魏金鵬，趙長江，張玉先，張海燕，任春元，于高波

（黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)農(nóng)學(xué)院，大慶163319）

大豆是我國重要的糧食作物之一，含有人類所需的多種氨基酸，特別是亮氨酸、蘇氨酸、賴氨酸等，同時還富含多種維生素、不飽和脂肪酸以及微量元素，是人類非常理想的食品營養(yǎng)來源，因此具有非常高的營養(yǎng)價值[1]。除此之外，大豆含有的兩種有效成分——大豆異黃酮和大豆皂苷，具有廣泛的藥理作用和重要的藥用價值。因此，大豆的遺傳研究一直受到廣泛的重視。

作物的株高是重要的農(nóng)藝性狀之一，也是作物研究領(lǐng)域受到廣泛關(guān)注的性狀之一，為數(shù)量性狀，其表型受到多個基因的共同調(diào)控[2]。前人的研究結(jié)果顯示，大豆株高對產(chǎn)量、莢數(shù)、倒伏性等影響較大，同時，株高本身也受到節(jié)間長、節(jié)數(shù)等性狀的調(diào)節(jié)，因此其成為大豆育種工作中育種家重點研究的性狀之一[3-4]。在研究過程中人們發(fā)現(xiàn)，適當(dāng)?shù)慕档痛蠖怪旮?，不但能提高植株抗倒伏的能力，還能顯著提高大豆的產(chǎn)量[5-6]。早在上個世紀60 年代，美國大豆專家Cooper 教授就提出了矮桿和半矮桿大豆品種的生產(chǎn)種植理論，并利用當(dāng)時育成的矮桿和半矮桿品種獲得了當(dāng)時的大豆高產(chǎn)紀錄[7]。由此可見，對于大豆矮桿相關(guān)基因的定位和深入發(fā)掘是及其必要的。

目前在遺傳育種方面，國內(nèi)外對大豆株高的研究主要集中在相關(guān)QTL 定位和株高與產(chǎn)量的關(guān)系方面。張雅娟等[8]以重組自交系群體為研究材料，定位了10 個大豆株高相關(guān)的QTL 位點，這些位點分別具有上位性效應(yīng)和加性效應(yīng)，可解釋55.49%的表型變異。Assefa 等[9-10]利用四個大豆品種，通過全基因組關(guān)聯(lián)對農(nóng)藝性狀進行分析，最終鑒定到了多個與株高和節(jié)間數(shù)有關(guān)的候選位點，部分基因已經(jīng)在其他植物中被證實參與細胞伸長和植物的生殖生長。高利芳等[11]通過計算分析所收集到的株高相關(guān)QTL 信息進行，最終鑒定到了位于5 條染色體上的15 個株高相關(guān)的QTL，并篩選出了17 個與株高相關(guān)的候選基因。在矮桿基因挖掘方面開展的工作相對較少，Kilen[12-13]利用短節(jié)間突變體進行研究分析，其結(jié)果顯示大豆的矮桿性狀由單個基因sb1 所控制，且該基因為隱性基因，而陳恒鶴[14]的研究則顯示大豆的矮桿性狀是由多個基因共同作用的，包括1 對隱性的主效基因和多對修飾基因，閆昊等[15]的研究結(jié)果也證實了這一點，他們通過研究矮桿大豆品種吉密豆1 號與另外兩個品種的雜交后代株高數(shù)據(jù)，分析后發(fā)現(xiàn)以一對非完全顯性基因為主、多個數(shù)量基因為輔共同決定了大豆矮桿性狀的表現(xiàn)。另外有報道利用6 個隱性的大豆矮桿突變體進行研究發(fā)現(xiàn)，控制矮化的遺傳位點分別為df2、df3、df4、df5、df56、df7 和df8，但只有df2 和df5 被定位到了遺傳圖譜中。任秀慧[16]利用141 份大豆種質(zhì)資源及3 個重組自交系群體研究大豆矮稈基因，并將相關(guān)基因定位在SSR_3 與1248之間；Li 等利用突變體將矮桿基因GmDW1 定位到8號染色體上約460 kb 的區(qū)域[17]。截至目前在soybase數(shù)據(jù)庫中，與株高有關(guān)的QTL 已經(jīng)記錄了230 個，但與大豆植株矮桿直接相關(guān)的QTL 卻沒有記錄，這在一定程度上限制了相關(guān)育種工作的進程。

