唐毓瑋 龍凌云 黃秋偉 蘇群 池昭錦 盧家仕 毛立彥 *

摘 ?要：為研究適宜睡蓮花粉離體萌發(fā)的培養(yǎng)基和低溫保存的方法，以睡蓮品種‘默笙和3份原種睡蓮的花粉為試驗(yàn)材料，采用單因素、正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，篩選出最適宜的培養(yǎng)基，觀(guān)測(cè)睡蓮花粉在不同溫度下保存的萌發(fā)率。結(jié)果表明，4種澳系睡蓮花粉的最適培養(yǎng)基的各組分濃度不同，花粉的生活力存在差異，澳洲原生淺色睡蓮與澳洲原生深色睡蓮的花粉生活力較高，分別為43.90%和45.63%;‘默笙睡蓮的花粉生活力次之，為31.84%;‘白巨睡蓮的花粉生活力較低，為9.73%;4種澳系睡蓮花粉均不耐貯藏，不同溫度下保存72 h后萌發(fā)率均為0。本研究結(jié)果可為睡蓮雜交育種的親本選擇、花粉的低溫保存研究提供參考。

關(guān)鍵詞：睡蓮;花粉生活力;離體培養(yǎng);低溫保存中圖分類(lèi)號(hào)：S31??????文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

Pollen Germination in vitro and Cryopreservation Reserch of Anecphya Waterlily

TANG Yuwei¹， LONG Lingyun¹， HUANG Qiuwei¹， SU Qun²， CHI Zhaojin¹， LU Jiashi²， MAO Liyan^1*

1. Guangxi Subtropical Crops Research Institute， Nanning， Guangxi 530001， China; 2. Flowers Research Institute， Guangxi Academy of Agricultural Sciences， Nanning， Guangxi 530007， China

Abstract： The pollens ofNymphaea‘Moshen and three orginalNymphaea accessions?were used as?the test material to study the optimal medium components for the pollen germinationin vitroofNymphaea and the method for prolonging pollen viability at low temperature.?The single factor and orthogonal design were used to select the most suitable medium， and observe the germination rate of the pollens preserved at different temperatures. The optimum medium concentration for the pollens of the four accessions?was different. The pollen viability varied among accessions. The pollen viability ofN. immutabilis subsp. Immutabilis blue formandN. immutabilis subsp. immutabilis purple form was 43.90% and 45.63% respectively， and that ofN.‘Moshen andN.‘Gigantea Albertde Lestangwas 31.84% and 9.73%， relatively. The pollen ofNymphaea was not tolerant to storage， and lost the viability after 72 hours of storage at different temperatures. The results of the study could provide references for parents selection and pollen cryopreservation in hybrid breeding ofNymphaea.

Keywords： Nymphaea; pollen viability;in vitro culture; cryopreservation

DOI： 10.3969/j.issn.1000-2561.2020.07.013

睡蓮是睡蓮科（Nymphaeaceae）睡蓮屬（Ny- mphaea）植物的總稱(chēng)，屬于多年生草本植物^[1]，花色豐富，花態(tài)多樣，群體花期長(zhǎng)，極具觀(guān)賞價(jià)值，在水生園林景觀(guān)中應(yīng)用廣泛。睡蓮屬植物主要以生態(tài)學(xué)為基礎(chǔ)進(jìn)行分類(lèi)，可分為Anecphya、Brachyceras、Hydrocallis、Lotos、Nymphaea（orCastakua）5個(gè)亞屬^[2-5]。Anecphya亞屬睡蓮俗稱(chēng)為澳系睡蓮，因原種主要分布于澳大利亞而得名，澳系睡蓮適宜廣西地區(qū)種植，群體花期長(zhǎng)達(dá)8～9個(gè)月。澳系睡蓮花態(tài)獨(dú)特，花瓣形似荷花，與其他亞屬的睡蓮形態(tài)有明顯差異，是重要的雜交育種材料^[6]。

