鄧代艷，王 歡，張勇民，董登祥▲

(1貴州中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院，貴州 貴陽 550025；2貴州威門藥業(yè)股份有限公司，貴州 貴陽 550018；3法國索邦大學(xué) 法國國家科研中心，巴黎 75005)

齊墩果酸(Oleanolicacid，OA，結(jié)構(gòu)式如圖1)是齊墩果烷型的五環(huán)三萜類化合物，又名慶四素，多以游離、與糖結(jié)合成苷的形式廣泛存在于自然界各類植物中，如女貞子、白花蛇舌草、大棗、枇杷葉、木瓜、青葉膽等[1-3]，齊墩果酸為白色結(jié)晶性粉末，無臭無味，分子式為C30H48O3。OA具有較多生理活性和藥理作用，主要有保肝、抗腫瘤、抗癌、抗?jié)?、抗HIV、抗炎等作用[4-10]。

圖1 齊墩果酸

目前OA在臨床上運(yùn)用的制劑種類較為單一，生物利用度不夠理想，其所具有的生物活性并未得到充分的開發(fā)利用，并存在著藥代動力學(xué)指標(biāo)未達(dá)到臨床標(biāo)準(zhǔn)，水溶性差等亟待解決的問題，影響了其在臨床上的應(yīng)用，發(fā)展新劑型和制備OA衍生物仍然是解決生物利用度低、增強(qiáng)臨床療效的重要途徑。因此，為了改善其藥代動力學(xué)性質(zhì)，以齊墩果酸為先導(dǎo)化合物進(jìn)行結(jié)構(gòu)修飾近些年逐漸成為研究熱點(diǎn)問題。García-Granados等[11]將齊墩果酸的C環(huán)轉(zhuǎn)化為環(huán)己二烯結(jié)構(gòu)，然后光照開環(huán)得到齊墩果酸的三烯衍生物，并且成功將齊墩果酸的C環(huán)斷裂，得到了以AB環(huán)和DE環(huán)為基本骨架的合成子。近年來，齊墩果酸構(gòu)效關(guān)系的衍生物研究主要是在其母核的3位羥基、12位碳的位雙鍵和28位羧基進(jìn)行結(jié)構(gòu)修飾，而活性研究表明具有對抗腫瘤、保護(hù)肝臟、抗炎癥等藥理作用，結(jié)果顯示部分齊墩果酸衍生物活性高于其母體化合物[12]。齊墩果酸連接不同的糖片段其生物活性也不同[13]，C-3羥基形成糖苷鍵可增強(qiáng)活性。糖類藥物生物活性較多，毒副作用小，而糖參與了人體生命幾乎全部過程，因此糖類藥物對于治療人類各種疾病具有廣闊的發(fā)展前景。已有大量研究表明，糖鏈對三萜類化合物的生物活性關(guān)系密切，糖鏈的改變可能對皂苷的活性產(chǎn)生較大影響。洪開文等[14]通過糖苷化對常春藤進(jìn)行結(jié)構(gòu)修飾后，得到的糖苷衍生物顯著的提高了常春藤的水溶性，同時(shí)增強(qiáng)了體外抗腫瘤細(xì)胞的活性。

本文以葡萄糖、半乳糖、巖藻糖為起始原料，對糖上羥基進(jìn)行保護(hù)與去保護(hù)，得到一系列的巖藻糖和二糖片段，通過對甲苯硫基和硫苷化途徑，利用合成的糖片段對齊墩果酸C-3位羥基進(jìn)行結(jié)構(gòu)修飾，獲得2個(gè)糖苷化衍生物。新化合物都經(jīng)MS、1H-NMR、13C-NMR進(jìn)行驗(yàn)證。采用MTT法，選用高表達(dá)人肺癌細(xì)胞(A549)對2～3進(jìn)行初步的體外抗腫瘤活性研究。本研究為今后齊墩果酸及其衍生藥物開發(fā)與應(yīng)用提供了依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

Heidolph-4000旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(CDCl3為溶劑，TMS為內(nèi)標(biāo))；INOVA-400核磁共振儀；WFH-203B三用紫外分析儀；MA110電子天平；SZ-93自動雙重水蒸餾器。

L-巖藻糖、D-半乳糖、D-葡萄糖，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；齊墩果酸對照品，純度≥99%，南京源植生物科技有限公司；齊墩果酸-28-羧甲酯(1)按文獻(xiàn)合成[14]；乙基-S-2，3，4-三-O-乙酰基-L-吡喃巖藻糖苷(a)，對甲基-苯基-S-(2，3，4，6-四-O-乙酰基-β-D-吡喃半乳糖基)-(1→4)-6-O-芐基-3-O-乙?；?2-去氧-2-鄰苯二甲酰亞胺基-β-D-吡喃葡萄糖苷(c)，實(shí)驗(yàn)室自制；吡啶，分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；CNCl3，化學(xué)純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；其余所用試劑均為分析純。體外抗A549活性租借科研樓實(shí)驗(yàn)中心細(xì)胞室進(jìn)行細(xì)胞篩選完成。

