劉俊 陳舒 應(yīng)璇 葉曉霞 董揚(yáng) 王文標(biāo)

心房顫動(dòng)(簡(jiǎn)稱(chēng)房顫)是最常見(jiàn)的心律失常,其中呈現(xiàn)明顯家族性者稱(chēng)為家族性房顫(familial atrial fibrillation,FAF)。房顫電生理機(jī)制和病理生理機(jī)制復(fù)雜,發(fā)病機(jī)制尚未完全清楚。目前,越來(lái)越多的學(xué)者將研究的目光投放在遺傳因素上[1－2]。據(jù)流行病學(xué)研究報(bào)道,30%的房顫患者具有房顫家族史[3],5%的典型房顫患者以及15%的孤立性房顫患者呈現(xiàn)明顯家族遺傳性[4],說(shuō)明FAF患者數(shù)目可能比預(yù)想中的要多。與此同時(shí),學(xué)者們從龐大的基因組中探尋到數(shù)種可能與房顫相關(guān)的基因變異[5],然而尚少見(jiàn)關(guān)于FAF相關(guān)致病基因的研究。這些遺傳變異影響了離子通道、電傳導(dǎo)、信號(hào)傳導(dǎo)通路等生理機(jī)制,最終破壞正常電興奮[6－7]。因此,對(duì)FAF致病基因的研究不僅是為明確突變位點(diǎn),還能探索遺傳因素導(dǎo)致房顫發(fā)生的分子學(xué)機(jī)制,為挖掘其他類(lèi)型房顫發(fā)生機(jī)制提供新的思路與理論依據(jù)。本研究基于此,筆者對(duì)比已知房顫 相 關(guān) 基 因KCNQ1、KCNE2、SCN5A、KCND3、CJA5、ACC9在FAF、非FAF患者以及正常無(wú)房顫者間的檢出率,研究上述致病基因與FAF相關(guān)性及其對(duì)后者的預(yù)測(cè)價(jià)值。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象及分組

應(yīng)用隨機(jī)數(shù)字表法選取2017年1月至2018年10月間于金華市人民醫(yī)院就診的40例FAF 患者作為FAF組,并選取20例同期非家族性房顫患者納入非FAF組,以及納入20例正常無(wú)房顫者作對(duì)照組。納入標(biāo)準(zhǔn)[8]:①FAF 組具有明顯家族史,遺傳模式符合孟德?tīng)栠z傳模式,三代親屬中≥3例發(fā)病,患者心電圖、動(dòng)態(tài)心電圖或植入式起搏器等監(jiān)測(cè)到房顫心電圖；②年齡:20～50歲；③已簽署知情同意書(shū)；④非FAF組和對(duì)照組患者三代親屬中均無(wú)遺傳性心律失常及遺傳性心臟離子通道病,非FAF組有明確房顫病因(如甲亢、高血壓性心臟病、擴(kuò)張型心肌病等)。排除標(biāo)準(zhǔn):①半年內(nèi)存在心肌梗死病史；②近1月內(nèi)接受心臟手術(shù)者；③紐約心臟病協(xié)會(huì)(NYHA)分級(jí)3、4級(jí)心力衰竭者；④存在嚴(yán)重心臟瓣膜病變、甲狀腺功能減退、水電解質(zhì)紊亂、嚴(yán)重肺功能障礙者；本實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)已由醫(yī)院倫理學(xué)委員會(huì)審核。

1.2 方法

所有入組研究對(duì)象于門(mén)診或入院后24 h內(nèi)被收集病史、既往史、年齡、身體質(zhì)量指數(shù)(BMI)、心電圖結(jié)果等基本信息。

1.2.1 基因組DNA 的提取 采集所有入組人員外周抗凝血6 ml,應(yīng)用QIAamp DNA Blood Mini Kit(NO.51106)試 劑 盒(購(gòu) 自 德 國(guó)QIAGEN 公司)對(duì)樣本進(jìn)行基因組DNA 提取。DNA 質(zhì)量濃度≥50 ng/μL,吸光度(A)260/A280為1.8～2.0,DNA 總量≥6μg。