花粉生活力的強(qiáng)弱是影響雜交育種成敗的重要因素^[7]，授粉前對(duì)植株的花粉生活力進(jìn)行評(píng)價(jià)，選擇花粉生活力較高的親本可以提高育種效率?；ǚ垭x體萌發(fā)法評(píng)價(jià)花粉生活力是目前較為準(zhǔn)確和直觀(guān)的方法，在杜鵑、山茶、月季、海棠等植物的育種研究中均有應(yīng)用^[8-11]。關(guān)于睡蓮花粉的研究較少，楊夢(mèng)飛等^[12]與毛立彥等^[13]的研究均表明，睡蓮花粉離體培養(yǎng)4 h后，萌發(fā)率趨于穩(wěn)定;張慧會(huì)等^[14]研究證明，30 ℃是睡蓮花粉離體萌發(fā)的最佳溫度。不同亞屬的睡蓮廣泛分布在暖溫帶至熱帶地區(qū)^[15]，單朵花期約4～5?d，雜交育種經(jīng)常受地域、花期等因素制約。延長(zhǎng)睡蓮花粉的生活力能有效解決花期不遇、異地授粉等問(wèn)題，而低溫保存是延長(zhǎng)花粉生活力的主要手段^[16]，因此低溫保存研究對(duì)于睡蓮的雜交育種有重要意義。目前，關(guān)于睡蓮花粉低溫保存方面的研究還未見(jiàn)報(bào)道，本研究以澳系睡蓮為試驗(yàn)材料，進(jìn)行花粉離體萌發(fā)試驗(yàn)，篩選較佳的花粉離體萌發(fā)培養(yǎng)基，研究適宜的花粉保存溫度，為雜交育種的親本選擇、種質(zhì)資源的保存提供參考依據(jù)^[17]。

1??材料與方法

1.1材料

試驗(yàn)地點(diǎn)位于廣西壯族自治區(qū)南寧市興寧區(qū)亞熱帶作物研究所睡蓮種質(zhì)資源圃（108.38° E，22.87°N），屬于亞熱帶季風(fēng)氣候，年平均氣溫21.6?℃，年平均降水量約1300 mm。試驗(yàn)地為睡蓮種質(zhì)資源圃，水體無(wú)浮萍、藻類(lèi)等污染，水位平穩(wěn)，水深約40 cm。

以4種澳系睡蓮為試驗(yàn)材料，在花蕾時(shí)期做套袋處理，避免昆蟲(chóng)攜帶花粉干擾試驗(yàn)。隨機(jī)選取長(zhǎng)勢(shì)良好、無(wú)病蟲(chóng)害的植株，在花藥散粉時(shí)，采摘睡蓮花朵帶回實(shí)驗(yàn)室內(nèi)，將成熟花藥中的花粉均勻抖落在干燥培養(yǎng)皿中混勻（4種睡蓮花粉分別置于4個(gè)培養(yǎng)皿中），再將花粉分裝到若干支2?mL離心管中密封保存，用于花粉培養(yǎng)基篩選與花粉保存試驗(yàn)。

1.2方法

1.2.1 ?花粉離體萌發(fā)法 ?取出保存花粉的2?mL離心管，使用移液槍向離心管加入700?μL培養(yǎng)液，置于30?℃培養(yǎng)室，500 lx的光照條件下自然培養(yǎng)，每隔1?h觀(guān)察一次，直至花粉萌發(fā)率穩(wěn)定為止。將離心管輕輕搖勻，用移液槍吸取50?μL花粉液滴在載玻片上，使用Leica DM 2500顯微鏡進(jìn)行鏡檢，使用Image-Pro Plus 6.0軟件統(tǒng)計(jì)視野內(nèi)的花粉總數(shù)、萌發(fā)花粉數(shù)，每個(gè)玻片隨機(jī)選取5個(gè)不重復(fù)的視野，每個(gè)視野花粉數(shù)量不少于40粒，以花粉管長(zhǎng)度大于花粉粒直徑視為萌發(fā)。培養(yǎng)基用水為雙蒸餾水，試驗(yàn)重復(fù)3次。

