王雁秋，彭萬里，梁如冰

（上海交通大學生命科學技術學院，微生物代謝國家重點實驗室，上海200240）

環(huán)境雌激素污染作為一個新興的全球性環(huán)境問題，嚴重威脅著人類社會與生物圈的生存與繁衍。如何有效治理環(huán)境雌激素污染物和高效修復受污染環(huán)境已成為多個領域研究者關注的重點與熱點問題[1-3]。雌激素物質是環(huán)境雌激素污染物中最重要的一類，可在極低濃度下（1.0 ng·L-1）對生物體產生明顯的影響，致畸致癌作用嚴重，還可誘發(fā)雄性個體雌性化，引發(fā)女性腫瘤、癌癥、男性不育和兒童性早熟等多種問題。因此，世界衛(wèi)生組織已將雌激素列為一類致癌物和重要環(huán)境污染物[4-5]。雌激素類物質是一種類固醇衍生物，含有“6-6-6-5”四環(huán)碳骨架結構，包括天然內源性雌激素和人工合成的雌激素[6]。內源性雌激素主要是生物體內天然存在的雌激素，包括雌二醇（E2）、雌三醇（E3）和雌酮（E1）等。而人工合成雌激素大多作為藥物使用，如口服避孕藥的主要成分炔雌醇（17α-乙炔基雌二醇，17α-ethynylestradiol，EE2）。EE2 可用于治療月經紊亂、絕經后體內雌激素的補充等；養(yǎng)殖業(yè)中加入的同化激素添加劑，可提高家畜的產量質量、控制動物性分化等。由于EE2結構中包含一個乙炔基（E2），相較于天然雌激素，其化學結構更穩(wěn)定，雌激素效應更強，也更難被降解，環(huán)境積累嚴重。EE2 等雌激素物質可主要通過污水排放系統(tǒng)進入環(huán)境，會在污水中大量累積。對上海市3 個典型畜禽養(yǎng)殖場周邊河流上下游地表水的檢測發(fā)現(xiàn)，水體中均存在EE2 污染，EE2 檢出率為99.44%，最高測出濃度可達19.42 ng·L-1[7]。在北京污水處理廠的出水中檢出的EE2 濃度為39.8 ng·L-1，高于其他國家污水處理廠的檢出濃度[8]。因此，早在2009 年，EE2已被認為是在中國城市污水處理廠應當優(yōu)先控制的4 種污染物之一[9]。近年來，由于生產生活方式的變化，避孕藥與激素添加劑等雌激素類藥物的使用越來越廣泛，其環(huán)境污染問題也日益嚴重，有關EE2 污染的有效治理也越來越被重視[10]。

目前，環(huán)境中雌激素污染物的有效去除方法是微生物降解法。相比于物理與化學方法，微生物降解法具有操作簡單、成本低廉且無二次污染等優(yōu)勢[11-12]。已報道的雌激素降解菌株有近百株，包括紅球菌（Rhodococcus）[13-14]、鞘氨醇單胞菌（Sphingomonas）[13]、歐洲亞硝化單胞菌（Nitrosomonas europaea）[15-16]、不動桿 菌（Acinetobacter）[12，17]和假單胞菌（Pseudomonas）[18-20]等。這些菌株對天然雌激素如E2 的降解效能較高，但大多不能代謝EE2?，F(xiàn)僅發(fā)現(xiàn)鞘氨醇單胞菌、歐洲亞硝化單胞菌和假單胞菌可降解EE2。其中能同時降解天然雌激素與EE2 的菌株仍很少[12，14，18，21-22]。本實驗室前期分離了一株可同時降解E2 和EE2 的香茅醇假單胞菌（Pseudomonas citronellolis）SJTE-3，生長速度快，降解效能高，24 h 內對10 mg·L-1E2 與10 mg·L-1EE2 的降解率達到100%與55.8%，具有很好的修復應用前景[18]。

但是，由于實際環(huán)境條件苛刻且成分復雜，游離降解菌的存活與生長會受到影響，可能難以與土著微生物競爭，最終導致降解菌株的降解效能下降，修復應用受限。研究表明，固定化菌劑具有易于回收、穩(wěn)定性強、生物量高、菌種優(yōu)勢明顯等優(yōu)點，可彌補游離菌株應用的不足[22-23]。固定化菌劑現(xiàn)已應用于修復污水中氨氮[24-26]、磷酸鹽[26]、間甲酚[22]、雌二醇和己烯雌酚[27]、苯酚[28]、2-羥基-1，4-萘醌[29]污染及土壤中的多環(huán)芳烴[30]污染等，處理效果較游離態(tài)菌劑好?，F(xiàn)有固定化對象一般為整體細胞或關鍵酶，但固定化酶存在長期穩(wěn)定性差與難回收再循環(huán)的問題，操作成本較高[31]。因此，固定化細胞方式在環(huán)境修復中應用更廣泛。

