周 黎，鄭元義，王志剛，徐金順

(1.重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院超聲科，重慶 400010；2.重慶醫(yī)科大學(xué)超聲影像學(xué)研究所，重慶 400010；3.上海交通大學(xué)附屬第六人民醫(yī)院超聲醫(yī)學(xué)科，上海 200233；4.四川大學(xué)華西醫(yī)院超聲科，四川 成都 610041)

微波消融為局部熱消融技術(shù)之一，能在相對較短時間內(nèi)使組織溫度升高而發(fā)生凝固變性壞死，最終滅活腫瘤細胞或根除腫瘤。經(jīng)皮微波消融是安全、微創(chuàng)、療效確切的非手術(shù)治療腫瘤方法[1-2]，但消融過程中腫瘤組織形成的氣化區(qū)易引起消融漏空，導(dǎo)致腫瘤殘留，且可能對毗鄰正常組織產(chǎn)生過熱損傷，消融后腫瘤復(fù)發(fā)率仍較高。為確保熱消融臨床治療效果，實現(xiàn)一次性臨床滅活腫瘤，明確腫瘤消融安全邊界是其中關(guān)鍵。超聲造影對于動態(tài)識別腫瘤壞死區(qū)和非壞死區(qū)、即時評價消融治療效果、術(shù)后評估組織凝固壞死及腫瘤殘留情況等具有重要臨床價值[3-5]。本研究擬制備包裹液態(tài)全氟化碳的溫敏型脂質(zhì)納米粒(heat-sensitive lipid nanoparticle, HLNP)超聲造影劑，并觀察其評估微波消融邊界的效果。

1 材料與方法

1.1 主要材料與設(shè)備 主要材料包括二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(distearoyl-phosphatidylethanolamine, DSPE)、二棕櫚酰磷脂酰甘油(diphosphatidylglycerol, DPPG)、二棕櫚酰磷脂酰膽堿(dipalmitoylphosphatidylcholine, DPPC)、全氟戊烷(perfluoropentane，PFP)、膽固醇、氯仿(CHCl3)、pH為7.4的磷酸鹽緩沖液(phosphate buffer solution, PBS)及瓊脂糖粉。所用設(shè)備包括多功能微波治療儀(南京億高公司，ECO-100，功率可調(diào)10～80 W)，冷循環(huán)微波針(EO100C 2450 MHz，18G)，激光粒徑測量儀(Malvern公司)，Esaote MyLab90超聲診斷儀。

1.2 制備HLNP 將DSPE、DPPG、DPPC和膽固醇的混合物10 mg溶于含有5 ml氯仿的燒杯中，用封口膜封口，磁力攪拌至透明溶液，利用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器旋蒸形成脂質(zhì)薄膜，而后加入2 ml PBS水合至薄膜完全溶解；以超聲波破碎儀在冰浴條件下乳化溶液，并在乳化過程中緩慢滴注200l PFP，最后經(jīng)過離心洗滌形成包裹PFP的HLNP，貯存于4℃冰箱內(nèi)。在光學(xué)顯微鏡下觀察納米粒大小、分布及外觀等情況，采用激光粒徑儀測量其粒徑。

1.3 HLNP體外熱相變實驗 用去離子10倍水稀釋HLNP，取其中1滴置于載玻片上，蓋上蓋玻片放入加熱板中持續(xù)加熱；以倒置顯微鏡實時觀察HLNP熱相變進程，記錄HLNP開始出現(xiàn)熱相變時的溫度值。

1.4 微波加熱含HLNP凝膠模型實驗 按1%V/V將瓊脂糖粉溶于雙蒸水，加熱至瓊脂糖完全溶解后冷卻，制成瓊脂糖凝膠孔洞模型。以含HLNP凝膠模型為實驗組，單純脂質(zhì)懸液凝膠模型為對照組，于超聲實時引導(dǎo)下將冷循環(huán)微波消融針沿孔洞垂直方向穿入凝膠模型內(nèi)，微波針尖位置作為0點，在距離針尖2.5、3.5、4.5、5.5 cm的4個孔洞中分別加入等量HLNP，以微波治療儀(消融功率設(shè)定為60 W，消融時間為3 min)加熱凝膠模型，同時利用超聲診斷儀實時觀察凝膠孔洞模型中HLNP的超聲回聲變化情況，得到加熱前后凝膠模型中納米粒的二維超聲聲像圖。

