惠林沖，陳微，李威亞，潘美紅，何林玉，王江英，陳振泰，繆美華，楊海峰

（連云港市農(nóng)業(yè)科學院，江蘇 連云港 222000）

洋蔥愈傷組織的誘導、再生與外植體的選擇關(guān)系密切。研究發(fā)現(xiàn)，洋蔥的種子［1］、成熟胚［2］、鱗莖盤［3］、胚根［4］等均可作為外植體誘導形成愈傷組織，但部分誘導出的愈傷組織不能形成再生苗。Valk等［5］認為洋蔥愈傷組織誘導受基因型影響，因此，誘導時需要對多種材料進行篩選，綜合考慮外植體類型、污染率、消毒操作難易程度等。

我國的經(jīng)濟正在進入深化改革的階段，社會資源的供需矛盾正在加劇。最明顯的問題就是社會利益分配不均。由于法律制度存在滯后性，而我國的發(fā)展速度非?？欤斐闪朔煞ㄒ?guī)的建設無法跟上社會的發(fā)展速度。普遍存在的問題是對權(quán)利的監(jiān)督不完善，導致社會不公平的問題較多，影響青少年價值觀的形成。需要加快社會保障制度的完善，提高法律法規(guī)的規(guī)范化，做到有法可依和有法必依。

洋蔥種子易保存，但存在種子污染率較高、后期需要轉(zhuǎn)接胚以及操作繁瑣且不適宜大規(guī)模篩選操作等問題。目前，中國水仙［6］、石蒜［7］、桂花［8］、文心蘭［9］等花卉植物的花梗經(jīng)誘導均可形成愈傷組織，而洋蔥的小花梗多且易取，消毒方便、污染率低。因此，本試驗選取8個洋蔥品種，用其花梗進行愈傷組織誘導及再生研究，以期為構(gòu)建洋蔥遺傳轉(zhuǎn)化體系和基因編輯技術(shù)研究奠定基礎(chǔ)。

2012年8月31日第十一屆全國人民代表大會常務委員會第二十八次會議通過了《關(guān)于修改〈中華人民共和國民事訴訟法〉的決定》，該修改決定首次在簡易程序章節(jié)中以法律形式規(guī)定了我國的民事小額訴訟制度，其意義極為重大。然而，因為立法對小額訴訟制度只作了簡單的規(guī)定，所以導致不同人對小額訴訟有不同的解讀，小額訴訟制度的多義性在學理上有其合理性，但在實踐中卻不利于其統(tǒng)一實施?；诖?，本文擬通過對小額訴訟程序性質(zhì)的解讀，為小額訴訟制度的具體規(guī)范提供一些前提性的資源。

1 材料與方法

1.1 材料

本試驗選用中日照洋蔥品種（表1），均種植于連云港市農(nóng)業(yè)科學院東辛試驗基地。于洋蔥先期抽薹時取未開裂花苞，裝入密封袋中4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

表1 供試洋蔥品種詳細信息

1.2 花梗愈傷組織誘導

醫(yī)院要完善新醫(yī)改下的精細化管理工作，就需要有力的財經(jīng)管理部門作為支撐，按照《醫(yī)院財務制度》，實施全面預算管理，著力成本控制，有效防范風險，達成綜合績效目標，使財務工作實現(xiàn)閉環(huán)式管理。通過建立管理會計制度，促進醫(yī)院財務精細化，科學化管理，優(yōu)化流程，提升組織效率。但是，在這個階段，醫(yī)院財務人員的整體規(guī)模不足。這表明在推進管理會計的過程中，管理型人才實力就更加緊缺。

1.3 愈傷組織繼代培養(yǎng)及再生苗誘導

將誘導出的洋蔥苗在再生培養(yǎng)基（MS＋30 g／L蔗糖＋8 g／L瓊脂）中生根，待基部鱗莖達0.5 cm，于4℃放置24 h。用清水清洗根部培養(yǎng)基（根部不離水）后移栽到花盆中，室內(nèi)（散射光照射）放置3 d后移至室外生長，期間防止陽光直射。

1.4 馴化移栽

將誘導得到的愈傷組織繼代培養(yǎng)基（MS＋1.8 mg／L 2，4-D ＋30 g／L蔗糖＋8 g／L瓊脂）培養(yǎng)4周后轉(zhuǎn)接至無激素的培養(yǎng)基（MS＋30 g／L蔗糖＋8 g／L瓊脂）上，每品種轉(zhuǎn)接80瓶，每瓶5個愈傷。在光照強度為50μmol／（m2·s）、光周期16 h／d、25℃條件下培養(yǎng)120 d后，統(tǒng)計再生芽的數(shù)量，計算再生頻率。再生頻率＝再生苗數(shù)量／愈傷組織總數(shù)。

將花苞用自來水沖洗10 min，去除最外層花苞，同時去除花朵，只留花梗。用75%酒精浸泡花梗30 s，無菌水沖洗兩次，2%次氯酸鈉浸泡10 min，無菌水沖洗兩次，后用無菌濾紙吸干多余水分。將花梗切碎放入盛有25 mL誘導培養(yǎng)基（MS＋1.8 mg／L 2，4-D＋2.0 mg／L甘氨酸＋700 mg／L脯氨酸＋1.0 g／L干酪素水解物＋30 g／L蔗糖＋8 g／L瓊脂）的培養(yǎng)皿（直徑為9 cm）中，每品種接種20皿，置于黑暗、25℃下培養(yǎng)。