利用高聚物形成凝膠將微生物包埋于其內部的方法，是目前常用的菌劑固定化方法，所用包埋劑有瓊脂、丙烯酰胺、海藻酸鈉、明膠、幾丁質、聚乙烯醇（PVA）等。其中，海藻酸鈣法與聚乙烯醇-海藻酸鈣（PVA-SA）法都具有良好的生物可降解性、化學穩(wěn)定性與傳質性能[21，23,29]。但PVA-SA 固定化方法較海藻酸鈣法傳質性能較弱，結構易松散。近年來，研究者嘗試應用固定化菌劑來去除環(huán)境雌激素物質。李欣等[27]采用海藻酸鈣法固定降解菌株，可基本全部去除污水中的雌二醇和己烯雌酚；而以聚氨酯水凝膠為載體包埋硝化菌顆粒，對模擬污水中雌二醇的去除率可達94.4%[32]；采用海藻酸鈣法固定己烯雌酚降解沙雷氏菌，實驗室條件下其對己烯雌酚去除率為83.1%[33]。本研究擬采用海藻酸鈣法，對實驗室已分離的雌激素高效降解菌株香茅醇假單胞菌SJTE-3進行固定，明確其有效固定化條件，制備高性能固定化菌劑，并確定固定化菌劑對環(huán)境中炔雌醇的降解效能，可為環(huán)境雌激素污染的修復應用奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗菌株

雌激素降解菌株香茅醇假單胞菌（P.citronellolis）SJTE-3 為本實驗室分離，保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心（保藏編號為CGMCC No.12720）。

1.2 培養(yǎng)基與化學試劑

17α-乙炔基雌二醇（分子式：C20H24O2，分子量：296.41，純度≥98%）購自西格瑪奧德里奇（上海）貿易有限公司；無水氯化鈣（分析純）、海藻酸鈉（化學純）購自上海國藥集團化學試劑有限公司；乙腈（分析純）與乙酸乙酯（分析純）等均購自上海阿拉丁生化科技股份有限公司。LB 培養(yǎng)液、Tris-HCl 緩沖液（pH=6.8）等培養(yǎng)基與試劑的配制參照《分子克隆實驗指南》（第四版）。17α-乙炔基雌二醇母液為DMSO溶解后配制的1 mg·mL-1母液，0.22μm濾膜過濾除菌后備用。模擬污水：收集土壤100 g（土壤取自上海交通大學閔行校區(qū)草地）懸浮于100 mL 蒸餾水，取土壤浸出液，加入終濃度為10μg·mL-1的EE2模擬雌激素污染的污水。

1.3 固定化菌劑制備

以海藻酸鈉質量分數、氯化鈣質量分數和菌液量作為試驗因素，采用正交試驗法，設計3因素3水平正交表L9（3）3；以EE2 去除率為指標，各因子水平取值見表1[27，31]。將菌株SJTE-3 接種于LB 培養(yǎng)基，37 ℃振蕩培養(yǎng)至OD600=0.5，收菌洗滌后用無菌生理鹽水調節(jié)OD600為10.0備用。配制好各質量分數的海藻酸鈉溶液滅菌，冷卻至室溫后，將菌懸液加入100 mL 不同濃度的海藻酸鈉溶膠中；充分攪拌混勻后，用注射器吸取并勻速滴入到勻速攪拌的不同質量分數的氯化鈣溶液中造粒，速度1～2 ?！-1。造粒完畢后，固定化小球繼續(xù)在上述氯化鈣溶液中于4 ℃中固定4 h。最后，對小球進行滅菌生理鹽水洗滌、過濾、濾干后，即獲得固定化菌劑，4 ℃儲存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 固定化菌劑的基本性質測定

平均直徑測定：取不同試驗因素水平的固定化菌劑微球樣品10 個，用游標卡尺測量總直徑后，取平均值即為微球平均直徑。

表1 正交試驗因素水平Table 1 The levels of orthogonal experimental factors

強度測定：取不同試驗因素水平的固定化菌劑微球樣品4 g，于10 mL 小管中微微壓實，記此時刻度為0。繼續(xù)緩慢擠壓固定化菌劑微球直至微球出現(xiàn)破裂，此時壓縮距離（mm）記為固定化菌劑微球的大致強度。