1.5 HLNP評估微波消融離體牛肝邊界效果觀察 將復(fù)溫、脫氣后的新鮮離體牛肝切成6 cm×3 cm×3 cm塊狀備用。于超聲引導(dǎo)下將冷循環(huán)微波刀沿側(cè)面插入牛肝組織，利用超聲診斷儀實時定位并錨記穿刺點，確定納米粒進針部位，擬定微波消融中心為0點，在距消融中心2.5 cm處沿垂直于肝表面方向局部注射納米粒，并以60 W微波消融牛肝3 min，超聲實時觀察離體牛肝與納米粒在微波消融作用下的聲像圖變化。而后切開牛肝，觀察注入HLNP處及微波消融處牛肝大體變化，并對牛肝組織進行HE染色，觀察其病理學(xué)改變。對照組以脂質(zhì)懸液代替HLNP。

2 結(jié)果

2.1 HLNP一般理化特性 納米粒外觀呈乳白色混懸液，光學(xué)顯微鏡下納米粒大小均一，分布較均勻，分散度較好(圖1)。HLNP可于4℃條件下保持穩(wěn)定狀態(tài)3天，平均粒徑(507.90±101.70)nm(圖2)。

圖1 光鏡下觀察包裹PFP的HLNP(×400) 圖2 HLNP粒徑分布圖 (強度指某粒徑納米粒所占體積百分比)

2.2 體外HLNP熱相變 加熱板溫度達到45℃時開始出現(xiàn)納米粒相變所產(chǎn)生的微氣泡，且微氣泡直徑和數(shù)量逐漸增多，加熱至50℃ 1 min后產(chǎn)生大量氣泡。見圖3。

圖3 光鏡下觀察HLNP熱相變 A.加熱45℃時HLNP開始出現(xiàn)熱相變(×400)；B.50℃加熱1 min后產(chǎn)生大量氣泡(×400)

2.3 超聲觀察微波加熱凝膠模型 微波加熱前，二維超聲顯示HLNP組和對照組均為以無回聲為主, 伴周圍環(huán)狀稍高回聲。微波消融針加熱后，HLNP組距離微波消融針較近2個孔洞較輻照前回聲強度明顯增強，呈密集高回聲，距離微波消融針較遠2個孔洞較輻照前回聲強度也有所增強，周圍呈明顯高回聲；對照組4個孔洞超聲回聲強度較輻照前未見明顯改變。見圖4。

圖4 HLNP組凝膠模型及對照組體外超聲顯像 A、B.HLNP組微波加熱前(A)及加熱后(B)二維超聲聲像圖；C、D.對照組微波加熱前(C)及加熱后(D)二維超聲聲像圖；E.微波加熱含HLNP凝膠模型示意圖

2.4 微波消融含HLNP離體牛肝 隨著溫度升高，消融區(qū)牛肝產(chǎn)生明顯氣化區(qū)，注入HLNP納米粒處牛肝由弱回聲逐漸變?yōu)楦呋芈暎罱K表現(xiàn)為強回聲后方伴聲影，形成明顯氣化區(qū)，切開牛肝組織肉眼觀察發(fā)現(xiàn)該處肝組織由紅色變?yōu)榘咨?。對照組僅消融區(qū)域牛肝產(chǎn)生氣化區(qū)，注入脂質(zhì)懸液處牛肝回聲及大體組織表現(xiàn)未見明顯變化(圖5)。對HLNP組變?yōu)榘咨珔^(qū)域組織行HE染色，光學(xué)顯微鏡下見牛肝細胞出現(xiàn)點狀壞死及脂肪變性(圖6)。

圖5 HLNP組和對照組微波消融離體牛肝效果 A～C.HLNP組微波消融離體牛肝前(A)、消融過程中(B)及消融后(C)超聲聲像圖；D.HLNP組微波消融牛肝及注入HLNP處牛肝大體變化；E～G.對照組微波消融離體牛肝前(E)、消融過程中(F)及消融后(G)超聲聲像圖；H.微波消融對照組牛肝及注入脂質(zhì)懸液處牛肝大體變化 (紅圈示消融位置)

圖6 HLNP組微波消融后牛肝組織病理圖示肝細胞出現(xiàn)點狀壞死(A, HE，×200，箭)及脂肪變性(B，HE，×100，箭)

