樣置于肝素鈉抗凝真空采血管（山東康利萊醫(yī)療器材有限公司）內(nèi)，輕輕顛倒混勻數(shù)次，使抗凝劑與血樣充分接觸、溶解，防止凝固。在2020—2022 年，共采集8 只虎（6，2♀）的血樣。

外周血樣在運(yùn)輸過(guò)程中避免劇烈晃動(dòng)，在極 熱或極寒條件下保溫運(yùn)輸。血樣在48 h 內(nèi)接種，當(dāng)日無(wú)法接種或已接種后的標(biāo)本可置于冰箱4 ℃保存。

1.2 染色體標(biāo)本制備與培養(yǎng)

各取0.4 mL肝素鈉抗凝外周血平行接種于2瓶淋巴細(xì)胞培養(yǎng)液（廣州白云山拜迪生物醫(yī)藥有限公司）中，混勻后置二氧化碳培養(yǎng)箱（THERMO ELECTRON HEPA CLASS 100）37 ℃培養(yǎng)72 h。加入40 μg/mL 秋水仙素20 μL，作用80 min 后收獲淋巴細(xì)胞，收獲步驟：（1）將培養(yǎng)細(xì)胞轉(zhuǎn)移至15 mL 離心管中，1 500 r/min，離心10 min，去上清，加入0.075 mol/L KCl 低滲，37 ℃水浴，1 500 r/min，離心10 min，去上清，細(xì)胞預(yù)固定，即直接在低滲后的細(xì)胞懸液中緩慢加入2 mL新鮮配制的固定液［V（甲醇）∶V（冰醋酸）=3∶1］，輕輕混勻細(xì)胞，吹氣法吹打4～9次后，1 500 r/min，離心10 min 后傾去上清。（2）細(xì)胞固定，即加入固定液8 mL，用吹氣法輕輕吹打細(xì)胞數(shù)次，直至細(xì)胞完全分散，蓋上蓋子，室溫下靜置30 min，離心機(jī)1 500 r/min，室溫下離心10 min，去上清。（3）再次細(xì)胞固定，重復(fù)（2）步驟。吸取固定好的細(xì)胞懸液均勻滴于冰玻片上（5 或6 滴），過(guò)火，80 ℃烤片1 h，胰酶G 帶處理，Giemsa 染色。顯微鏡（OLYMPUS CX41）低倍鏡下尋找良好分裂相，高倍油鏡下觀察形態(tài)清晰、分散良好和背景干凈的染色體中期分裂相，并顯微攝影。

1.3 核型分析方法

每例染色體標(biāo)本至少選取20 個(gè)分散適宜、染色深淺適宜和顯帶清晰的中期分裂相計(jì)數(shù)，并至少分析5 個(gè)分裂相。若發(fā)現(xiàn)有嵌合可能，則增加計(jì)數(shù)至50 個(gè)分裂相。利用染色體核型分析系統(tǒng)（以色列ASI）拍片、存檔。依據(jù)《ISCN》（人類細(xì)胞遺傳學(xué)國(guó)際命名體制）對(duì)染色體核型進(jìn)行分析診斷。

2 結(jié)果

2.1 染色體數(shù)

鏡檢80 個(gè)華南虎淋巴細(xì)胞的染色體中期分裂相，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞染色體數(shù)少于38 條的比例為6.25%，染色體數(shù)為38 條的比例為93.75%，染色體數(shù)大于38條的比例為0。絕大多數(shù)（93.75%）淋巴細(xì)胞的染色體數(shù)為38 條，因此，華南虎外周血細(xì)胞染色體數(shù)為2n=38條（n=19）（圖1）。

圖1 華南虎染色體中期分裂相Fig.1 Metaphase division phase of chromosomes in south China tiger

2.2 染色體核型

選取20 個(gè)有絲分裂中期分裂相良好、邊緣清晰的染色體，測(cè)量長(zhǎng)臂、短臂和著絲粒，計(jì)算相對(duì)長(zhǎng)度、臂比值及著絲粒指數(shù)，依照染色體大小遞減排列，將常染色體依次編號(hào)為1～18，性染色體不編號(hào)，分別以X和Y排列在最后。

