范博文，張俊瑩，趙長(zhǎng)江，李佐同

（黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)農(nóng)學(xué)院，大慶 163319）

猴頭菌（Hericium erinaceus）是我國(guó)珍貴的食藥兼用真菌[1]，屬于猴菇目、猴菇科、猴菇屬[2]。猴頭菌味道鮮美，營(yíng)養(yǎng)豐富，有“山珍猴頭、海味燕窩”之稱。在猴頭菌的栽培過程中，木屑為常規(guī)的栽培基質(zhì)。但隨著生產(chǎn)規(guī)模擴(kuò)大，以及人們對(duì)森林資源的重視。木屑資源緊張已成為限制食用菌產(chǎn)業(yè)發(fā)展的一大因素[3]。用玉米芯代替木屑栽培猴頭菌，一方面可以緩解木屑資源緊張問題，另一方面可以有效的利用農(nóng)業(yè)廢棄物。內(nèi)在菌絲胞外酶活性和外在基質(zhì)營(yíng)養(yǎng)組成是決定猴頭菌分解能力及產(chǎn)量的兩個(gè)重要因素[4-5]。趙占國(guó)[6]認(rèn)為葡萄糖作為營(yíng)養(yǎng)源最適合猴頭菌菌絲生長(zhǎng)。韓春華[7]研究發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)基質(zhì)中氮源的添加比例對(duì)食用菌產(chǎn)量具有一定的影響。并且氮源的添加比例可以改變食用菌子實(shí)體品質(zhì)[8]。King 等[9]現(xiàn)在胞外酶系統(tǒng)中，纖維素酶、淀粉酶、木質(zhì)素酶對(duì)分解基質(zhì)起到重要作用。Turner，Claydon 等[10-11]在研究中發(fā)現(xiàn)，食用菌分解胞外酶活性和產(chǎn)量具有相關(guān)性。李永江等[12]發(fā)現(xiàn)，食用菌大多數(shù)重要的農(nóng)藝性狀如菌絲生長(zhǎng)速度、酶活性、質(zhì)量以及產(chǎn)量等都是數(shù)量性狀，是由多個(gè)數(shù)量基因座位和環(huán)境控制。目前，對(duì)猴頭菌代替木屑栽培的研究主要集中于基質(zhì)添加種類和比例，而對(duì)代料基質(zhì)預(yù)處理方式的研究較少。通過對(duì)玉米芯基質(zhì)進(jìn)行預(yù)處理，探究不同預(yù)處理方式對(duì)猴頭菌生長(zhǎng)的影響，為農(nóng)業(yè)廢棄物栽培猴頭菌提供理論依據(jù)和技術(shù)指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

猴頭菌（Hericium erinaceus）菌種為“RT22”。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 母種制備

將馬鈴薯去皮稱200 g，切成1 cm3的正方體后。加入800 mL 蒸餾水中，煮至沸騰后保持30 min。用紗布將馬鈴薯濾汁濾出，加入20 g 葡萄糖和20 g 瓊脂，定容至1 000 mL。裝入試管中高壓滅菌，試管滅菌后制成斜面培養(yǎng)基，接種猴頭菌菌種。

1.2.2 原種制備

原種配方為：木屑80%、麥麩18%、石膏1%、蔗糖1%，物料含水量65%，原種配料裝袋后高溫滅菌，滅菌后接種猴頭菌母鐘。

1.2.3 玉米芯基質(zhì)栽培種制備

玉米芯栽培種配方為：玉米芯80%、麥麩18%、石膏1%、蔗糖1%，物料含水量65%。按四個(gè)處理（表1）稱取物料，裝袋后高溫滅菌，滅菌后接種猴頭菌原種，接種后將菌棒放入相對(duì)濕度60%、溫度25 ℃環(huán)境中培養(yǎng)，當(dāng)菌絲長(zhǎng)滿菌袋后作為玉米芯基質(zhì)栽培種。

1.2.4 出菇期管理

將猴頭菌玉米芯基質(zhì)栽培種放入相對(duì)濕度90%、溫度18 ℃的環(huán)境中培養(yǎng)，每天早晚通風(fēng)2 次，一次通風(fēng)0.5 h。當(dāng)猴頭菌子實(shí)體菌刺約0.5 cm 時(shí)，采收子實(shí)體。

表1 玉米芯基質(zhì)預(yù)處理方法Table1 Pretreatment of maize cob

1.3 指標(biāo)測(cè)定

1.3.1 猴頭菌生長(zhǎng)指標(biāo)測(cè)定

猴頭菌菌棒長(zhǎng)滿袋后測(cè)定長(zhǎng)滿袋天數(shù)和菌絲生長(zhǎng)速度指標(biāo)；采摘猴頭菌子實(shí)體后，測(cè)定子實(shí)體干重和生物學(xué)效率指標(biāo)。