片段導(dǎo)入系（Segments Introgressed Lines，SILs）是指雜交后再經(jīng)過多次回交選育出來的一套材料，它的基本特征是絕大部分的染色體組成都與輪回親本完全相同，只在少數(shù)幾個甚至一個區(qū)間內(nèi)的染色體片段被非輪回親本（供體親本）所替代，也稱為導(dǎo)入系（Introgression Lines，ILs）或染色體代換系（Chromosome Segment Substitution Lines，CSSLs），含有特定基因時，又叫做近等基因系（Near Isogenic Lines，NILs）[18]。因此，它既能避免其他遺傳信息的干擾，又能使整個基因組的QTLs 分解為一個或幾個QTLs，對每個QTL 進行單獨的分析，從而使主效和微效QTL 都能被挖掘出來，以達到對QTL 的精確定位。片段導(dǎo)入系可以是針對某一特定的基因或性狀的導(dǎo)入，也可以非選擇性的導(dǎo)入供體親本的遺傳組分，目前第一種導(dǎo)入系應(yīng)用較多，大多數(shù)作物中構(gòu)建后一種導(dǎo)入系也越來越收到重視。

以導(dǎo)入系為材料研究基因定位已經(jīng)成為非常有效的分析方式，并且在水稻、玉米、番茄等作物中得到了廣泛應(yīng)用[19-23]。Matus 等[24]利用大麥的染色體導(dǎo)入系鑒定到了一些與麥芽糖含量以及農(nóng)藝性狀相關(guān)的基因位點，有趣的是，提供導(dǎo)入片段的供體親本的相關(guān)性狀表現(xiàn)卻較差；Yamamoto 等[25]通過將秈粳稻雜交后再回交構(gòu)建導(dǎo)入系，定位到了三個控制水稻抽穗期的QTL；Alpert 和Frary 等[26-27]以番茄為試驗材料，通過對栽培種與野生種的雜交再回交，建立了導(dǎo)入群體，并利用該群體發(fā)現(xiàn)了與果實重量相關(guān)的主效QTL，進一步通過構(gòu)建圖譜進行了精細定位，最終克隆出了該QTL。Casati 等[28]利用不同黃酮含量的玉米植株構(gòu)建了導(dǎo)入系并研究了紫外線照射下玉米相關(guān)基因表達的變化。

研究以攜帶矮桿基因型S 的片段導(dǎo)入系為研究對象，利用SSR 標記對其進行檢測，并對導(dǎo)入片段進行系統(tǒng)分析，對矮桿基因相關(guān)的分子標記位點進行了鑒定和分析，研究結(jié)果為大豆矮桿相關(guān)基因的研究以及矮桿品種的選育奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

研究的試驗材料為7 份片段導(dǎo)入系（SILs），這些導(dǎo)入系均帶有矮桿基因S（表1），導(dǎo)入系的輪回親本為美國早期大豆品種Harosoy，該品種具有抗性強、穩(wěn)定性好的特點，供體親本為多個具有優(yōu)異特性的大豆品種，經(jīng)6 代或6 代以上的回交培育而成。

1.2 SSR 分析

利用SSR 引物鑒定SILs 中導(dǎo)入片段分布的多態(tài)性。PCR 采用20 μL 的反應(yīng)體系，包括40 ng 基因組DNA，2 μL 10×buffer （含Mg2+），0.4 U Taq 酶，3 μmol 引物和1.5 μL dNTP（2 mmol·L-1），超純水補齊至20 μL。反應(yīng)程序為：95 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，47 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，35個循環(huán)；72 ℃延伸5 min。利用聚丙烯酰胺標準測序凝膠對PCR 產(chǎn)物電泳40 min，銀染顯影后記錄標記基因型（帶型）。

表1 矮桿片段導(dǎo)入系的系譜Table 1 Information and characters of 7 SILs in experiment

1.3 導(dǎo)入片段分析

對SSR 標記檢測結(jié)果進行觀察分析，以參試材料所顯示的條帶是否與Harosoy 一致為依據(jù)，判斷材料中是否含有導(dǎo)入片段。同時利用GGT32 軟件構(gòu)建圖示基因型。導(dǎo)入片段長度確定方法參考劉冠明等[29]的方法，SSR 標記位置信息均來自已發(fā)表的大豆整合連鎖圖譜[30]。

1.4 遺傳相似性分析

建立SSR 標記檢測結(jié)果的數(shù)據(jù)集，根據(jù)7 份片段導(dǎo)入系電泳顯示的結(jié)果，將有遷移條帶的標記為1，無遷移條帶的記為0，條帶缺失的標記為999。利用NTSYS-pc2.1 軟件進行相似系數(shù)計算及聚類分析，方法采用UPGMA。