1.2 目標(biāo)化合物的合成(圖2)

圖2 目標(biāo)化合物的合成路線

(1)2的合成

稱取100 mg(0.29 mmol)化合物a和204 mg(0.42 mmol)化合物1于50 mL干燥圓底燒瓶中，加入一粒攪拌子，再加入130 mg NIS和50 mg 4? Ms，抽真空，并通入N2保護(hù)反應(yīng)體系。向圓底燒瓶中加入適量無水DCM(約10 mL)使其充分溶解，將反應(yīng)體系置于冰鹽浴條件下攪拌，平衡10 min后加入5 μL的TfOH，反應(yīng)一直在冰鹽浴中進(jìn)行，經(jīng)TLC檢測反應(yīng)完全(顯色劑為5%H2SO4-C2H5OH溶液，展開劑為Cy/EtOAc = 2∶1)。向反應(yīng)溶液中加入飽和NaS2O3溶液中和過多的NIS，淬滅反應(yīng)，至反應(yīng)液的顏色由紅色變?yōu)闊o色，再加入飽和NaHCO3溶液中和過多的TfOH，用DCM/H2O萃取反應(yīng)液，收集有機(jī)相層(下層)，用無水MgSO4干燥，過濾，減壓蒸去溶劑獲得粗產(chǎn)品，用硅膠柱層析純化，洗脫劑為Cy/EtOAc = 3∶1，濃縮得120 mg化合物b，產(chǎn)率為56.7%。

稱取30 mg(0.09 mmol)b化合物于50 mL圓底燒瓶中，加入一粒攪拌子，加入約5 mL MeOH溶液使其溶解；另稱取50 mg金屬鈉，迅速加入20 mL無水MeOH溶液中，制備MeONa溶液，向圓底燒瓶中緩慢加入新制的MeONa溶液，用pH試紙調(diào)節(jié)使反應(yīng)體系的pH在12～13之間，室溫?cái)嚢璺磻?yīng)，經(jīng)TLC檢測反應(yīng)完全(顯色劑為5%H2SO4-C2H5OH溶液，展開劑為Cy/EtOAc = 1∶1)。向反應(yīng)液中加入強(qiáng)酸性陽離子交換樹脂調(diào)pH = 6左右，過濾，減壓濃縮，真空干燥得粗產(chǎn)物，用HL-20凝膠柱純化粗產(chǎn)物，洗脫劑為MeOH，濃縮得22 mg化合物2，產(chǎn)率為88.3%。

波譜數(shù)據(jù)：ESI-MS m/z：639.3[M+Na]+。

1H-NMR(400 MHz，CD3OD)δ：5.48(1H，brt，J=2.8Hz，H-12)，5.25(1H，d，J=8.0Hz，H-1'Fuc)，4.88(1H，m，H-3)，3.71-4.12(7H，m，H-2'，H-3'，H-4'，H-5'，H-6'Fuc)，3.61(3H，s，OCH3)，2.85(1H，d，J=4.8 Hz，H-18)，1.88-2.03(3H，m，3×OH)，1.22-1.79(22H，m，H-1，H-2，H-5，H-6，H-7，H-9，H-11，H-15，H-16，H-19，H-21，H-22)，1.15(3H，s，H-27)，1.01(3H，s，H-26)，0.95(3H，s，H-30)，0.92(3H，s，H-23)，0.90(3H，s，H-24)，0.80(6H，s，H-29)，0.74(6H，s，H-25)。

13C-NMR(400 MHz，CD3OD)δ：180.4(C-28)，144.9(C-13)，123.8(C-12)，107.4(C-1'Fuc)，86.3(C-3)，75.3(C-5'Fuc)，75.1(C-3'Fuc)，73.2(C-2'Fuc)，72.4(C-4'Fuc)，52.2(OMe)，49.6(C-9)，49.2(C-5)，48.1(C-17)，47.0(C-19)，42.8(C-4)，42.7(C-14)，40.6(C-18)，40.5(C-8)，39.7(C-1)，37.9(C-10)，34.7(C-21)，34.1(C-29)，33.9(C-22)，33.6(C-7)，31.6(C-20)，28.9(C-15)，26.5(C-27)，26.4(C-2)，24.5(C-11)，24.1(C-30)，23.9(C-16)，19.5(C-6)，17.6(C-26)，17.5(C-6'Fuc)，17.2(C-25)，16.9(C-23)，15.9(C-24)。

(2)3的合成

稱取100 mg(0.11 mmol)化合物c和100 mg(0.21 mmol)化合物1于50 mL干燥圓底燒瓶中，加入一粒攪拌子，再加入30 mg NIS和100 mg 4?Ms，抽真空，并通入N2保護(hù)反應(yīng)體系。向圓底燒瓶中加入適量無水DCM(約8 mL)充分溶解反應(yīng)物，將反應(yīng)體系置于冰鹽浴條件下攪拌，平衡10 min后加入6 μL的TfOH，反應(yīng)一直在冰鹽浴中進(jìn)行，經(jīng)TLC檢測反應(yīng)完全(顯色劑為5%H2SO4-C2H5OH溶液，展開劑為Cy/EtOAc = 1∶1)。向反應(yīng)溶液中加入飽和NaS2O3溶液中和過多的NIS，反應(yīng)體系由紅色變?yōu)闊o色，再加入飽和NaHCO3溶液中和過多的TfOH，用DCM/H2O萃取反應(yīng)液，收集有機(jī)相層，用無水MgSO4干燥，過濾，減壓蒸去溶劑獲得粗產(chǎn)品，用硅膠柱層析純化，洗脫劑為Cy/EtOAc = 3∶1，濃縮得72 mg化合物A3，產(chǎn)率為52.3%。