花粉萌發(fā)率=（視野內(nèi)萌發(fā)花粉數(shù)/視野內(nèi)花粉總數(shù)）×100%

1.2.2 ?培養(yǎng)基篩選??以‘默笙睡蓮的新鮮花粉為材料進(jìn)行單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)，探討蔗糖、MgSO₄、H₃BO₃、KH₂PO₄、CaCl₂·2H₂O對(duì)花粉萌發(fā)的影響，其意義在于縮小正交試驗(yàn)因素水平的篩選范圍。參照張瑞等^[18]的方法，以BK培養(yǎng)基^[7]（100?g/L蔗糖、100?mg/L H₃BO₃、300?mg/L CaCl₂·2H₂O、200?mg/L MgSO₄、100?mg/L KH₂PO₄）作為基本培養(yǎng)基，在探討每個(gè)影響因素時(shí)，設(shè)置不同濃度梯度，其余因素均以BK培養(yǎng)基為假設(shè)最適值。

蔗糖設(shè)6個(gè)濃度梯度：50、100、150、200、250、300 g/L;MgSO₄設(shè)6個(gè)濃度梯度：100、200、300、400、500、600 mg/L;H₃BO₃設(shè)6個(gè)濃度梯度：50、75、100、125、150、175 mg/L;KH₂PO₄設(shè)6個(gè)濃度梯度：100、200、300、400、500、600?mg/L;CaCl₂·2H₂O設(shè)6個(gè)濃度梯度：100、200、300、400、500、600?mg/L。以雙蒸餾水為培養(yǎng)基作陰性對(duì)照，以‘默笙睡蓮花露^[19]作陽(yáng)性對(duì)照（睡蓮花朵第1天盛開(kāi)時(shí)，柱頭上會(huì)分泌花露，以接收昆蟲(chóng)所攜帶的花粉）。

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以蔗糖（25、50、75、100 g/L）、MgSO₄（150、200、250、300 mg/L）、H₃BO₃（75、100、125、150 mg/L）、KH₂PO₄（100、200、300、400 mg/L）、CaCl₂·2H₂O（300、400、500、600?mg/L）進(jìn)行5因素4水平共16個(gè)組合L₁₆（4⁵）的正交試驗(yàn)。參試材料進(jìn)一步擴(kuò)增至4種，每種材料進(jìn)行3次重復(fù)試驗(yàn)，依據(jù)花粉萌發(fā)率篩選出澳系睡蓮花粉的最佳萌發(fā)培養(yǎng)基。

1.2.3 ?花粉保存??以上述干燥的花粉作為試驗(yàn)材料，每1 g分裝于2 mL離心管內(nèi)密封保存，分別置于常溫（CK）、4、?20、?40、?70 ℃的密閉黑暗條件下保存。每隔24、48、72 h，取1支離心管的花粉進(jìn)行離體培養(yǎng)萌發(fā)。分別選用4種澳系睡蓮對(duì)應(yīng)的最佳培養(yǎng)基，觀(guān)測(cè)花粉的離體萌發(fā)率。試驗(yàn)操作步驟、培養(yǎng)時(shí)間與條件、統(tǒng)計(jì)方法與上述方法相同。每種澳系睡蓮進(jìn)行3次重復(fù)試驗(yàn)。

1.3數(shù)據(jù)處理

采用Image-Pro Plus 6.0軟件統(tǒng)計(jì)每個(gè)視野睡蓮花粉的萌發(fā)率，采用Excel 2013 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與制圖，采用SPSS 18.0軟件進(jìn)行方差分析。

2??結(jié)果與分析

2.1不同培養(yǎng)基組分對(duì)花粉萌發(fā)率的影響

2.1.1 ?蔗糖濃度對(duì)花粉萌發(fā)的影響??陰性對(duì)照（雙蒸餾水處理）的花粉萌發(fā)率為0;陽(yáng)性對(duì)照（睡蓮花露處理）的萌發(fā)率為14.33%。從圖1A可以看出，低濃度的蔗糖更適宜‘默笙睡蓮花粉的萌發(fā)，濃度在50 g/L時(shí)，花粉萌發(fā)率達(dá)到試驗(yàn)范圍內(nèi)最高值20.12%，高于陽(yáng)性對(duì)照。隨著蔗糖濃度的提高，花粉萌發(fā)率顯著下降。方差分析結(jié)果表明，當(dāng)蔗糖濃度達(dá)到200?g/L以上時(shí)，花粉萌發(fā)率較低，且無(wú)顯著差異。依據(jù)單因素試驗(yàn)的結(jié)果，可將蔗糖濃度進(jìn)一步精確調(diào)整至25、50、75、100 g/L進(jìn)行正交試驗(yàn)。