1.5 基因定位分析

以SSR 標記檢測的結(jié)果為基礎(chǔ)，若多個片段導(dǎo)入系在同一個標記位點都檢測到了染色體片段的導(dǎo)入，則認為該位置存在相關(guān)基因或者說該位點與基因緊密關(guān)聯(lián)，用此標記位點來代替基因的位置，以實現(xiàn)對基因的定位。

2 結(jié)果與分析

2.1 多態(tài)性標記的分析

以Cregan 發(fā)表的大豆公共圖譜為基礎(chǔ)，從中均勻選擇分布在20 條染色體上的SSR 標記，最終選擇了共計471 個分子標記對全部參試材料進行檢測。結(jié)果顯示，478 個SSR 標記中有66 個標記檢測到了多態(tài)性（表2）。這些多態(tài)性標記分布在除A1 和E 以外的18 條染色體上，每條染色體包含1～8 個多態(tài)性標記，平均每條染色體含3.3 個。

表2 SSR 標記在染色體上的分布Table 2 Distribution of SSR markers on chromosomes

續(xù)表2 SSR 標記在染色體上的分布Continued table 2 Distribution of SSR markers on chromosomes

2.2 片段導(dǎo)入系與受體親本的相似性比較

根據(jù)SSR 標記電泳后的檢測結(jié)果可知，7 份SILs 與Harosoy 的相似程度都較高，相似系數(shù)為0.956 0～0.979 2（表3），說明所有片段導(dǎo)入系的遺傳背景都很一致。

表3 片段導(dǎo)入系與Harosoy 相似系數(shù)的比較Table 3 Comparison of similarity coefficient between SILs and recurrent parent

2.3 導(dǎo)入片段分析

利用上面篩選出的66 個SSR 多態(tài)性標記，對Harosoy 和矮桿片段導(dǎo)入系進行電泳檢測。結(jié)果顯示，全部標記共檢測出了100 個導(dǎo)入片段，其中64個為純合導(dǎo)入片段，36 個為雜合導(dǎo)入片段。矮桿導(dǎo)入系L71-1106 所含的導(dǎo)入片段數(shù)量最多，共有26 個，而L67-234 所含的導(dǎo)入片段最少，僅有7 個，平均每個矮桿片段導(dǎo)入系存在14.3 個片段的導(dǎo)入。矮桿導(dǎo)入系L72-1241 包含最多的純合導(dǎo)入片段，為18 個，而L67-234 所含的純合導(dǎo)入片段最少，只有4 個；矮桿導(dǎo)入系L71-1106 含有的雜合導(dǎo)入片段最多，達到20 個，而L72-1241 所含的雜合片段數(shù)量最少，只有1 個。全部導(dǎo)入片段的長度為0.17～15.50 cm，平均每個片段的長度為3.63 cm（表4，圖1）。

表4 SILs 中導(dǎo)入片段的數(shù)量和長度Table 4 Number and length of introgressed segments in SILs

圖1 各染色體中導(dǎo)入片段的所在位置Fig.1 Distribution of introgressed segments on chromosomes in SILs

全部導(dǎo)入片段分布在20 條染色體中的18 條上，D1a 和F 染色體上的導(dǎo)入片段都達到了14 個，D1a 染色體上純合片段和雜合片段分別為6 個和8個，F(xiàn) 染色體上的純合片段和雜合片段分別為9 個和5 個；G、D2 和D1b 染色體上分別含有13、12 和11個導(dǎo)入片段，A1 和E 兩條染色體上沒有發(fā)現(xiàn)外源片段的導(dǎo)入，剩余染色體上的導(dǎo)入片段數(shù)量為1～8 個。

2.4 片段導(dǎo)入系的聚類分析

利用分子標記的檢測結(jié)果對7 份矮桿片段導(dǎo)入系進行聚類，可以看出，片段導(dǎo)入系間的遺傳相似性都呈現(xiàn)出較高的水平。L67-234 與L67-225 相似系數(shù)最高，達到0.91，說明他們的遺傳背景最為相近；其次相似的依次分別是L72-1198、L72-1228、L72-1241 和L73-105，相似系數(shù)分別為0.85、0.80、0.73 和0.71，而L71-1106 與其他材料間的相似系數(shù)為0.63，相似程度相對較遠（圖2）。

