張 浪，嚴(yán)福林，2，劉曉龍，王志威，任得強(qiáng)，黃久艷，魏升華，2▲

(1貴州中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院，貴州 貴陽 550000；2貴州醫(yī)科大學(xué) 藥用植物功效與利用國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州 貴陽 550000)

玄參是玄參科植物玄參ScrophularianingpoensisHemsl.的干燥根。其能清熱涼血，滋陰降火，解毒散結(jié)。功用于熱入營(yíng)血，溫毒發(fā)斑，熱病傷陰，舌絳煩渴，津傷便秘，骨蒸勞嗽，目赤，咽痛，白喉，瘰疬，癰腫瘡毒[1]等。

主要含環(huán)烯醚萜類成分，還含苯丙苷類化合物、揮發(fā)油、植物甾醇、生物堿、天門冬素、胡蘿卜素等[2-5]?，F(xiàn)代藥理研究發(fā)現(xiàn)具有解熱、鎮(zhèn)痛、抗炎、抗腫瘤、心肌作用、抗疲勞、降血糖等作用[6-10]。2015版《中國(guó)藥典》規(guī)定的方法為冬季莖葉枯萎時(shí)采挖，除去根莖、芽、須根及泥沙，曬或烘至半干，3～6 d，反復(fù)數(shù)次至干燥即可，《中國(guó)藥典》雖收載其加工方法，但并未做詳細(xì)的參數(shù)規(guī)定。據(jù)查閱文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)，玄參的產(chǎn)地加工方法主要有“發(fā)汗”、烘干、陰干、蒸切、煮切等[11-14]，目前尚沒有統(tǒng)一的產(chǎn)地加工標(biāo)準(zhǔn)，存在盲目性與隨意性，這造成了玄參藥材質(zhì)量的差異性，從而影響其臨床療效，為了提高玄參藥材的質(zhì)量，有必要進(jìn)行玄參的產(chǎn)地加工方法的優(yōu)選。本文對(duì)玄參32種不同加工方法進(jìn)行考察，以浸出物、哈巴苷、哈巴俄苷含量為評(píng)價(jià)指標(biāo)，采用綜合評(píng)分法優(yōu)選玄參的產(chǎn)地加工方法。

1 材料與方法

1.1 儀器

LC-2030CN型高效液相色譜儀、萬分之一分析天平(上海佑科儀器儀表有限公司 FA1004B)、十萬分之一分析天平(AUW120D)、千分之一天平(上海浦春計(jì)量?jī)x器有限公司JA2003)、DHG-9073B5電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱、恒溫水浴鍋(常州國(guó)華電器有限公司HH-6)、電爐、干燥器、錐形瓶、冷凝管、扁形稱量瓶、蒸發(fā)皿、石棉網(wǎng)、移液管。

1.2 試藥

哈巴苷對(duì)照品(H-021-161128)和哈巴俄苷對(duì)照品(H-020-170809)購(gòu)自成都瑞芬思生物科技有限公司；乙腈(20170621)、甲醇(20170502)和磷酸為色譜純，均購(gòu)自天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司。

1.3 產(chǎn)地加工方法

采用32種加工方法對(duì)樣品進(jìn)行處理，樣品編號(hào)及加工方法如下：玄參挖出后，以清水洗去泥沙，晾干外表面水分。處理方法見表1。

表1 不同加工方法(n=32)

2 結(jié)果與分析

2.1 水分、浸出物測(cè)定

取上述藥材樣品處理并過二號(hào)篩后備用，水分測(cè)定按照2015版《中國(guó)藥典》四部0832項(xiàng)下第二法烘干法進(jìn)行測(cè)定，以水熱浸方法測(cè)定玄參浸出物含量。取32個(gè)不同加工方法處理的玄參藥材，操作方法按2015版《中國(guó)藥典》四部2201項(xiàng)下水浸法進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果見表2。

表2 不同加工方法對(duì)玄參藥材中浸出物測(cè)定(n=3)

2.2 含量測(cè)定

2.2.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑：以乙腈為流動(dòng)相A，以0.03%磷酸溶液為流動(dòng)相B，進(jìn)行梯度洗脫(0～10min，3%～10%乙腈；10～20 min，10%～33%乙腈；20～25 min，33%～50%乙腈；25～30 min，50%～80%乙腈；30～35 min，80%乙腈；35～37min，80%～3%乙腈)；檢測(cè)波長(zhǎng)為210 nm。柱溫箱溫度30 ℃，理論塔板數(shù)按哈巴俄苷與哈巴苷峰計(jì)算均應(yīng)不低于5000。色譜圖見圖1。

A.對(duì)照品；B.供試品；1.哈巴苷；2.哈巴俄苷

2.2.2 對(duì)照品的制備

分別精密稱定哈巴苷對(duì)照品、哈巴俄苷對(duì)照品適量，加甲醇制成含哈巴苷0.04977 mg/mL、哈巴俄苷0.01599 mg/mL的混合對(duì)照品儲(chǔ)備溶液。

2.2.3 供試品的制備

取本品過40目篩的粉末約0.5 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入50%甲醇50 mL，密塞，稱定重量，浸泡1 h，超聲處理(功率500 W，頻率40 kHz)45 min，放冷，再稱定重量，用50%甲醇補(bǔ)足減失重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備

精密吸取“2.2.2”項(xiàng)下不同體積的對(duì)照品于10 mL定容瓶中定容，配制成一系列濃度的對(duì)照品混合溶液。在上述色譜條件下進(jìn)樣，測(cè)定各成分的峰面積。以濃度為X軸，峰面積為Y軸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，并計(jì)算出哈巴苷回歸方程Y=7×106X+3328.5，哈巴俄苷回歸方程Y=3×107X+2329.5，且哈巴苷和哈巴俄苷分別在0.0221～0.1327 mg/mL(r=0.9999)、0.0053～0.0320 mg/mL(r=0.9998)內(nèi)具有良好的線性關(guān)系，結(jié)果見表3。