根據(jù)著絲粒位置分類方法［8］，華南虎18 個(gè)常染色體中，2、5、13、18 號(hào)染色體為中部著絲粒染色體（m）；1、4、7、8、9、10、11、12、14、17 號(hào)染色體為亞中部著絲粒染色體（Sm）；3、6 號(hào)染色體為亞端著絲粒染色體（St）；15、16 號(hào)染色體為端著絲粒染色體（t）。性染色體X 為1條較大的中部著絲粒染色體（m），性染色體Y 為所有染色體中最短的1 條亞中部著絲粒染色體（Sm）（表1）。核型公式為8（m）+20（Sm）+4（St）+4（t），XY（m，Sm）/XX（m，m）。雄、雌華南虎染色體鏡檢見(jiàn)圖2。

表1 華南虎染色體特征Tab.1 Chromosome characteristics of south China tiger

圖2 雄（A）、雌（B）華南虎染色體鏡檢結(jié)果Fig.2 Chromosomal microscopy of male（A）and female（B）south China tiger

2.3 染色體G帶帶型模式

從染色體G 帶帶型看，華南虎同源染色體帶紋基本一致，帶紋在每一對(duì)染色體上的數(shù)目和分布具有明顯的特征。不同長(zhǎng)度染色體具有不同的帶紋，一般染色體長(zhǎng)度越長(zhǎng)帶紋越多（圖3）。常染色體中帶紋最多的是1 號(hào)染色體，G 帶數(shù)為24 條帶；帶紋最少的是18號(hào)染色體，G帶數(shù)為6條帶。X染色體長(zhǎng)度介于9 號(hào)和10 號(hào)染色體之間，G 帶數(shù)為12 條帶。Y染色體是所有染色體中最短的染色體，G 帶數(shù)僅為 3條帶（圖4）。

圖3 華南虎染色體G帶Fig.3 Chromosome G-banding of south China tiger

圖4 華南虎染色體G帶核型模式圖譜Fig.4 G-banding karyotype pattern map of south China tiger

3 討論

3.1 樣本采集、細(xì)胞培養(yǎng)及染色體制備

染色體的相關(guān)研究一般采用腎組織培養(yǎng)的方法，該方法成功率較高、效果較好，但對(duì)于華南虎等兇猛且瀕危的哺乳動(dòng)物來(lái)說(shuō)卻存在較大風(fēng)險(xiǎn)，采樣難度大。本研究選取華南虎的外周血液樣本作為研究對(duì)象，雖降低了采樣難度，但較難進(jìn)行重復(fù)采樣，因此，在細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)規(guī)范操作，按規(guī)定的試驗(yàn)步驟提高試驗(yàn)成功率。