1.3.2 玉米廢棄物培養(yǎng)料碳氮養(yǎng)分及胞外酶活性測(cè)定

玉米芯基質(zhì)的碳氮比需分別測(cè)定玉米芯基質(zhì)的總碳和全氮含量，總碳（TC）利用非分散型紅外線氣體分析儀測(cè)定[13]；全氮采用凱氏定氮法[14]測(cè)定。羧甲基纖維素酶、β-葡萄糖苷酶、半纖維素酶、淀粉酶、濾紙纖維素酶、過氧化物酶、漆酶活力利用紫外可見分光光度計(jì)（日立）U3900 測(cè)定[15-19]，羧甲基纖維素酶、β-葡萄糖苷酶、半纖維素酶在540 nm 波長(zhǎng)處測(cè)定光密度值；淀粉酶在520 nm 波長(zhǎng)處測(cè)定光密度值；濾紙纖維素酶在540 nm 波長(zhǎng)處測(cè)定光密度值；漆酶在600 nm 波長(zhǎng)處測(cè)定光密度值。

1.4 數(shù)據(jù)分析

通過Excel 2016 對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行整理，GraphPad Prism 5 對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，文中數(shù)據(jù)均有3 次或3 次以上重復(fù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同預(yù)處理方式對(duì)形態(tài)指標(biāo)的影響

2.1.1 不同預(yù)處理方式對(duì)菌絲生長(zhǎng)速率的影響

菌絲生長(zhǎng)速度反應(yīng)菌絲生長(zhǎng)快慢及長(zhǎng)勢(shì)強(qiáng)弱。如圖1 所示，在不同基質(zhì)預(yù)處理中，B 處理的菌絲生長(zhǎng)速度顯著高于其他處理（P＜0.05），與S 處理、F 處理、T 處理相比分別提高13.31%、9.58%、7.33%；T 處理的菌絲生長(zhǎng)速度與F 處理差異不顯著（P＜0.05）；F處理的菌絲生長(zhǎng)速度與S 處理差異不顯著（P＜0.05）；T 處理的菌絲生長(zhǎng)速度顯著高于S 處理（P＜0.05），提高了5.57%。

圖1 不同預(yù)處理方式對(duì)菌絲生長(zhǎng)速率的影響Fig.1 Effect of different pretreatment methods on mycelium growth rate

2.1.2 不同預(yù)處理方式對(duì)菌絲長(zhǎng)滿袋天數(shù)的影響

菌絲長(zhǎng)滿袋天數(shù)反應(yīng)菌絲長(zhǎng)滿培養(yǎng)基質(zhì)的時(shí)間。如圖2 所示，在不同基質(zhì)預(yù)處理中，S 處理的菌袋長(zhǎng)滿袋天數(shù)為45.33 d，顯著高于T 處理和B 處理（P＜0.05），分別提高了6.25%、13.96%；S 處理的菌袋長(zhǎng)滿袋天數(shù)與F 處理差異不顯著（P＜0.05）；F 處理的菌袋長(zhǎng)滿袋天數(shù)為43.56 d，與T 處理、B 處理差異不顯著（P＜0.05）；T 處理的菌袋長(zhǎng)滿袋天數(shù)為42.67 d，與B 處理差異不顯著（P＜0.05）。

圖2 不同預(yù)處理方式對(duì)菌絲長(zhǎng)滿袋天數(shù)的影響Fig.2 The effect of different pretreatment methods on the days of mycelium filling

2.1.3 不同預(yù)處理方式對(duì)子實(shí)體干重的影響

干重反應(yīng)樣品干物質(zhì)重量。如圖3 所示，在不同基質(zhì)預(yù)處理中，F(xiàn) 處理和B 處理的子實(shí)體干重分別為21.96 g 和21.86 g，其中F 處理顯著高于S 處理（P＜0.05），提高19.68%；B 處理顯著高于S 處理（P＜0.05），提高19.15%；T 處理的子實(shí)體干重為19.14 g，與F 處理、B 處理相比差異不顯著（P＜0.05）；S 處理的子實(shí)體干重為18.35 g，與T 處理相比差異不顯著（P＜0.05）。