圖2 7 份SILs 的聚類分析Fig.2 Clustering analysis of 7 SILs

2.5 矮桿基因S 定位分析

所有的7 份SIL 中都含有矮桿基因S，從材料的系譜中可以看出，所有SIL 的供體親本中均含有Higan，因此可以認為矮桿基因S 是由供體親本Higan所提供的。通過對每條染色體上的導(dǎo)入片段進行分析可知，在D1a 染色體的satt383（56.57 cm）位點處，7 份SILs 中有6 份材料都檢測到了導(dǎo)入片段，并且都為純合導(dǎo)入片段，同時在相鄰的satt267（57.34 cm）位點處，有4 份SILs 都檢測到了雜合導(dǎo)入片段；在D1b 染色體的sat_183（112.63 cm）位點處，有5 份SILs 都發(fā)現(xiàn)了純合的導(dǎo)入片段；在D2 染色體的sat_277（28.8 cm）位點處，有6 份SILs 都發(fā)現(xiàn)了純合的導(dǎo)入片段；而在F 染色體的sct_033（74.13 cm）～satt335（77.70 cm）之間也發(fā)現(xiàn)了成簇的導(dǎo)入片段，其中sct_033（74.13 cm）處檢測到2 個純合導(dǎo)入片段，sat_120（75.97 cm）處檢測到3 個純合和1 個雜合導(dǎo)入片段，在satt335（77.70 cm）位點處有3 個SILs 檢測到了2 個純合和1 個雜合導(dǎo)入片段。

因此，推斷D1a 染色體上的satt383（56.57 cm）～satt267 （57.34 cm） 區(qū) 間、D1b 染 色 體 的sat_183（112.63 cm）位點、D2 染色體的sat_277（28.8 cm）位點以及F 染色體的sct_033（74.13 cm）～satt335（77.70 cm）區(qū)間都與矮桿基因S 密切相關(guān)，及該基因有很大可能位于這些位點之中。

圖3 7 個帶有S 基因的SIL 在D1a、D1b、D2 和F 染色體上的導(dǎo)入片段分布Fig.3 Introgressed segments in 7 SILs with S on chromosomes D1a，D1b，D2 and F

3 討論

將基因片段導(dǎo)入受體親本是遺傳育種中的常見方法之一，對導(dǎo)入片段的有效分析將有利于提高育種效率。研究通過構(gòu)建圖示基因型對SILs 中的導(dǎo)入片段進行分析，共鑒定到100 個導(dǎo)入片段，其中純合導(dǎo)入片段有64 個，雜合導(dǎo)入片段為36 個，并且導(dǎo)入片段在除A1 和E 之外的18 條染色體上均有分布。對片段導(dǎo)入系的聚類分析說明，研究中的矮桿片段導(dǎo)入系之間的相似性水平較高。L67-234 與L67-225相似系數(shù)最高，遺傳背景最近，這與他們的選育過程相符，都是僅以Higan 作為供體親本，再與受體親本Harosoy 回交6 代選育而成，因此這兩份材料所檢測到的導(dǎo)入片段也是最少的，分別只有7 個和8 個。相對而言，其他材料的供體親本除了Higan 之外，都還含有另外一種或一種以上的供體親本，并且都經(jīng)歷了多次的雜交和回交選育過程，遺傳背景更為復(fù)雜，因此他們的相似程度略低一些，所檢測到的導(dǎo)入片段也就更多，分別為13～26 個，其中L71-1106 檢測到的導(dǎo)入片段最多，達到了26 個，這也就解釋了該片段導(dǎo)入系雖然供體親本不是最多的，但其與其他片段導(dǎo)入系的相似系數(shù)卻是最小的，只有0.63，與其他材料的相似程度相對較遠。從片段導(dǎo)入系與輪回親本的相似性比較以及聚類分析的結(jié)果都可以看出，不論是SILs 與輪回親本Harosoy 還是SILs 之間都存在較高的遺傳相似性，說明這套材料具有較為接近的遺傳背景，有利于進行基因挖掘方面的研究，定位的結(jié)果比較可靠。