2 結(jié)果與分析

2.1 洋蔥花梗愈傷組織誘導分析

切碎的花梗培養(yǎng)3～4 d后，兩端開始形成愈傷組織并逐步生長變大，顏色呈淡黃色（圖1A）。待其長至米粒大小時轉(zhuǎn)入新培養(yǎng)基中進行繼代培養(yǎng)，8個品種不受基因型影響，均能誘導出愈傷組織，誘導率為100%（圖1B）。

2.2 洋蔥愈傷組織再生苗誘導分析

由表2可以看出，8個品種中1803再生頻率最高，達30%，其它品種不足10%；1833、1864和1868的愈傷組織未誘導成苗，呈白灰色、發(fā)軟，未見新根誘導及生長跡象。因此，洋蔥再生頻率與愈傷組織外植體基因型有關(guān)。

經(jīng)誘導，洋蔥愈傷組織開始生根，但不同品種間生根快慢和多少存在差異。培養(yǎng)60 d后，大部分愈傷組織呈干枯狀（圖2A、2B）；較大的愈傷組織上綠色原基開始突出，慢慢長出畸形管狀葉（圖2B、2C），隨后萌發(fā)出多個管狀葉，形成植株（圖2D）。洋蔥苗于鱗莖基部生根，長苗和生根同步進行，長出的根比原愈傷組織的粗壯、長且長速快（圖2E、2F）。

表2 洋蔥愈傷組織再生苗數(shù)統(tǒng)計

2.3 洋蔥愈傷組織再生苗移栽結(jié)果

誘導洋蔥苗移栽后的生長情況如圖3所示，移栽成活率為90%。但葉片過細和數(shù)量少時不宜移栽，可在組培瓶中多生長一段時間。

時值冬季，天氣逐漸寒冷，寶寶稍不注意“小肚子”就會著涼，尤其是年齡較小的寶寶，拉起肚子來往往讓寶媽們措手不及又心疼不已。

3 討論與結(jié)論

目前，國內(nèi)外少有采用洋蔥花梗作為外植體進行愈傷組織誘導的報道，大部分研究集中于種子、成熟胚、莖尖等外植體，而在園藝花卉植物中利用花梗進行愈傷誘導較為普遍。鐘瑞潔［10］對‘新發(fā)中秋花’萱草進行組織培養(yǎng)研究發(fā)現(xiàn)，其幼嫩花梗分蘗結(jié)節(jié)處為最適宜外植體。張夢迪［11］以朱頂紅‘Blossom Peacock’和‘Royal Velvet’花梗為外植體進行試驗，發(fā)現(xiàn)其在光照、培養(yǎng)基為MS＋0.5 mg／L萘乙酸（NAA）＋2.0 mg／L噻苯隆（TDZ）上的愈傷誘導率分別達到37.50%、29.17%。陳菁玨［12］認為花梗是石蒜花愈傷誘導的最佳外植體。張杰等［13］也認為百合花器官中花絲易誘導形成愈傷組織，花梗易誘導成不定芽?；诖?，本研究對8個洋蔥品種花梗進行愈傷誘導，發(fā)現(xiàn)其均能形成愈傷組織，誘導率高達100%?；ü楣麑嵒蚍N子提供營養(yǎng)的必經(jīng)通道，運輸營養(yǎng)物質(zhì)和代謝激素，尤其是離體培養(yǎng)后相關(guān)基因調(diào)控激素代謝表達。Fu等［14］對番茄花梗脫落過程的研究發(fā)現(xiàn)，水解植物生長素結(jié)合物調(diào)節(jié)生長素濃度，SlILR1、5、6基因在花梗脫落中起關(guān)鍵作用。本試驗認為，將花梗放入培養(yǎng)基中培養(yǎng)，較長的花梗會在培養(yǎng)基中繼續(xù)生長，且花梗中存在調(diào)控生長相關(guān)激素，能夠促進愈傷萌發(fā)。

本研究中8個品種均能100%誘導形成愈傷組織，但3個品種未誘導成苗，僅1803品種再生頻率最高，為30%，其它4個品種的再生頻率非常低。本團隊前期研究發(fā)現(xiàn)，洋蔥其它外植體也能經(jīng)誘導形成愈傷，但在各種激素或無激素培養(yǎng)基上均未誘導成苗，且45 d后愈傷組織開始干枯、由淡黃變灰白色，50 d后枯死。本研究中愈傷組織生長較慢，因放假等原因超50 d未繼代處理，60 d后開始有綠色原基出現(xiàn)，2～3個月才有洋蔥苗長出，120 d后未誘導成苗的愈傷組織發(fā)軟或表面干枯。

研究發(fā)現(xiàn)，洋蔥胚芽（莖尖）誘導形成的愈傷組織在MS＋1.5 mg／L 6-BA＋2 mg／L甘氨酸和MS＋1 mg／L TDZ＋0.5 mg／L NAA＋7.5 mg／L AgNO3培 養(yǎng)基 上 再 生 頻 率 分 別 達78%［15］、82%［16］，在MS＋30 g／L蔗糖和BDS（改良B5培養(yǎng)基）＋30 g／L蔗糖培養(yǎng)基上再生頻率分別達到44%和80%［17，18］。本研究中洋蔥花梗愈傷組織在無激素培養(yǎng)基上能夠誘導再生苗，再生頻率為30%。另有研究發(fā)現(xiàn)，低溫處理改變水稻花藥壁的多糖和蛋白質(zhì)組成，并增加花粉的繁殖力和愈傷組織的誘導率；低溫預培養(yǎng)提高了雪蓮愈傷組織的存活率和再生能力［19，20］。洋蔥苗生長發(fā)芽以及春化均需要較低的溫度，低溫可能會促進其愈傷再生頻率，下一步將研究低溫處理是否有利于洋蔥再生頻率的提高。