2.1.4 不同預(yù)處理方式對(duì)子實(shí)體生物學(xué)效率的影響

生物學(xué)效率反應(yīng)樣品的轉(zhuǎn)化率。如圖4 所示，在不同基質(zhì)預(yù)處理中，B 處理的生物學(xué)效率為0.51，顯著高于T 處理（P＜0.05），提高38.92%；F 處理的生物學(xué)效率為0.51，顯著高于T 處理（P＜0.05），提高39.52%；S 處理的生物學(xué)效率為0.42，與B 處理、F 處理差異不顯著（P＜0.05）；T 處理的生物學(xué)效率為0.37，與S 處理差異不顯著（P＜0.05）。

圖3 不同預(yù)處理方式對(duì)子實(shí)體干重的影響Fig.3 Effect of different pretreatment methods on dry weight of sub body

圖4 不同預(yù)處理方式對(duì)生物學(xué)效率的影響Fig.4 Effects of different pretreatment methods on biological efficiency

2.2 不同預(yù)處理方式對(duì)胞外酶活性的影響

2.2.1 不同預(yù)處理方式對(duì)纖維酶活性的影響

纖維素酶表征了纖維素酶的活力。如圖5 所示，不同玉米芯基質(zhì)預(yù)處理中，猴頭菌菌絲分泌羧甲基纖維素酶影響較大。其中，B 處理的羧甲基纖維素酶最高，顯著高于S 處理（P＜0.05），提高了44.2%，與F處理和T 處理差異不顯著（P＜0.05）；F 處理與T 處理、S 處理差異不顯著（P＜0.05）；T 處理和S 處理之間的差異并不顯著（P＜0.05）。不同基質(zhì)預(yù)處理對(duì)濾紙纖維素酶有較大的影響。其中S 處理的濾紙纖維素酶最高，顯著高于T 處理（P＜0.05），提高了21.88%，與F 處理和B 處理差異不顯著（P＜0.05）；F 處理與T 處理、B 處理差異不顯著（P＜0.05）；T 處理和B 處理之間差異不顯著（P＜0.05）。不同基質(zhì)預(yù)處理對(duì)猴頭菌菌絲分泌β-葡萄糖苷酶影響較大。其中，T 處理的β-葡萄糖苷酶最高，顯著高于F 處理（P＜0.05），提高了33.42%，與S 處理和B 處理差異不顯著（P＜0.05）；B處理與S 處理、F 處理差異不顯著（P＜0.05）；S 處理和F 處理之間差異并不顯著（P＜0.05）。

2.2.2 不同預(yù)處理方式對(duì)淀粉酶和半纖維素酶活性的影響

淀粉酶是指一類能催化分解淀粉（包括糖原、糊精等）的糖苷鍵的酶之總稱；半纖維素酶是能將構(gòu)成植物細(xì)胞膜的多糖類（纖維素和果膠物質(zhì)除外）加水分解的各種酶總稱。如圖6-A 所示，不同基質(zhì)預(yù)處理對(duì)猴頭菌菌絲分泌淀粉酶的影響較大。T 處理的淀粉酶含量0.14，F(xiàn) 處理的淀粉酶含量0.12。其中T 處理的淀粉酶含量最高，顯著高于S 處理（P＜0.05），相比提高了40%；S 處理的淀粉酶含量最低，但與F 處理和B處理相比差異不顯著（P＜0.05）；F 處理和B 處理之間相比差異不顯著（P＜0.05）。如圖6-B 所示，不同基質(zhì)預(yù)處理對(duì)猴頭菌菌絲分泌半纖維酶的影響較大。其中F 處理的半纖維酶含量為3.23，B 處理的半纖維酶含量為3.2，F(xiàn) 處理的半纖維酶含量顯著高于T 處理（P＜0.05）；B 處理的半纖維酶含量顯著高于T 處理（P＜0.05）；F 處理和B 處理之間相比差異不顯著（P＜0.05）。

圖5 不同預(yù)處理方式對(duì)纖維素酶活性的影響Fig.5 Effect of treatments on cellulase activity of H.erinaceus

圖6 不同預(yù)處理方式對(duì)淀粉酶（A）和半纖維素酶（B）活性的影響Fig.6 Effect of different pretreatment methods on the activity of amylase and hemicellulase

