陳均利，張樹楠，戴桂金，張苗苗*，吳金水，劉鋒

（1.中國科學(xué)院亞熱帶農(nóng)業(yè)生態(tài)研究所，亞熱帶農(nóng)業(yè)生態(tài)過程重點實驗室，長沙農(nóng)業(yè)環(huán)境觀測研究站，長沙410125；2.湖南省鳳凰縣農(nóng)業(yè)特色產(chǎn)業(yè)中心，湖南 鳳凰416200；3.中國科學(xué)院大學(xué)，北京100049）

水體氮污染已成為世界上最為嚴峻的環(huán)境問題，而生物脫氮是水污染處理中最為經(jīng)濟、有效的處置方法[1]。傳統(tǒng)生物脫氮主要包括硝化與反硝化作用。生物硝化與反硝化過程相互依賴，但是由于硝化和反硝化微生物在生理生化上存在巨大差異，所以對溶氧（Dissolved oxygen，DO）、溫度、pH、生長速度、化學(xué)需氧量（Chemical oxygen demand,COD）以及硝酸鹽和亞硝酸鹽有著不同的耐受和表現(xiàn)。這使得傳統(tǒng)硝化與反硝化過程很難平衡和協(xié)調(diào)，導(dǎo)致脫氮過程十分復(fù)雜，且效率低下[2]。

最近，一類能在好氧條件下進行同步硝化反硝化的新型微生物——異養(yǎng)硝化-好氧反硝化（Heterotrophic nitrification-aerobic denitrification，HN-AD）菌，受到廣泛關(guān)注，如PseudomonasAn-1[3]、Klebsiellasp.KSND[4]、Paracoccus denitrificansFJAT - 14899[5]等。HN-AD 菌有著比傳統(tǒng)硝化微生物更高的細胞生長速率，并且可以利用有機基質(zhì)作為碳源，同時能夠?qū)⒉煌男螒B(tài)氮污染物，如氨氮（）、硝態(tài)氮（N）和亞硝態(tài)氮（）轉(zhuǎn)化為含氮氣體[4]。而且，HN-AD 菌在硝化和反硝化過程中的酸堿補償還可以減少pH 調(diào)節(jié)成本[6]。一些特殊HN-AD 菌甚至還具備耐受低溫、高、低C/N、高有機物和高鹽度的特性[4]。這些優(yōu)勢使得HN-AD 菌成為水處理領(lǐng)域的熱點。然而，目前對HN-AD 菌生理生化和脫氮性能的研究多通過人工合成廢水和搖瓶培養(yǎng)試驗，而在實際廢水和生物反應(yīng)器中的脫氮潛力還鮮有報道，因此很難評價HN-AD菌在自然環(huán)境條件下的實際脫氮性能[6]。此外，DO 已經(jīng)被證明是影響HN-AD 菌同步硝化反硝化能力的重要因素，對其氮代謝過程有著重要影響[7]，但是以前研究多集中于某一DO 條件對HNAD 菌脫氮性能的影響[8-9]，而很少研究DO 對HN-AD菌硝化和反硝化活性發(fā)揮的影響閾值和具體應(yīng)用，因此研究DO 控制對生物反應(yīng)器中HN-AD 菌脫氮效力的影響十分必要。

本研究以長期處理養(yǎng)殖廢水的濕地系統(tǒng)分離的一株高效HN-AD 菌（Alcaligenes faecalisWT14）為研究對象，通過氮平衡分析了該菌株的同步硝化反硝化特性，以Boltzmann 模型確定了不同DO 濃度對菌株和去除能力的影響及其DO 抑制閾值，并考察了DO 控制對固定化床反應(yīng)器中的菌株WT14 脫氮性能的影響。本研究為HN-AD 菌處理高廢水提供了新的視角。