2.1.2 ?其余因子的濃度對(duì)花粉萌發(fā)的影響 ?與不同濃度的蔗糖處理相比，H₃BO₃、MgSO₄、KH₂PO₄、CaCl₂·2H₂O的濃度對(duì)‘默笙花粉萌發(fā)的影響規(guī)律不明顯，不同濃度范圍表現(xiàn)出不同的結(jié)果。

不同小寫(xiě)字母表示在0.05水平下差異顯著。

Different letters indicate significant difference at the 0.05 level.

由圖1B可知，H₃BO₃濃度為50 mg/L時(shí)，花粉萌發(fā)率最低（8.59%），當(dāng)濃度上升至75?mg/L時(shí)，萌發(fā)率顯著提升至最高（21.59%），之后隨著H₃BO₃濃度的提高，萌發(fā)率緩慢下降。方差分析結(jié)果表明：當(dāng)H₃BO₃濃度為75?mg/L時(shí)，花粉萌發(fā)率顯著高于50、150、175 mg/L的H₃BO₃處理。

由圖1C可知，MgSO₄的濃度從100 mg/L提升至200?mg/L時(shí)，花粉萌發(fā)率顯著提升，從10.57%提升至最高（16.11%）。當(dāng)濃度超過(guò)200?mg/L以上時(shí)，‘默笙的花粉萌發(fā)率隨著濃度的提高呈緩慢下降的趨勢(shì)。方差分析表明：當(dāng)MgSO₄濃度為200?mg/L時(shí)，‘默笙花粉的萌發(fā)率顯著高于100、600?mg/L MgSO₄的處理。

由圖1D可知，當(dāng)KH₂PO₄的濃度在200～600?mg/L時(shí)，花粉萌發(fā)率呈現(xiàn)中間高、兩頭低的分布趨勢(shì)。方差分析結(jié)果表明：當(dāng)KH₂PO₄濃度為400?mg/L時(shí)，‘默笙睡蓮花粉的萌發(fā)率顯著高于其他處理，而100?mg/L處理的花粉萌發(fā)率與300、500、600 mg/L處理無(wú)顯著差異。

由圖1E可知，300、600 mg/L的CaCl₂·2H₂O適宜‘默笙花粉的萌發(fā)，萌發(fā)率分別為16.11%、13.52%。方差分析顯示：300、600?mg/L?CaCl₂·2H₂O的2個(gè)處理之間無(wú)顯著差異，且花粉萌發(fā)率顯著高于其他處理。

2.2正交試驗(yàn)各處理對(duì)澳系睡蓮花粉萌發(fā)的影響

正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)組合及結(jié)果如表2所示，各處理對(duì)4種澳系睡蓮花粉萌發(fā)率的影響不同。其中，‘默笙的9號(hào)處理平均花粉萌發(fā)率最大，達(dá)到31.84%，顯著高于除8號(hào)處理外的其他處理的花粉萌發(fā)率（P<0.05）;澳洲原生淺色睡蓮的10號(hào)處理與澳洲原生深色睡蓮的8號(hào)處理的花粉萌發(fā)率均顯著高于同類(lèi)別中其他處理的平均花粉萌發(fā)率（P<0.05），平均花粉萌發(fā)率分別達(dá)到43.90%和45.63%;‘白巨睡蓮的5號(hào)處理花粉萌發(fā)率相對(duì)較高，但與1號(hào)、4號(hào)、8號(hào)、16號(hào)處理的平均花粉萌發(fā)率差異不顯著（圖2）。

注：括號(hào)中的數(shù)字分別代表正交設(shè)計(jì)中4個(gè)水平的處理;不同小寫(xiě)字母表示在0.05水平下差異顯著。

Note： Numbers in brackets represent four levels of processing in orthogonal design. Different lowercase letters indicate significant difference at?the?0.05 level.