3 討論

腫瘤局部熱消融技術(shù)包括射頻消融、微波消融、激光治療及高強度聚焦超聲(high intensity focus ultrasound，HIFU)等[6]，主要原理是利用多種形式的物理方法將組織加熱到一定溫度，使其發(fā)生凝固性壞死，最終達到徹底殺滅癌細胞的目的；其中微波消融技術(shù)因升溫速度快、加熱效率高、消融時間較短且消融范圍大及凝固性壞死徹底等優(yōu)點而展現(xiàn)出較大優(yōu)勢[7-8]。臨床較常使用的微波頻率為2 450 MHz，消融能量較高，易于集中，但消融深度不足，且腫瘤形態(tài)不規(guī)則時，微波消融熱能分布不甚均勻；另外，腫瘤周圍的“血池效應(yīng)”亦影響微波消融熱場的分布[9]，使鄰近血管的腫瘤組織可能出現(xiàn)溫度過冷區(qū)，未達消融溫度而不能發(fā)生凝固性壞死，導(dǎo)致癌細胞殘留。因此，如何完全消融腫瘤，同時避免損傷鄰近膽囊、膽管、膈肌、腎臟或血管等重要臟器，是保證熱消融治療效果的關(guān)鍵，也是評價療效時備受關(guān)注的問題。

本實驗所用PFP屬于液態(tài)全氟化碳化合物中的一種，其在大氣壓下的沸點是29℃，在加熱、超聲、激光等作用下易受到激發(fā)而產(chǎn)生液氣相轉(zhuǎn)變[10-11]。本實驗中HLNP在加熱板作用下產(chǎn)生大量氣泡，間接證實HLNP能發(fā)生液氣相轉(zhuǎn)變。另外，在微波熱效應(yīng)作用下，距離微波消融中心越近的凝膠孔洞模型超聲顯影效果越明顯，而對照組回聲未見明顯改變，說明納米粒能通過微波熱能傳遞達到相變溫度發(fā)生液氣相轉(zhuǎn)變，且凝膠孔洞中納米粒超聲增強顯像特征可作為評估微波消融邊界的潛在指標(biāo)，為離體牛肝實驗奠定了基礎(chǔ)。

微波消融離體牛肝實驗結(jié)果顯示，利用60 W、180 s的微波消融參數(shù)所產(chǎn)生的凝固灶縱徑約為3 cm，故在距離消融凝固灶縱徑邊界約1 cm處牛肝內(nèi)注入納米粒，模擬腫塊微波消融凝固灶與毗鄰重要組織臟器的界限，且避開微波消融產(chǎn)生的氣化區(qū)，以利于實時觀察鄰近重要組織器官一側(cè)的離體牛肝注入納米粒后在微波消融作用下產(chǎn)生的效果。既往有學(xué)者[12]采用聚乳酸-羥基乙酸共聚物(poly-lactic-co-glycolic acid，PLGA)殼材包裹液態(tài)全氟化碳制備的納米?？赏ㄟ^加熱發(fā)生液氣相變，并可通過超聲實時顯像確認(rèn)腫瘤消融邊界。已有研究[13]證實包裹PFP的納米粒能在微波消融作用下發(fā)生相變，同時增強微波消融效果。本實驗通過超聲實時監(jiān)測發(fā)現(xiàn)距消融凝固灶邊緣約1 cm處注入HLNP的牛肝經(jīng)過微波消融產(chǎn)生明顯氣化區(qū)，超聲可見該處回聲由弱逐漸增強的變化過程；牛肝組織大體顏色由紅色變?yōu)榘咨?，且光鏡下觀察發(fā)現(xiàn)該處牛肝細胞有明顯點狀壞死和脂肪變性。上述結(jié)果表明，HLNP受到微波熱效應(yīng)傳遞的影響后發(fā)生液氣相變，使得消融區(qū)與鄰近正常組織之間的對比度增加，在微波消融氣化區(qū)周圍注入納米粒的牛肝處形成明顯氣化區(qū)，有助于通過觀察超聲變化和大體變化，以識別微波消融灶與周圍組織的界限；注入納米粒處牛肝超聲回聲明顯增強提示微波消融達到安全邊界，有利于避免損傷鄰近組織，最大程度地消融腫瘤，減少腫瘤殘留和復(fù)發(fā)；同時可根據(jù)腫瘤與周圍組織臟器的距離設(shè)定納米粒與微波消融氣化區(qū)的距離。既往文獻[14]報道，正常組織細胞的溫度安全界限為(45±1)℃，本研究中HLNP的相變溫度與之相近，提示HLNP不僅有助于評估腫瘤消融邊界，還能使微波消融在最大限度殺傷腫瘤組織的同時保護周圍組織臟器不受損傷，尤其對于特殊位置的腫瘤，如鄰近肝門、膽管、下腔靜脈等重要血管、臟器者。

綜上所述，HLNP有望成為用于評估微波消融邊界的熱敏劑，結(jié)合超聲成像實時監(jiān)控微波消融效果能提高微波消融的可控性和安全性。