在研究中，鑒定到了位于D1a 染色體上的與矮桿基因緊密相關(guān)的標記為點satt383（56.57 cm）～satt267（57.34 cm）區(qū)間，這與李元龍的研究結(jié)果相似，他利用大豆矮化短柄突變體進行研究，并將矮化相關(guān)的基因最終定位在到了D1a 染色體上的0.826～1.152 m 處[31]，此定位位置與研究結(jié)果有所不同，研究在該位置附近僅有1 個SIL 檢測到了外源片段的導(dǎo)入，這可能是所用實驗材料或標記密度不同所導(dǎo)致。另外，研究結(jié)果還發(fā)現(xiàn)F 染色體上的sct_033～satt335區(qū)間也與矮桿基因緊密相關(guān)，有4 個SILs 都檢測到了導(dǎo)入片段，結(jié)果與袁鷹等[32]的研究結(jié)論相似，他們以F2∶3 為研究群體，對控制矮稈性狀的隱性基因GmD1 進行分析；結(jié)果顯示該基因與9 個SSR 標記連 鎖， 分 別 是 satt527、satt166、sat_340、satt481、sat_150、sat_245、satt076、satt229 和 satt664。 其 中satt229 位于F 染色體上62.79 cm 處，與sct_033（74.13 cm）和satt335（77.70 cm）的位置都比較接近，這進一步證實了該區(qū)域附近確實存在與矮桿性狀相關(guān)的基因，在下一步的精細定位研究中可重點考慮。李趙博[33]利用具有矮化特性的大豆突變體材料Gmdwarf1 進行研究，結(jié)果顯示Gmdwarf1 的矮化性狀受到一對隱性的細胞核基因所控制，且該基因位于K 染色體上Satt417、Satt264 及Satt337 等3 個分子標記所在的周邊區(qū)域內(nèi)，矮化相關(guān)基因與Satt337 和Satt417 位點之間的遺傳距離都較接近，分別為12.8 cm和14.4 cm。研究中對Satt337 位點也進行了檢測，但并未檢測到外源導(dǎo)入片段，這可能與所用材料的不同有關(guān)。

此外，研究還發(fā)現(xiàn)了位于D1b 染色體的sat_183（112.63 cm） 位點和位于D2 染色體的sat_277（28.8 cm）位點都與矮桿基因S 密切相關(guān)，而這兩個位點在前人的矮桿基因定位研究中并未提及。我們對這兩個位點附近的基因分析后發(fā)現(xiàn)，與sat_183 相距21 kbp 的基因序列（Glyma.02g256800）編碼細胞色素P450 基因家族，該基因家族參與油菜素內(nèi)酯（BR）和赤霉素（GA）的合成調(diào)控，而植物體內(nèi)BR 和GA 缺失將表現(xiàn)為矮化表型；與sat_183 和sat_277 分別相距25 kbp 和15 kbp 的位置上，各存在一條基因序列（Glyma.02g256200 和Glyma.17g070300）編碼富含亮氨酸重復(fù)序列的受體蛋白激酶，同時含有絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶域，而具有同樣功能的BAK1 基因則可以導(dǎo)致植株變矮[34]；與sat_277 相距149 bp 的基因序列（Glyma.17g070500）具有編碼S-腺苷甲硫氨酸脫羧酶（SAMDC）的功能，該酶參與植物體內(nèi)多胺的形成，而多胺可調(diào)控植物對生長素和細胞分裂素的敏感性，SAMDC 功能缺失將導(dǎo)致植株變得矮小[35]。這些分析結(jié)論表明，在sat_183 和sat_277 兩個位點附近確實存在產(chǎn)生矮桿性狀的基因序列，進一步驗證了研究定位結(jié)果的可靠性。

研究的結(jié)果鑒定到了與前人研究一致的位點，說明了研究結(jié)果的可靠性，也證明了充分利用片段導(dǎo)入系進行基因定位研究是可行的，能夠進一步檢測到由于缺乏多態(tài)性而被忽略的標記位點，同時還發(fā)現(xiàn)了兩處之前未曾報道的新標記位點，這為矮桿基因的發(fā)掘研究提供了新的依據(jù)，今后可在此基礎(chǔ)上進行更加精細的定位，從而準確發(fā)掘到矮桿基因，為培育矮桿抗逆高產(chǎn)的大豆新品種奠定基礎(chǔ)。

4 結(jié)論

在研究的7 份矮桿SILs 中鑒定到了100 個導(dǎo)入片段，其中純合導(dǎo)入片段有64 個，雜合導(dǎo)入片段為36 個，主要分布在D1a、D1b、D2 和F 染色體上；L67-234 與L67-225 相似系數(shù)最高，遺傳背景最近，L71-1106 最遠；同時也在這四條染色體上發(fā)現(xiàn)了與矮桿基因S 緊密關(guān)聯(lián)的標記位點和區(qū)間，其中既有與前人研究一致的位點，也有新發(fā)現(xiàn)的位點，為進一步研究矮桿基因打下了基礎(chǔ)。