取A3置于干燥圓底燒瓶中加入2 mL(0.02 mol)Ac2O和2 mLMeOH，N2保護(hù)，室溫?cái)嚢?4 h，經(jīng)TLC檢測反應(yīng)完全(顯色劑為5%H2SO4-C2H5OH溶液，展開劑為DCM/MeOH=8∶1)。加入適量Tol，減壓除溶劑，再用MeOH溶解，濾紙過濾，減壓蒸去溶劑獲得粗產(chǎn)品，用硅膠柱層析純化，洗脫劑為DCM/MeOH=8∶1，獲得白色固體，然后再用HL-20純化，洗脫劑為MeOH，得到19 mg白色固體產(chǎn)物3，收率為67.5%。

波譜數(shù)據(jù)：ESI-MS m/z：925.5[M+Na]+。

1H-NMR(400 MHz，CD3OD)δ：7.24-7.37(5H，m，Ar-H)，5.47(1H，d，J=8.2 Hz，H-1Glu)，5.24(1H，brt，J=2.8 Hz，H-12)，4.91(1H，m，H-3)，3.51-4.02(15H，m，Bn-CH2，Glu-H，Gal-H)，3.63(3H，s，OCH3)，3.35(3H，s，NCH3)，3.12(1H，d，J=9.4 Hz，H-23)，2.88(1H，d，J=14，4.8 Hz，H-18)，1.89-2.05(5H，m，Glu-OH，Gal-OH)，0.78-1.74(22H，m，H-1，H-2，H-5，H-6，H-7，H-9，H-11，H-15，H-16，H-19，H-21，H-22)，1.15(3H，s，H-27)，1.00(3H，s，H-26)，0.95(3H，s，H-30)，0.93(3H，s，H-23)，0.91(3H，s，H-24)，0.86(3H，s，H-29)，0.74(3H，s，H-25)。

2 結(jié)果與討論

2.1 化學(xué)合成

合成2～3衍生物的反應(yīng)涉及單糖，二糖片段與齊墩果酸苷元的合成，該步驟是合成齊墩果酸皂苷元衍生物的關(guān)鍵。目標(biāo)產(chǎn)物在反應(yīng)過程中采用TLC監(jiān)測反應(yīng)終點(diǎn)，柱層析純化，其結(jié)構(gòu)通過1HNMR，13CNMR，MS得以確證。

在羧酸衍生物的制備中所使用的TFBA(四丁基氟化銨)是一種相轉(zhuǎn)移催化劑。在實(shí)驗(yàn)的過程中，-COOH必須在NaHCO3中電離成-COO-才能反應(yīng)，而CH3I只溶于DCM，所以用TFBA作為兩相轉(zhuǎn)移的催化劑來調(diào)和有機(jī)相與水相。CH3I只作用于C-28位的-COOH而對其他兩位上的-OH沒反應(yīng)，是因?yàn)樽饔糜贑-28位是成酯，而另兩位是成醚，各自的反應(yīng)條件不同，而且NaHCO3只對-COOH起作用，故只有C-28位被置換成-Me。

2.2 細(xì)胞活性

以阿霉素為陽性對照藥，采用MTT法對目標(biāo)化合物進(jìn)行初步的體外活性測試并計(jì)算抑制率，數(shù)據(jù)見表1。

表1 目標(biāo)化合物對A549的體外抑制率

由表1可見，濃度為1×10-3mol·L-1時(shí)，2種化合物對A549的抑制活性明顯較其他的濃度時(shí)要高，抑制率分別為(64.12±3.03)%；(89.25±0.12)%。其中，化合物2在最低濃度1×10-6mmol·L-1時(shí)對A549不存在抑制作用，而化合物3在各濃度下均對A549有抑制作用。

3 結(jié)語

以齊墩果酸苷元為原料，通過酯化、乙?；懊鸦确磻?yīng)，合成了齊墩果酸皂苷元脂溶性衍生物(2～3)，其中2未見文獻(xiàn)報(bào)道。目標(biāo)化合物的抑制活性雖然均不如陽性對照藥阿霉素，但考慮到糖苷在體內(nèi)的降解過程中，還會在不同時(shí)段和部位釋放出具有藥理活性的苷元，因此將做進(jìn)一步的動物實(shí)驗(yàn)，對體內(nèi)藥動學(xué)和藥效學(xué)關(guān)系進(jìn)行分析。該研究對進(jìn)一步研究開發(fā)糖苷化齊墩果酸衍生物奠定了基礎(chǔ)。