1.5 固定化菌劑表面形態(tài)的掃描電鏡觀察

將固定化小球用無菌生理鹽水清洗3 次后，用0.5%戊二醛在4 ℃固定30 min。無菌生理鹽水清洗2次后，用2.5%戊二醛在4 ℃固定2 h。利用50%、70%、100%乙醇清洗2 遍后，用100μL 的無水乙醇將其懸浮。采用臨界干燥法將樣品干燥、噴金后在掃描電鏡下觀察。

1.6 固定化菌劑去除培養(yǎng)基中EE2的效能檢測

在200 mL Tris-HCl 緩沖液基中加入初始濃度為10μg·mL-1的EE2，按照每100 mL 加入10 g菌劑的濃度加入20 g 固定化菌劑，于37 ℃、180 r·min-1搖床培養(yǎng)5 d。每日取樣2 mL 測定溶液中殘留EE2 濃度，計算EE2 的去除率。以不含菌的空白小球作為陰性對照，接入等量菌液的游離態(tài)菌劑作為陽性對照。向2 mL 取樣溶液中加入20 μL 的1 mol·L-1鹽酸酸化后，加入1 mL 乙酸乙酯后振蕩萃取15 s，重復萃取3 次。收集有機相后于氮吹儀中吹干，復溶于200μL 乙腈。利用安捷倫熒光高效液相色譜（High performance liquid chromatography-fluorescence detector，HPLC/FLD，Agilent 1260，USA）進行檢測。檢測條件為：SB-C18柱（150 mm×4.6μm，5μm，Agilent，USA），流動相為乙腈∶水=55%∶45%，流速為1 mL·min-1，柱溫30 ℃。激發(fā)光為280 nm，發(fā)射光為315 nm。以不同濃度的EE2標品做標準曲線，根據標準曲線計算EE2 的殘留量。EE2 的去除率計算如下：EE2 去除率=（EE2 初始量-EE2殘留量）/EE2初始量×100%。

1.7 固定化菌劑去除模擬污水中EE2的效能檢測

在200 mL 不同濃度的模擬污水（5、10、15、30、50μg·mL-1）中，按照每100 mL 加入10 g 菌劑的濃度加入20 g 固定化菌劑，于37 ℃、180 r·min-1搖床培養(yǎng)5 d。每日取樣2 mL 測定溶液中殘留EE2 濃度，計算EE2的去除率。以不含菌的空白小球作為陰性對照，接入等量菌液的游離態(tài)菌劑作為陽性對照。利用HPLC/FLD 法檢測EE2 的存留量，計算其去除率，方法同1.6。

1.8 固定化菌劑的重復使用性檢測

當固定化菌劑在含10 μg·mL-1EE2 的Tris-HCl緩沖液中培養(yǎng)1 d后，取出固定化菌劑，用無菌生理鹽水洗滌，再加入到新的含10μg·mL-1EE2 的Tris-HCl緩沖液中，進行重復利用，重復10 次。每次均觀察固定化菌劑的形態(tài)，如1.5 所示；同時，測定溶液中EE2的去除效率，檢測方法同1.6。

2 結果與討論

2.1 海藻酸鈣法制備固定化菌劑的最佳條件

以海藻酸鈉質量分數、氯化鈣質量分數和菌液量作為試驗因素的3 因素3 水平正交試驗結果顯示，當3 因素分別都在水平2 時，EE2 的去除率最高（表2）。因此，海藻酸鈣法制備固定化菌劑的最佳條件為：A2B2C2，即3%海藻酸鈉溶液、4% CaCl2溶液、2 mL 的OD600為10.0的菌液量。

表2 固定化菌劑去除EE2的正交試驗結果Table 2 The orthogonal experiment results of the EE2 removal efficiency by the immobilized bacteria agents

2.2 最佳條件制備的固定化菌劑的形態(tài)

利用最佳條件制備獲得固定化菌劑后，利用掃描電鏡觀察新制的固定化菌劑形態(tài)和培養(yǎng)5 d后的表面形態(tài)。結果顯示，最佳制備條件下獲得的固定化菌劑平均直徑約為2.92 mm，外形圓潤無拖尾（圖1）。新制固定化菌劑的表面平整較規(guī)則，培養(yǎng)5 d后，菌劑表面會出現(xiàn)鼓泡與少量破損（圖2）。

2.3 固定化菌劑對培養(yǎng)基中EE2的去除效果

圖1 最佳制備條件下獲得的固定化菌劑形態(tài)圖Figure 1 The immobilized bacterial agents under the optimal preparation condition