1.2.2 目標(biāo)基因測(cè)序 根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)獲取致病基因(KCNQ1、KCNE2、SCN5A、KCND3、CJA5、ACC9)所對(duì)應(yīng)的序列(具體交由杭州本因生物科技有限公司完成),使用安捷倫SureSelect靶向序列捕獲系統(tǒng)設(shè)計(jì)特異性寡核苷酸鏈探針,其中包含目標(biāo)基因所有外顯子區(qū)域、外顯子和內(nèi)含子交界區(qū)域以及全部基因的5′和3′末端。將1μg基因組DNA樣本打斷成長(zhǎng)為200～500 bp的片段,末端補(bǔ)平、加“A”,與寡核苷酸混合物接頭銜接,將所得產(chǎn)物進(jìn)行PCR 反應(yīng)擴(kuò)增、純化,構(gòu)建DNA 文庫(kù)并對(duì)其行質(zhì)量檢測(cè)。預(yù)先設(shè)計(jì)的特異性捕獲探針與合格的DNA文庫(kù)雜交、富集后,將富集的外顯子區(qū)域的DNA 片段洗脫下來(lái),并檢測(cè)富集效率。然后,應(yīng)用第二代高通量測(cè)序技術(shù)將捕獲的DNA 文庫(kù)在Illumina HiSeq TM2000平臺(tái)(美國(guó)Illumina公司提供)上對(duì)目標(biāo)序列進(jìn)行測(cè)序,測(cè)序深度200X,得到原始數(shù)據(jù)并確保所有檢測(cè)樣品均達(dá)到預(yù)期測(cè)序標(biāo)準(zhǔn),Q30平均比例在80%,平均錯(cuò)誤率在0.1%以下。探針設(shè)計(jì)標(biāo)準(zhǔn)、捕獲條件、基因組DNA 與捕獲探針比例參考文獻(xiàn)[9]。

1.2.3 生物學(xué)信息分析 應(yīng)用Illumina basecalling Software 1.7 軟件對(duì)原始測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行處理和控制,并將其與NCBI人類(lèi)基因組DNA(GRCh37/hg19)參照序列對(duì)比。應(yīng)用GATK、AtlasSNP、Atlaslndel2軟件分析并獲得單核苷酸多態(tài)性、小插入與小缺失變異相關(guān)信息,了解樣本中的DNA 序列變異。將檢測(cè)獲得的DNA 變異序列信息與1000 Genome、dbSNPI 35、NHLBIexome sequencing database、NIEHS exome sequencing database數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行對(duì)比,去除高于0.5%的隱形突變、高于0.1%的顯性突變、對(duì)蛋白功能無(wú)影響的突變,最終得到FAF相關(guān)突變位點(diǎn)。本研究所納入的KCNQ1、KCNE2、SCN5A 等致病基因中,若檢測(cè)出錯(cuò)義突變或有意義的堿基突變則計(jì)作陽(yáng)性(＋),由此計(jì)算致病基因突變檢出率。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 25.0 版統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件分析,年齡、體重、BMI等采用(±s)表示,組間比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn),三組間比較采用方差分析,兩兩比較采用bonferroni校正。計(jì)數(shù)資料用例數(shù)和百分?jǐn)?shù)表示,采用χ2檢驗(yàn),應(yīng)用多因素Logistic回歸分析探究致病因子與FAF 相關(guān)性,以P＜0.05 為差異有顯著性。

2 結(jié)果

2.1 三組一般臨床資料比較

三組年齡、性別、體重、BMI等資料比較均無(wú)明顯差異(P＞0.05),見(jiàn)表1。

2.2 三組致病基因突變檢測(cè)結(jié)果比較

三組致病基因KCNQ1、KCNE2、SCN5A 突變檢出率存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜0.05),而KCND3、CJA5、ACC9基因突變檢出率無(wú)明顯差異(P ＞0.05),見(jiàn)表2。

表2 三組致病基因突變檢測(cè)結(jié)果比較[(n)%]

2.3 致病基因突變與FAF相關(guān)性比較

根據(jù)三組患者致病基因檢出率結(jié)果,選擇其中P＜0.05的3個(gè)可能與FAF 相關(guān)的致病基因進(jìn)行Logistic回歸分析。分析顯示,致病基因KCNQ1、SCN5A、KCNE2突變均為FAF 的獨(dú)立危險(xiǎn)因素,見(jiàn)表3。

表3 FAF致病基因Logistic回歸結(jié)果

2.4 致病基因KCNQ1(＋)、KCNE2(＋)、SCN5A(＋)單獨(dú)診斷FAF的診斷效能比較

不同致病基因單獨(dú)檢測(cè)的診斷效能比較均無(wú)明顯差異(P＞0.05),見(jiàn)表4。

2.5 不同致病基因突變聯(lián)合檢測(cè)方式對(duì)FAF的診斷效能比較

KCNQ1(＋)、KCNE2(＋)、SCN5A(＋)三者兩兩聯(lián)合檢測(cè)與三者聯(lián)合檢測(cè)的診斷效能比較無(wú)明顯差異(P＞0.05),見(jiàn)表5。