1 材料和方法

1.1 微生物菌株、培養(yǎng)基和養(yǎng)殖廢水

Alcaligenes faecalisWT14（GenBank No.MN578054）由本實驗室從長期處理養(yǎng)殖廢水的綠狐尾藻濕地底泥基質(zhì)中分離，前期已鑒定為一株高效HN-AD 菌株。Luria-Bertani（LB）富集培養(yǎng)基：酵母粉5.00 g·L-1；酶蛋白胨10.0 g·L-1；NaCl 10.0 g·L-1。氨氮培養(yǎng)基：（NH4）2SO40.38 g·L-1、檸檬酸鈉4.08 g·L-1、MgSO4·7H2O 0.05 g·L-1、K2HPO40.2 g·L-1、NaCl 0.12 g·L-1、MnSO4·4H2O 0.01 g·L-1、FeSO40.01 g·L-1、去離子水1 L，pH=7。硝氮培養(yǎng)基：KNO30.72 g·L-1、檸檬酸鈉4.08 g·L-1、MgSO4·7H2O 0.05 g·L-1、K2HPO40.20 g·L-1、NaCl 0.12 g·L-1、MnSO4·4H2O 0.01 g·L-1、FeSO40.01 g·L-1、去離子水1 L，pH=7。氨-硝培養(yǎng)基：（NH4）2SO40.19 g·L-1、KNO30.36 g·L-1、檸檬酸鈉4.08 g·L-1、MgSO4·7H2O 0.05 g· L-1、K2HPO40.20 g·L-1、NaCl 0.12 g·L-1、MnSO4·4H2O 0.01 g·L-1、FeSO40.01 g·L-1、去離子水1 L，pH=7。養(yǎng)殖廢水：取自中國科學(xué)院長沙環(huán)境監(jiān)測站長期處理養(yǎng)豬廢水的綠狐尾藻人工濕地中處理組調(diào)節(jié)池，進水濃度253～295 mg·L-1，TN濃度261～311 mg·L-1，COD濃度1 088～1 447 mg·L-1。

1.2 氮平衡

將菌株WT14 接種于在100 mL LB 培養(yǎng)基中，在30 ℃、120 r·min-1（DO 5.50 mg·L-1）條件下培養(yǎng)24 h，隨后離心（5 000 r·min-1、10 min），用0.9%無菌NaCl溶液懸浮，重復(fù)3次（OD600nm=1）備用。

為了分析菌株WT14的氮轉(zhuǎn)化，將1 mL菌懸液分別接種于包含50 mg·L-1的100 mL氨氮培養(yǎng)基和包含25 mg·L-1、25 mg·L-1的氨-硝培養(yǎng)基中，120 r·min-1（DO 5.50 mg·L-1）、30 ℃培養(yǎng)24 h。培養(yǎng)結(jié)束收集培養(yǎng)液，HX-IID 超聲波細胞破碎儀（滬析，上海）進行超聲處理，并用于測定最終的總氮（Total nitrogen，TN）濃度（包括細胞內(nèi)氮）。接著將培養(yǎng)液8 000 r·min-1離心10 min，上清液過0.22 μm濾膜，濾液用于測定可溶性TN、和[10]。

1.3 DO對菌株WT14脫氨脫硝性能的影響

為了解DO 對菌株WT14 脫氨脫硝能力的影響。將100 mL氨氮培養(yǎng)基和硝氮培養(yǎng)基分別置于250 mL錐形瓶中，和濃度均設(shè)置為100 mg·L-1，菌懸液接種量1%（V/V），30 ℃恒溫培養(yǎng)24 h，不同DO 培養(yǎng)條件設(shè)置如下：0（0.05 mg·L-1）、20（0.85 mg·L-1）、40（1.81 mg·L-1）、60（2.84 mg·L-1）、80（3.85 mg·L-1）、100（4.75 mg·L-1）、120（5.50 mg·L-1）、140（6.08 mg·L-1）、160 r·min-1（6.51 mg·L-1）和180 r·min-1（6.81 mg·L-1），不同轉(zhuǎn)速DO 濃度通過DO 測定儀測定，培養(yǎng)結(jié)束取樣測定和濃度變化，并計算去除率和去除率。

采用Boltzmann 模型對不同DO 濃度下菌株WT14 的去除率和去除率進行分析，模型公式如下：式中：yN和yD分別為菌株WT14 在DO 濃度為x時的去除率和去除率，%；A1和A2為最低和最高或去除率，%；x為DO 濃度，mg·L-1；xN和xD分別為一半最大去除率和一半最大去除率時的DO 濃度，mg·L-1；dx為時間常數(shù)（Time const）。