圖2 培養(yǎng)前后固定化菌劑表面形態(tài)的掃描電鏡圖Figure 2 Scanning electron microscope（SEM）images of the surface of the immobilized bacterial agents before and after 5-day cultivation

利用HPLC-FLD方法檢測了固定化菌劑、游離態(tài)菌劑和空白小球對培養(yǎng)基中10 μg·mL-1的EE2 的去除效果。結果顯示，24 h 后，固定化菌劑基本達到最大去除率，游離態(tài)菌劑在48 h也可達到EE2的去除穩(wěn)態(tài)。5 d 后，固定化菌劑、空白小球、游離態(tài)菌劑對培養(yǎng)基中的EE2 的終末去除率分別為78.8%、34.1%和55.8%（圖3）。由此可見，菌株SJTE-3 去除EE2 的時間短，固定化菌劑對EE2 的去除率顯著高于游離態(tài)菌劑。

圖3 固定化菌劑與游離態(tài)菌劑對培養(yǎng)基中EE2的去除效率Figure 3 The removal efficiency of EE2 in medium by the immobilized bacteria agent and the free state bacteria

2.4 固定化菌劑對模擬污水中EE2的去除效果

利用HPLC-FLD方法檢測了固定化菌劑、空白小球、游離態(tài)菌劑對模擬污水中不同濃度（5、10、15、30、50μg·mL-1）EE2的去除效果。結果顯示，固定化菌劑在含不同EE2濃度的模擬污水中，其EE2的去除率均可達到78%；對高濃度EE2（50μg·mL-1）的去除仍保持穩(wěn)定（圖4）。游離態(tài)菌劑在模擬污水中對EE2 的去除率約為48%，相較于培養(yǎng)基中55.8%的去除率稍有下降；對高濃度的EE2（50 μg·mL-1）的去除率較低。同樣，空白小球對EE2去除率也會隨EE2濃度升高而略微降低（圖4）。由此可見，固定化菌劑可提高菌株SJTE-3 的環(huán)境適應性，保持穩(wěn)定高效的EE2 降解效能。

圖4 固定化菌劑與游離態(tài)菌劑對模擬污水中不同濃度EE2的去除效率Figure 4 The removal efficiency of EE2 of different concentrations in the simulated wastewater by the immobilized bacteria agent and the free state bacteria

2.5 固定化菌劑的重復使用效果

固定化菌劑的可重復使用次數對實際應用十分重要。對固定化菌劑的重復使用測定結果顯示，隨著重復使用次數增加，固定化菌劑對溶液中EE2的去除率逐漸下降；重復使用10 次后，其對溶液中EE2 的去除率由最初的78%下降至53%（圖5）。重復使用4次后，固定化菌劑結構開始松散，溶液開始渾濁，但90%以上菌劑仍可保持完整球形結構，且仍有68%以上的EE2去除率。隨后，固定化菌劑的破損程度逐漸增大，至第10次重復使用結束，約80%的固定化菌劑出現(xiàn)較大破損，對EE2 的去除率降至53%，與游離態(tài)菌劑對EE2 的去除率大致相當（圖5）。由此可見，該固定化菌劑的結構與降解效能穩(wěn)定，可重復使用多次。

圖5 固定化菌劑重復使用的降解效能Figure 5 The EE2 removal efficiency of the re-used immobilized bacteria agent

3 討論

炔雌醇結構穩(wěn)定，使用廣泛，常規(guī)方法難以將其有效去除，引發(fā)環(huán)境蓄積，導致嚴重的環(huán)境污染。目前有關EE2有效去除的研究仍較少，主要有物理吸附法、光降解法、化學氧化法和微生物降解法，其中微生物降解是去除EE2的有效方法。但是，這些方法仍不能高效去除EE2 或仍有較高的EE2 殘留，如72 h 內，溶解性有機質介導的光降解法對EE2 的去除僅能達到約10%[34]。因此，如何高效簡便地去除EE2，消除其環(huán)境污染，是目前研究的熱點問題。本研究利用海藻酸鈣法，制備了雌激素降解菌株SJTE-3 的固定化菌劑，其對水溶液中10μg·mL-1EE2去除率可達78.8%，其EE2去除效能和穩(wěn)定性均高于游離態(tài)菌劑，且性質穩(wěn)定，可重復使用，具有較好的應用前景。