表4 不同致病基因單獨(dú)診斷FAF的診斷結(jié)果比較

表5不同致病基因聯(lián)合檢測(cè)的診斷結(jié)果比較

3 討論

隨著分子生物學(xué)的不斷發(fā)展,越來(lái)越多的疾病被證實(shí)與基因突變相關(guān),自1997年Brugada首次發(fā)現(xiàn)房顫相關(guān)染色體位點(diǎn)以來(lái),目前至少17個(gè)房顫致病基因已被人們發(fā)現(xiàn)[10]。但有關(guān)FAF的相關(guān)研究局限在白種人群,在亞洲人群中的研究甚少。為豐富這一領(lǐng)域的研究,筆者收集了40例FAF 患者的基因組DNA,將之于非FAF患者、正常群體進(jìn)行對(duì)比,發(fā)現(xiàn):三組致病基因KCNQ1、KCNE2、SCN5A突變檢出率存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；致病基因KCNQ1、SCN5A、KCNE2突變均為FAF 的獨(dú)立危險(xiǎn)因素,說(shuō)明KCNQ1、KCNE2、SCN5A 與FAF的發(fā)生密切相關(guān)。姜永日等[4]報(bào)道:KCNQ1 基因編碼的KCNQ1亞基可與KCNE1亞基結(jié)合形成通道復(fù)合體,構(gòu)建成的緩慢激活延遲整流鉀通道IKS在動(dòng)作電位時(shí)發(fā)生失活,導(dǎo)致房顫發(fā)生；KCNE2可影響KCNQ1-KCNE2通道功能,縮短心肌細(xì)胞動(dòng)作電位間期,從而啟動(dòng)房顫。Ilkhanoff等[11]研究中發(fā)現(xiàn),SCN5A 基因H558R 位點(diǎn)多態(tài)性與房顫的發(fā)生、發(fā)展有著緊密的聯(lián)系,SCN5A 基因變異rs7629265可使非洲裔美國(guó)人房顫風(fēng)險(xiǎn)提升74%,并與PR 間期的縮短有關(guān)。本實(shí)驗(yàn)中,筆者采用新一代高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)研究對(duì)象DNA 文庫(kù)進(jìn)行測(cè)序,相比傳統(tǒng)第一代Sanger測(cè)序技術(shù),前者具有檢測(cè)速度快、準(zhǔn)確性高、覆蓋度廣等特點(diǎn)[12]。通過(guò)實(shí)驗(yàn),筆者認(rèn)為致病基因KCNQ1、KCNE2、SCN5A 可能與FAF發(fā)生具有一定相關(guān)性,這一結(jié)論可能給往后FAF相關(guān)基因多態(tài)性的研究提供理論依據(jù)。而本實(shí)驗(yàn)樣本量較少,地域局限,未對(duì)比漢族與其他民族的實(shí)驗(yàn)結(jié)果差異,有待今后進(jìn)一步的擴(kuò)展研究。

挖掘FAF相關(guān)基因突變,可為從遺傳學(xué)和分子生物學(xué)上揭示房顫致病機(jī)制帶來(lái)一定的線(xiàn)索,同時(shí)也是為實(shí)現(xiàn)FAF基因診斷、研發(fā)特異性治療方法帶來(lái)新的希望。越來(lái)越的研究表明房顫發(fā)病與多個(gè)基因的多態(tài)性有關(guān),在本實(shí)驗(yàn)中,致病基因KCNQ1、KCNE2、SCN5A 突變情況單獨(dú)診斷FAF的診斷效能較低,不同致病基因突變情況單獨(dú)檢測(cè)的診斷效能比較均無(wú)明顯差異,因此單獨(dú)致病基因檢測(cè)的診斷效能可能并不理想。本文中KCNQ1(＋)與KCNE2(＋)和SCN5A(＋)聯(lián)合檢測(cè)時(shí)靈敏度和特異度分別為95.0%、67.5%,相對(duì)單獨(dú)檢測(cè)和兩兩聯(lián)合檢測(cè),三者聯(lián)合檢測(cè)可取得較高的靈敏度,但兩兩聯(lián)合檢測(cè)與三者聯(lián)合檢測(cè)的診斷效能比較并無(wú)明顯差異。Olesen等[13]報(bào)道單基因突變?cè)诠铝⑿苑款澓虵AF中雖然存在,但是較為罕見(jiàn)。單個(gè)基因突變所致的房顫只占全部房顫患者中的極少部分,更多的FAF及普通房顫患者的發(fā)病原因可能是由多個(gè)基因突變或基因-環(huán)境相互作用引起的。因此,為提高基因檢測(cè)對(duì)FAF的診斷效能,我們建議將KCNQ1(＋)、KCNE2(＋)、SCN5A(＋)三者兩兩聯(lián)合檢測(cè)或三者聯(lián)合檢測(cè)以獲得更理想的診斷靈敏度,這不僅有助于提升基因檢測(cè)對(duì)FAF的預(yù)測(cè)價(jià)值,提早對(duì)患者進(jìn)行健康干預(yù),同時(shí)也有助于發(fā)現(xiàn)更多的FAF患者。然而本實(shí)驗(yàn)樣本較少,至于診斷效能最理想的致病基因聯(lián)合檢測(cè)方式還有待進(jìn)一步的研究。