1.4 養(yǎng)殖廢水處理可行性分析

為評價菌株WT14 處理實際養(yǎng)殖廢水的可行性。將1 mL 菌懸液接種于裝有100 mL 養(yǎng)殖廢水的250 mL 三角瓶中，在30 ℃、120 r·min-1（DO 5.50 mg·L-1）條件下培養(yǎng)24 h。每8 h 取10 mL 水樣測定、、TN和COD濃度變化。

1.5 菌株WT14在養(yǎng)殖廢水處理的應(yīng)用

為進一步評價Alcaligenes faecalisWT14在實際應(yīng)用中的可行性，采用直徑32.5 cm、高40.0 cm 的透明有機玻璃柱作為固定床反應(yīng)器，內(nèi)部填充多孔陶粒作為固定化載體，有效填充高度為34.7 cm（圖1）。固定床反應(yīng)器在30 ℃下運行，通過LZB 玻璃轉(zhuǎn)子空氣流量計進行兩級DO 控制，使用電子氣體流量計（MF5706，MEMS，美國）和DO 測定儀實時監(jiān)測氣體通量和DO 溶度，好氧溶氧濃度（4.00±0.30）mg·L-1，微氧溶氧濃度（0.50±0.10）mg·L-1，水力停留時間為12 h。裝填完成后系統(tǒng)先運行7 d進行穩(wěn)定，再進行30 d定期采樣監(jiān)測，每日采樣一次，每次采水樣50 mL，測定水樣、TN和COD濃度變化。

1.6 分析方法

圖1 固定床反應(yīng)器示意圖Figure 1 Schematic diagram of fixed bed reactor

2 結(jié)果與討論

2.1 異養(yǎng)硝化-好氧反硝化性能與氮平衡

如表1 所示，在氨氮培養(yǎng)基中，約92%的氮以氣態(tài)形式去除，僅有少量的積累（1.21 mg·L-1），其余大部分為胞內(nèi)氮（2.08 mg·L-1）。而在氨-硝培養(yǎng)基中，WT14 的氮去除率更高，約95%的氮轉(zhuǎn)化為氣態(tài)氮，且胞內(nèi)氮濃度更低（0.06 mg·L-1）。這表明菌株WT14 與好氧反硝化菌Hanseniaspora uvarumKPL108相似，具有同化能力[12]。與氨氮培養(yǎng)基相比（1.21 mg·L-1），菌株WT14在氨-硝培養(yǎng)基中有著更低的積累量（0.06 mg·L-1）。在菌株P(guān)seudomonasstutzeriT13 中也發(fā)現(xiàn)了同樣的現(xiàn)象，在和同時存在時會促進好氧反硝化菌對的還原，從而有著更低的積累[13]。

2.2 DO對菌株WT14脫氨脫硝性能的影響

圖2 展示了不同DO 濃度對菌株WT14 脫氨脫硝能力的影響。菌株WT14的去除能力與DO濃度有著很好的正相關(guān)性，通過Boltzmann 模型進行擬合得到相關(guān)性函數(shù)公式：yN=94.0+（36.3-94.0）/[1+e（x-2.53）/0.42]（圖2），相關(guān)系數(shù)R2=0.99（P＜0.01），這表示Boltzmann 模型能夠很好地解釋DO 濃度與菌株WT14去除率的關(guān)系。根據(jù)該模型，在DO 濃度為2.53 mg·L-1時，WT14 的去除率為最大去除率94.0%的一半（半數(shù)抑制濃度）。此外在DO 濃度為3.85 mg·L-1時，菌株WT14 能夠達到90%的去除率，高于同等條件下的好氧反硝化菌Ochrobactrum anthropicLJ81[14]和P.chengduensisZPQ2[15]。菌株WT14 的硝化活性雖然受DO 限制，但是其最低去除率依然能達到36.3%（圖2），這表明菌株WT14 具有較強的低氧耐受性，在厭氧條件下也有著較好的硝化活性。

圖2 不同DO濃度對NH+4-N和去除的影響Figure 2 Effect of different DO concentrations on and removal efficiency

表1 菌株WT14在好氧條件下的氮平衡Table 1 Nitrogen balance of the strain WT14 under aerobic conditions