表3 哈巴苷和哈巴俄苷的標(biāo)準(zhǔn)曲線(n=6)

2.2.5 精密度試驗(yàn)

精密吸取濃度分別為0.169 mg/mL、0.1599 mg/mL的哈巴苷、哈巴俄苷的混合對(duì)照品溶液，連續(xù)進(jìn)樣6次，每次20 μL，測(cè)定各對(duì)照品峰面積。計(jì)算兩種對(duì)照品峰面積的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)分別為0.18%、0.39%，表明儀器精密度良好。

2.2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn)

精密稱取樣品適量，按“2.2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，配制好后，連續(xù)進(jìn)樣6次，每次20 μL。分別測(cè)定樣品經(jīng)過0 h、3 h、6 h、9 h、12 h、24 h中哈巴苷與哈巴俄苷的變化，記錄結(jié)果。計(jì)算兩種供試品峰面積的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為1.90%、0.21%，結(jié)果表明供試品在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.2.7 重復(fù)性試驗(yàn)

稱取同一批藥材6份，每份約0.5 g，精密稱定，按“2.2.3”項(xiàng)下處理樣品，在上述色譜條件下，其哈巴苷和哈巴俄苷含量分別為2.0696 μg、0.5427 μg，RSD分別為1.56%、1.35%，結(jié)果表明重復(fù)性良好。

2.2.8 加樣回收率試驗(yàn)

稱取同一批的樣品藥材約0.25 g，平行6份，精密稱定，分別精密加入哈巴苷、哈巴俄苷如表4所示的量，按“2.2.3”項(xiàng)下供試品溶液的制備方法進(jìn)行制備，按上述色譜條件進(jìn)行測(cè)定。然后測(cè)定計(jì)算回收率，結(jié)果回收率均在95%至105%之內(nèi)，表明試驗(yàn)過程可靠，結(jié)果見表4。

表4 哈巴苷加樣回收實(shí)驗(yàn)結(jié)果(n=6)

2.2.9 樣品含量測(cè)定

精密吸取供試品溶液20 μL，注入液相色譜儀測(cè)定，根據(jù)線性回歸方程計(jì)算即得，結(jié)果見表5。

表5 哈巴苷及哈巴俄苷含量(n=32)

2.3 綜合評(píng)分法優(yōu)選最佳產(chǎn)地加工方法

本實(shí)驗(yàn)采用綜合分析法優(yōu)化玄參產(chǎn)地加工方法，以浸出物、哈巴苷和哈巴俄苷含量為指標(biāo)，以三個(gè)指標(biāo)越高越好。在數(shù)據(jù)處理時(shí)引用指標(biāo)隸屬度，即指標(biāo)隸屬度=(指標(biāo)最大值-指標(biāo)值)/(指標(biāo)最大值-指標(biāo)最小值)。根據(jù)各指標(biāo)在玄參中的重要性，考慮以浸出物占10%、哈巴苷占45%、哈巴俄苷占45%的權(quán)重，實(shí)驗(yàn)綜合評(píng)分=浸出物隸屬度×10%+哈巴苷占隸屬度×45%+哈巴俄苷隸屬度×45%，總分為1.00分。評(píng)分結(jié)果以綜合分?jǐn)?shù)作為總指標(biāo)進(jìn)行直觀分析，結(jié)果見表6。

表6 綜合評(píng)分

3 結(jié)論與討論

32種產(chǎn)地加工方法中，加工方法為陰干時(shí)，浸出物含量少于60%，其余均大于60%，32種方法中哈巴苷、哈巴俄苷總含量在0.84%～1.39%之間，符合《中國(guó)藥典》(2015版)標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定。綜合評(píng)分法優(yōu)選出最佳的產(chǎn)地加工方法為：直接發(fā)汗6 d，80 ℃烘干，浸出物含量為63.49%，哈巴苷含量為0.65%，哈巴俄苷含量為0.47%，綜合評(píng)分(0.6136)最高，表明其方法較好。

通過試驗(yàn)可知采取的產(chǎn)地加工方式不同對(duì)藥材的質(zhì)量影響極大，且是否采用“發(fā)汗”及“發(fā)汗”時(shí)間的長(zhǎng)短對(duì)玄參藥材的質(zhì)量也均有影響，如浸出物及化學(xué)含量方面，這為玄參藥材的產(chǎn)地加工提供了重要依據(jù)，同時(shí)間接表明了加工方法發(fā)汗對(duì)玄參藥材的加工影響極大。傳統(tǒng)認(rèn)為，玄參“發(fā)汗”加工的藥材質(zhì)量好，但通過成分分析只是其驗(yàn)證的一方面，還需進(jìn)行藥理、藥效等相關(guān)研究，來驗(yàn)證其“發(fā)汗”為玄參最適的產(chǎn)地加工方法。

中藥材的產(chǎn)地加工是保證藥材質(zhì)量的關(guān)鍵一步，產(chǎn)地初加工方式較多，其中干燥方式和干燥溫度的不同，會(huì)造成藥材質(zhì)量的差異明顯，干燥方式如陰干、曬干、烘干、“發(fā)汗”等，干燥方式不同，會(huì)造成質(zhì)量的差異；干燥溫度的把控十分重要，過高或過低都會(huì)使藥材質(zhì)量大打折扣。對(duì)中藥材的產(chǎn)地初加工方法的研究，更有利實(shí)現(xiàn)中藥“安全、有效、穩(wěn)定、可控”。