華南虎外周血淋巴細(xì)胞培養(yǎng)是染色體標(biāo)本制備成功的關(guān)鍵步驟。將血樣接種至淋巴細(xì)胞培養(yǎng)液后放進(jìn)培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，使淋巴細(xì)胞從G0 進(jìn)入細(xì)胞周期，開(kāi)始DNA 復(fù)制，當(dāng)淋巴細(xì)胞處于分裂中期時(shí)，是進(jìn)行核型分析和染色體研究的最佳時(shí)期。秋水仙堿能破壞并阻止形成細(xì)胞的紡錘體，使分裂的細(xì)胞停留在分裂中期，此外，秋水仙堿還可使染色體收縮，使染色體形成清晰的輪廓［9］。低滲處理可使細(xì)胞腫脹，有利于染色體的分散，空氣干燥可使細(xì)胞和染色體展平。由于染色體標(biāo)本制作過(guò)程較長(zhǎng)，包括細(xì)胞培養(yǎng)、秋水仙素處理、低滲、固定、制片、消化和顯帶等步驟，中間還涉及反復(fù)混勻、離心，因此，培養(yǎng)基的成分、pH 值、固定效果、離心和混勻的力度等都是影響染色體標(biāo)本制備成功的重要因素［10］。此外，試驗(yàn)材料、秋水仙素濃度、處理時(shí)間、低滲溶液種類和滴片時(shí)溫差等均可對(duì)染色體的實(shí)際長(zhǎng)度、相對(duì)長(zhǎng)度及臂比值產(chǎn)生影響［11］。所以，還需要更多試驗(yàn)研究來(lái)豐富華南虎染色體核型帶型方面的內(nèi)容。細(xì)胞學(xué)的核型分析資料作為分類學(xué)的證據(jù)，結(jié)合形態(tài)學(xué)、解剖學(xué)、胚胎學(xué)和遺傳學(xué)等方面的證據(jù)，在解決物種分類的疑難問(wèn)題上發(fā)揮不少作用，而且是建立生物學(xué)物種和新的自然分類系統(tǒng)所必不可少的資料［12］。因此，華南虎染色體核型帶型研究十分必要。

3.2 染色體核型分析

華南虎染色體組內(nèi)各條染色體的長(zhǎng)度不一致，絕對(duì)長(zhǎng)度可通過(guò)顯微鏡測(cè)量，也可采用放大照片測(cè)量后換算得出。由于染色體制片過(guò)程中使用的藥劑和方法不同，以及標(biāo)本固定供觀察時(shí)細(xì)胞分裂不可能保證在同一時(shí)期，故染色體的收縮會(huì)有所差異而導(dǎo)致染色體絕對(duì)長(zhǎng)度在同一物種或個(gè)體的不同細(xì)胞間產(chǎn)生差異，針對(duì)這種情況，在分析中常以相對(duì)長(zhǎng)度作為度量染色體長(zhǎng)度的標(biāo)準(zhǔn)。相對(duì)長(zhǎng)度排除了因技術(shù)原因引起的染色體收縮程度不同所產(chǎn)生的差異，因此，相對(duì)長(zhǎng)度值是一個(gè)較穩(wěn)定的可比較的數(shù)值。染色體以相對(duì)長(zhǎng)度從長(zhǎng)至短排序編號(hào)，將性染色體單獨(dú)列出，進(jìn)而能更好地與同類相關(guān)研究進(jìn)行比較。染色體的臂比和著絲粒指數(shù)也是染色體的重要特征，反映著絲粒的相對(duì)位置。在核型測(cè)量過(guò)程中可能存在一定的測(cè)量誤差，要對(duì)華南虎染色體進(jìn)行精確研究，可利用染色體顯帶或熒光原位雜交等技術(shù)，提高同源染色體配對(duì)的準(zhǔn)確性，從而更精確地分析華南虎的核型特征。

張錫然等［6?7］研究表明，華南虎染色體數(shù)為38條，其中包含1 對(duì)性染色體，與本研究結(jié)果一致，但因采用的計(jì)算和排序方法不同，使核型分組結(jié)果與本研究結(jié)果無(wú)法直接比較。從華南虎染色體分組來(lái)看，本研究結(jié)果與張錫然等［6?7］研究存在明顯區(qū)別，其認(rèn)為華南虎染色體應(yīng)分為5 組，即A 組6 對(duì)（Sm），B 組6 對(duì)（m），C 組3 對(duì)（St），D 組2 對(duì)（t），E 組1 對(duì)（m），XY 性染色體皆為中著絲粒染色體，而本研究得到的華南虎染色體核型公式為8（m）+20（Sm）+4（St）+4（t），XY（m，Sm）/XX（m，m），造成這種差異的原因有待進(jìn)一步研究。另外，張錫然等［6?7］研究中通過(guò)銀染發(fā)現(xiàn)18 號(hào)染色體存在次縊痕，而本研究因僅進(jìn)行G 帶核型分析，所以未發(fā)現(xiàn)存在次縊痕的染色體，該情況也需要進(jìn)一步研究才能得出結(jié)論。