2.3 菌株WT14處理養(yǎng)殖廢水的可行性分析

2.4 不同DO控制方式對養(yǎng)殖廢水氮去除的影響

前期DO 影響試驗證明菌株WT14 在高DO 條件有著較高的去除率和較低的去除率，且反硝化活性更易受到DO 的抑制，而養(yǎng)殖廢水氮去除可行性試驗進一步證明WT14 在高DO 條件下處理高濃度養(yǎng)殖廢水時其反硝化活性受到抑制，易積累和，從而影響TN 的去除。為維持較高的去除率，同時促進和的還原，基于DO 模型預(yù)測WT14 在DO 濃度為4.0 mg·L-1時，有約90%的去除率，在DO 濃度為0.50 mg·L-1時，有約97.7%的去除率，因此建立了兩個污水處理系統(tǒng)R1（好氧+好氧）和R2（好氧+微氧）（圖1）來明確好氧-微氧控制對TN 去除的促進作用。如圖4a 所示，養(yǎng)殖廢水進水TN、和COD濃度分別為261～311、253～295 mg·L-1和1 088～1 447 mg·L-1，而和濃度較低，分別為0.60～6.60 mg·L-1和0.50～4.90 mg·L-1。R1和R2反應(yīng)器出水和COD 濃度相近，分別為0.9～3.0（R1）、0.7～2.1 mg·L-1（R2）和27.0～36.4（R1）、18.2～30.5 mg·L-1（R2），但是兩個反應(yīng)器出水TN 濃度相差較大，分別為27.2～30.9 mg·L-1（R1）和4.8～9.2 mg·L-1（R2）（圖4b和圖4c）。這主要是由于R1 反應(yīng)器中（17.5～22.4 mg·L-1）和（2.80～5.70 mg·L-1）的積累，導(dǎo)致其TN 去除率（90.5%）低于R2（97.6%）（圖4d）。前期研究結(jié)果已經(jīng)證明高DO 條件（DO 4.00 mg·L-1）有利于菌株WT14 對的去除，硝化活性比反硝化活性更不易受到抑制，因此R1和R2有著相似的去除率（99.3%和99.3%），但是高DO 會抑制WT14 反硝化功能的發(fā)揮，從而導(dǎo)致了R1 反應(yīng)器中和的積累（圖4d）。而R2 后續(xù)的微氧條件重新激活了WT14 的反硝化活性，從而促進了和的還原，因此R2中有著較低的和積累量。此外，R1和R2反應(yīng)器的COD 去除率相差不大，分別為97.4%和98.2%，這說明菌株WT14 對COD的去除并不受DO 濃度變化的影響，這與Yan 等[18]的結(jié)果一致。

圖3 菌株WT14對養(yǎng)殖廢水中氮和COD的去除Figure 3 Removal of nitrogen and COD in breeding wastewater by strain WT14

圖4 固定床反應(yīng)器對養(yǎng)殖廢水中氮和COD的去除Figure 4 Removal of nitrogen and COD in breeding wastewater from a fixed-bed reactor

異養(yǎng)硝化-好氧反硝化菌有著同步硝化反硝化的天然優(yōu)勢，但是以前研究都過度著重于對的去除，而忽視了TN的去除[19]，如接種Bacillus methylotrophicusL7 的膜生物反應(yīng)器中的去除率能達到77.5%，但是TN 去除率僅有52.0%[20]；Alcaligenes faecalisNR的去除率為72.4%，而TN去除率為64.2%[21]；Acinetobacter calcoaceticusN7 的去除率為99.2%，而TN 去除率為67.1%[22]。這主要是由于HN-AD 菌的異養(yǎng)硝化和好氧反硝化相關(guān)酶對DO 的敏感性不同，這就導(dǎo)致HN-AD 菌在高DO 條件下處理高廢水時雖然有著較高的去除率，但是卻有著或的積累，從而影響TN 的去除[7]。本次試驗通過好氧-微氧兩級DO 控制顯著改善了這一點，保證去除率的同時，促進了WT14 的反硝化活性，顯著提高了TN 去除率，這對HN-AD菌用于處理高廢水具有重要意義。

3 結(jié)論

（3）好氧-微氧兩級DO 控制能夠顯著提高WT14的TN 去除率，在進水TN、和COD 濃度分別為261～311、253～295 mg·L-1和1 088～1 447 mg·L-1的養(yǎng)殖廢水中，平均去除率達到97.6%、99.3%和98.2%，且?guī)缀鯖]有或的積累，這為HN-AD 菌株處理高污染負荷廢水提供了參考和借鑒。