2.2.3 不同預(yù)處理方式對(duì)木質(zhì)素酶活性的影響

木質(zhì)素酶對(duì)木質(zhì)素具有很強(qiáng)的降解能力。如圖7-A 所示，不同基質(zhì)預(yù)處理對(duì)猴頭菌菌絲分泌過氧化物酶的影響較大。F 處理的過氧化物酶含量為0.14，B 處理的過氧化物酶含量為0.12，T 處理的過氧化物酶含量為0.09。F 處理的過氧化物酶含量最高，顯著高于S 處理和T 處理（P＜0.05），分別提高了86.67%和33.34%；S 處理和T 處理之間的過氧化物酶含量差異不顯著；B 處理和F 處理的過氧化物酶含量差異不顯著。如圖7-B 所示，不同基質(zhì)預(yù)處理對(duì)猴頭菌菌絲分泌漆酶的影響較大。B 處理的漆酶含量為18.91，F(xiàn) 處理的漆酶含量為17.87，S 處理的漆酶含量為17.50。B 處理的漆酶含量最高，顯著高于S 處理和T 處理（P＜0.05），分別提高了8.05%和12.63%；S 處理和T 處理之間的漆酶含量差異不顯著；B 處理和F處理的漆酶含量差異不顯著。

圖7 不同預(yù)處理方式對(duì)木質(zhì)素酶活性的影響Fig.7 Effects of different pretreatment methods on the activity of lignin enzyme

2.2.4 胞外酶活性與菌絲生長(zhǎng)速度及子實(shí)體干重相關(guān)性分析

通過相關(guān)性分析將七種胞外酶活性同猴頭菌菌絲生長(zhǎng)速度和子實(shí)體干重進(jìn)行分析（表2），菌絲生長(zhǎng)速度與羧甲基纖維素酶、β-葡萄糖苷酶、半纖維素酶、淀粉酶、過氧化物酶、漆酶呈正相關(guān)，與濾紙纖維素酶呈負(fù)相關(guān)。其中，菌絲生長(zhǎng)速度與羧甲基纖維素酶的相關(guān)度最高，為0.858；與漆酶的活性次之，為0.675；與過氧化物酶的活性為0.418。子實(shí)體干重與羧甲基纖維素酶、濾紙纖維素酶、半纖維素酶、淀粉酶、過氧化物酶、漆酶呈正相關(guān)，與β-葡萄糖苷酶呈負(fù)相關(guān)。其中，子實(shí)體干重與過氧化物酶相關(guān)度最高，為0.965；與羧甲基纖維素酶的活性次之，為0.908；與漆酶的活性為0.733。七種胞外酶與菌絲生長(zhǎng)速度沒有顯著的相關(guān)性，但是七種胞外酶中的過氧化物酶與子實(shí)體干重顯著相關(guān)。在菌絲生長(zhǎng)速度和子實(shí)體干重中，過氧化物酶、漆酶和羧甲基纖維素酶的相關(guān)性較高。說(shuō)明過氧化物酶、漆酶和羧甲基纖維素酶對(duì)猴頭菌菌絲生長(zhǎng)速度和子實(shí)體干重影響較大。在三種纖維素酶中，菌絲生長(zhǎng)速度和子實(shí)體干重并不都與其呈正相關(guān)，說(shuō)明猴頭菌生長(zhǎng)是通過三種纖維素酶相互調(diào)節(jié)來(lái)影響的。

表2 胞外酶與菌絲生長(zhǎng)速度及子實(shí)體干重之間的相關(guān)性Table 2 Correlation between extracellular enzyme and mycelial growth rate and dry weight of fruiting body

3 討論

食用菌通過從基質(zhì)中吸收的營(yíng)養(yǎng)來(lái)用于自身的生長(zhǎng)發(fā)育。對(duì)栽培基質(zhì)進(jìn)行預(yù)處理，有利于菌絲對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收，更好地提高子實(shí)體的產(chǎn)量和品質(zhì)。以往對(duì)玉米芯基質(zhì)代替木屑栽培食用菌研究主要集中于添加玉米芯的比例，研究直接對(duì)玉米芯材料本身進(jìn)行處理，以提高玉米芯基質(zhì)的栽培效率。通過試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，不同玉米芯預(yù)處理方法對(duì)猴頭菌菌絲生長(zhǎng)速度、長(zhǎng)滿袋天數(shù)、干重和生物學(xué)效率都有較大影響。預(yù)處理改變了玉米芯基質(zhì)的理化性質(zhì)，將玉米芯中大分子的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)變成各種小分子的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，更有利于猴頭菌吸收和利用。T 處理和S 處理的原理都是對(duì)玉米芯進(jìn)行預(yù)濕，使其吸收水分后變得松軟，但二者的程度又不同。F 處理和B 處理是通過微生物對(duì)玉米芯進(jìn)行一定的降解，但二者微生物的來(lái)源又不同。郭亞萍等[20]研究發(fā)現(xiàn)，雙孢蘑菇堆肥過程優(yōu)勢(shì)類群為芽孢桿菌屬（Bacillus）、類芽孢桿菌屬（Paenibacillus）。猜測(cè)直接發(fā)酵處理和菌劑發(fā)酵處理過程中，這兩個(gè)菌屬也起到了主要的作用。在四種不同方法處理玉米芯基質(zhì)中，都能檢測(cè)到纖維素酶、半纖維素酶、淀粉酶和木質(zhì)素酶。在七種酶中，不同處理方法的酶活性差異性較大。但纖維素酶活性一直處于較高水平，猜測(cè)與纖維素酶活性相關(guān)的cel1、cel2、cel3基因起到了關(guān)鍵的作用[21]。玉米芯基質(zhì)中小分子營(yíng)養(yǎng)種類和含量變化，也會(huì)對(duì)酶活性有一定的影響。有研究表明用堿性物質(zhì)預(yù)處理稻草后將其作為栽培食用菌的基質(zhì)，發(fā)現(xiàn)食用菌對(duì)稻草的分解能力得到提升[22]。用微生物預(yù)處理小麥秸稈后，小麥秸稈的還原糖含量發(fā)生了變化[23]。