與鄭維平等［13］研究的東北虎染色體核型特征數(shù)據(jù)進(jìn)行比對(duì)，發(fā)現(xiàn)華南虎與東北虎雖然都是38 條染色體，但多條染色體存在差異，如華南虎4 號(hào)、7 號(hào)、11 號(hào)和Y 染色體臂比值分別為（2.521±0.262）、（2.525±0.263）、（2.357±0.245）和（2.982±0.308），而東北虎4 號(hào)、7 號(hào)、11 號(hào)和Y 染色體臂比值分別為（1.063±0.092）、（1.545±0.071）、（1.500±0.063）和（1.000±0.022），對(duì)比以上數(shù)據(jù)可知，華南虎與東北虎在染色體形態(tài)上具備足夠的差異，在動(dòng)物分類學(xué)上可將染色體核型作為虎亞種判定的一種依據(jù)。

3.3 G帶帶型分析

華南虎染色體每個(gè)分裂相中同源染色體帶紋基本相同，按照帶紋的特征能將同源染色體準(zhǔn)確配對(duì)，G 帶的研究結(jié)果顯示雄性華南虎的核型公式為2n=38=8（m）+20（Sm）+4（St）+4（t），XY（m，Sm），雌性華南虎的核型公式為2n=38=8（m）+20（Sm）+4（St）+4（t），XX（m，m）。在G 帶分析前僅按照染色體相對(duì)長(zhǎng)度和臂比值進(jìn)行分組排序存在誤差的可能性較大，如本研究中華南虎7 號(hào)和8 號(hào)染色體的相對(duì)長(zhǎng)度和臂比值非常接近，在類似常規(guī)染色體核型中難以區(qū)別。因此，使用吉姆薩干性混合物作為染色試劑，可在染色體上產(chǎn)生某種特定的帶型模式，這種G 帶技術(shù)方法有利于染色體的分組和排列。因此，在考察G 帶數(shù)時(shí)，通常不能簡(jiǎn)單地分析分帶的數(shù)目，而應(yīng)分析分帶的分布趨勢(shì)以及穩(wěn)定性，特別是以某些深色區(qū)帶或非著色區(qū)位置作為鑒定的依據(jù)［14］。研究發(fā)現(xiàn)華南虎G 帶帶型特征及數(shù)目與顯帶處理?xiàng)l件有密切關(guān)系，對(duì)開(kāi)展貓科（Felidae）動(dòng)物細(xì)胞遺傳學(xué)特性、染色體基因定位及染色體多態(tài)性改變的研究有重要意義。染色體的帶分布于臂的不同區(qū)，在識(shí)別染色體時(shí)，這些連續(xù)和明顯的形態(tài)學(xué)特征具有重要意義。

目前，國(guó)內(nèi)關(guān)于華南虎染色體研究的文獻(xiàn)資料極少，因此，本研究中華南虎染色體核型模式圖譜僅為初步研究結(jié)果，華南虎的核型及部分帶型與張錫然等［7］的相關(guān)研究存在差異還有待進(jìn)一步深入研究。

4 結(jié)論

通過(guò)G 帶技術(shù)對(duì)華南虎染色體進(jìn)行核型及帶型分析，初步建立華南虎染色體G 帶核型模式圖，得出結(jié)論：（1）華南虎的二倍體染色體數(shù)為2n=38 條，其中常染色體18 對(duì)，性染色體1 對(duì)。（2）核型公式為8（m）+20（Sm）+4（St）+4（t），XY（m，Sm）/XX（m，m）。（3）經(jīng)比對(duì)發(fā)現(xiàn)，華南虎與東北虎染色體核型存在明顯差異。研究結(jié)果能為華南虎的細(xì)胞遺傳學(xué)研究提供更為詳實(shí)的基礎(chǔ)資料，促進(jìn)華南虎物種保護(hù)事業(yè)的發(fā)展。