本研究中固定化菌劑的EE2 去除率顯著高于游離態(tài)菌劑，可能是由于固定化菌劑同時具備了物理吸附與生物降解的雙重作用，從而提高了EE2的整體去除效率[21，26]。海藻酸鈣固定化小球內部為交聯(lián)結構，雌激素污染物可自由通過這些孔徑，從外部環(huán)境中進入到球體內部。在一定程度上，固定化小球可將溶液中的雌激素富集在球體內部的菌體周圍，增加菌體與雌激素的接觸效率。在物理吸附去除的基礎上，固定化小球中的降解菌通過生物降解作用，對雌激素進行轉化和利用，從而進一步降低雌激素濃度，最終實現(xiàn)較高的去除效率。由于物理吸附作用，空白小球也具有一定的EE2去除效率。根據試驗結果，固定化菌劑對EE2 的去除率為空白小球的2.3 倍以上，說明固定化菌劑對EE2的去除依然是以微生物降解作用為主，物理吸附作用為輔。但是，固定化菌劑的去除效率低于空白小球與游離態(tài)菌劑的去除率之和，未達到1+1≥2 的效果?？赡艿脑蛴校海?）在制備海藻酸鈣小球過程中，海藻酸鈉溶液與氯化鈣溶液中沒有菌體所需的營養(yǎng)，細菌處于饑餓狀態(tài)，可能會影響細菌活性或導致部分菌體死亡；（2）隨培養(yǎng)時間增加，菌體在固定化小球球體內部增殖，可能會堵塞球體內部孔徑，影響整個固定化小球的傳質性能[22，28]；同時，位于球體內部的菌體，可能也因生長空間受到擠壓，從而影響整體的去除效率。

在模擬污水中，固定化菌劑對不同濃度EE2去除效率均顯著高于游離態(tài)菌劑，說明其可適當隔絕污水的復雜環(huán)境，使菌株可以正常生長與有效降解，維持復雜環(huán)境中EE2 去除的穩(wěn)定性。但污水中存在的磷酸鹽會與固定化菌劑反應生成少量磷酸鈣沉淀，破壞固定化菌劑的結構，造成其機械強度下降易松散，導致一定程度的去除率波動。盡管如此，該固定化菌劑在多次重復使用后，仍可保持較高的EE2 去除率，顯示了其較好的實際應用前景。

然而，本研究中的固定化菌劑仍存在一定缺陷。如海藻酸鈣吸附能力與固定化菌劑包菌量等會影響固定化菌劑的效果。本研究中，空白海藻酸鈣小球對EE2 吸附率為34.1%，為進一步增強固定化菌劑去除效率，可嘗試加入高吸附性能的吸附劑。錢林波等[35]發(fā)現(xiàn)高吸附性能材料可促進污染物由土壤有機質向固定化載體遷移，實現(xiàn)污染物的富集-降解一體化。Chen等[36]采用吸附包埋法，以植物殘體和生物碳為吸附載體材料，海藻酸鈉包埋固定化多環(huán)芳烴降解菌株，對多環(huán)芳烴的去除比不添加吸附材料的海藻酸鈉固定化多環(huán)芳烴降解菌株增加了6%～29%。此外，本研究中的固定化菌劑的包菌量尚未進行最優(yōu)化試驗，最適宜的包菌量尚需進一步研究。研究發(fā)現(xiàn)，當包菌量增加時，由于菌體對氧氣和營養(yǎng)物的需求增多、氧氣擴散速率減慢、細胞生長空間減小等問題，阻礙了細胞增殖，反而會導致固定化菌劑對污染物的去除率不增反降[37-38]。因此，本文中開發(fā)的固定化菌劑的吸附效能提升與包菌量等仍需進一步優(yōu)化。

綜上所述，本文利用海藻酸鈣法固定化雌激素降解菌株SJTE-3 制備的固定化菌劑，可高效去除不同水體中的炔雌醇，具有結構穩(wěn)定、去除效果好、可多次重復應用、處理效果優(yōu)于游離態(tài)菌劑等優(yōu)點，具有實際應用的潛能。本研究可為高效無害的環(huán)境雌激素污染處理研究奠定基礎，推進實際應用進程。

4 結論

（1）明確了海藻酸鈣法固定化菌株香茅醇假單胞菌SJTE-3 的最佳方案：3%海藻酸鈉溶液、4% CaCl2溶液、2 mL的OD600為10.0的菌液量。

（2）該固定化菌劑在37 ℃對培養(yǎng)基中炔雌醇（10μg·mL-1）的去除率可達到78.8%，較游離態(tài)菌劑去除效率提高23.0%。在模擬污水條件下，固定化菌劑對不同濃度的EE2（5～50 μg·mL-1）均可達到約78%的去除率，顯著高于游離態(tài)菌劑。

（3）該固定化菌劑降解效能與球體結構穩(wěn)定，重復使用10 次后，其炔雌醇去除率仍可達53%，具有較強的重復利用性。