通過相關(guān)性分析將七種胞外酶活性同猴頭菌菌絲生長(zhǎng)速度和子實(shí)體干重進(jìn)行分析，菌絲生長(zhǎng)速度與羧甲基纖維素酶、β-葡萄糖苷酶、過氧化物酶、漆酶的活性相關(guān)性較高；子實(shí)體干重與羧甲基纖維素酶、淀粉酶、過氧化物酶、漆酶的活性相關(guān)性較高。在猴頭菌在營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)時(shí)期和生殖生長(zhǎng)時(shí)期，雖然胞外酶含量發(fā)生了變化，但羧甲基纖維素酶、過氧化物酶和漆酶的相關(guān)性一直都很高。因此，在兼顧子實(shí)體干重、菌絲生長(zhǎng)速度的同時(shí)，提出羧甲基纖維素酶、過氧化物酶、漆酶可以用于連鎖分析培養(yǎng)料的養(yǎng)分狀況與食用菌生長(zhǎng)狀況。

從碳氮比的角度分析（如表3），進(jìn)過預(yù)處理后玉米芯基質(zhì)的碳氮比有較大的差異。碳源營(yíng)養(yǎng)和氮源營(yíng)養(yǎng)比例對(duì)猴頭菌菌絲和子實(shí)體生長(zhǎng)起決定性作用。碳氮比較高，子實(shí)體形成困難；碳氮比較低，子實(shí)體原基生長(zhǎng)困難。在毛木耳（Auricularia polytricha）的研究中發(fā)現(xiàn)，碳氮比較低時(shí)，隨著碳氮比升高，毛木耳干重也會(huì)增加。但到達(dá)一定值后，隨著碳氮比升高，毛木耳干物質(zhì)干重反而降低[24]。秀珍菇（Pleurotus geesteranus）的菌絲和子實(shí)體對(duì)碳氮比環(huán)境的要求較寬泛，當(dāng)碳氮比在10～20∶1 時(shí)，秀珍菇菌絲生長(zhǎng)最適合；當(dāng)碳氮比在39.21～59.32∶1 時(shí)，秀珍菇子實(shí)體生長(zhǎng)最適合[25-26]。在試驗(yàn)中，處理S 和處理T 的碳氮相對(duì)較高，處理F 和處理B 的碳氮比相對(duì)較低。猜測(cè)微生物預(yù)處理可以降低基質(zhì)的碳氮比。碳氮比相對(duì)較低的處理F 和處理B，產(chǎn)量和菌絲生長(zhǎng)速度都較高。因此，當(dāng)玉米芯基質(zhì)碳氮比在32～41∶1 時(shí)，更適合猴頭菌的生長(zhǎng)。

表3 不同玉米芯基質(zhì)預(yù)處理后的碳氮比Table 3 Effect of maize cob on carbon and nitrogen ratio

4 結(jié)論

在供試的四種不同的玉米芯基質(zhì)預(yù)處理中，菌劑發(fā)酵處理可以提高菌絲生長(zhǎng)速度、子實(shí)體干重、生物學(xué)效率；縮短菌絲長(zhǎng)滿袋天數(shù)。在七種胞外酶中，羧甲基纖維素酶、濾紙纖維素酶、β-葡萄糖苷酶的活性、半纖維素酶、漆酶的活性較高；淀粉酶、過氧化物酶的活性較低。通過相關(guān)性分析，過氧化物酶、羧甲基纖維素酶和漆酶三種胞外酶與菌絲生長(zhǎng)速度及猴頭菌產(chǎn)量相關(guān)性較大。子實(shí)體產(chǎn)量最高的處理玉米芯基質(zhì)碳氮比在32～41∶1 之間。