A：‘默笙花粉;B：澳洲原生淺色睡蓮花粉;C：澳洲原生深色睡蓮花粉;D：‘白巨睡蓮花粉

A： The pollen ofN. ‘Moshen; B：?The pollen ofN. immutabilis subsp. immutabilis blue form; C： The pollen ofN. immutabilis subsp. immutabilis purple form; D： The pollen ofN.‘Gigantea Albertde Lestang.

2.3不同保存條件對(duì)花粉離體萌發(fā)率的影響

由圖3可知，隨著花粉保存時(shí)間的增加，萌發(fā)率大幅度下降。?70?℃保存的花粉24 h以后花粉萌發(fā)率下降至0。常溫、4、?20、?40?℃保存的花粉72 h以后萌發(fā)率下降至0?；ǚ墼??℃條件下保存效果相對(duì)較好，24?h后的萌發(fā)率由31.84%下降至18.88%;48 h后，萌發(fā)率進(jìn)一步降至4.32%。花粉在4?℃條件下保存24 h和48 h時(shí)的萌發(fā)率均高于其他溫度處理，表明‘默笙澳系睡蓮的花粉相對(duì)適合在4?℃條件下保存。

如圖4所示，‘白巨睡蓮花粉的初始萌發(fā)率較低，花粉隨著保存時(shí)間的增加，萌發(fā)率呈下降趨勢(shì)。?70?℃條件下保存24 h，萌發(fā)率為0;常溫條件下保存48?h，花粉無(wú)萌發(fā);?4、?20、?40?℃條件下保存72?h，萌發(fā)率降至0?；ǚ墼??℃條件下保存24?h，萌發(fā)率小幅度下降，由9.73%降至9.05%;48?h后，萌發(fā)率大幅度降至2.61%?；ǚ墼诔?、?20、?40、?70?℃下保存24?h，萌發(fā)率均大幅度下降，分別為2.71%、3.66%、2.08%、0。結(jié)果表明‘白巨睡蓮在4?℃條件下可保存24 h。

由圖5可知，澳洲原生淺色睡蓮的花粉隨著保存時(shí)間的增加，萌發(fā)率大幅度下降，不同溫度下保存24 h后，萌發(fā)率降至10%以下，48 h后均下降至2%以下，72 h后萌發(fā)率為0?；ǚ墼? ℃下處理效果相對(duì)略好，24 h后萌發(fā)率由43.90%下降至7.02%，略高于其他的溫度處理;48 h后，萌發(fā)率降至1.65%?；ǚ墼?20?℃條件下保存24?h，萌發(fā)率由44.90%下降至7.02%，僅次于4℃的處理;48?h后，萌發(fā)率降至1.81%，略高于其他的溫度處理。

如圖6所示，澳洲原生深色睡蓮花粉隨著保存時(shí)間的增加，萌發(fā)率大幅下降。在常溫、?20、?40、?70?℃條件下保存48 h，萌發(fā)率下降至0?；ǚ墼??℃下保存效果相對(duì)略好，萌發(fā)率略高于其他溫度處理，但花粉生活力仍然大幅下降，保存至24 h，萌發(fā)率由45.63%下降至15.60%，48 h后萌發(fā)率進(jìn)一步下降至1.52%，72?h后萌發(fā)率為0。

3討論

蔗糖是影響植物花粉萌發(fā)的重要因素，為花粉萌發(fā)和花粉管生長(zhǎng)提供能源物質(zhì)，同時(shí)維持著花粉細(xì)胞外界環(huán)境的滲透壓^[20-22]，H₃BO₃能增加花粉對(duì)糖的吸收、運(yùn)轉(zhuǎn)和代謝，形成糖硼酸復(fù)合體^[23-24]，Ca²⁺的動(dòng)態(tài)平衡影響花粉的萌發(fā)與花粉管的頂端生長(zhǎng)^[25]。本研究中，蔗糖的單因素和正交試驗(yàn)結(jié)果表明，50、75?g/L的蔗糖配適宜的B³⁺、Ca²⁺、K⁺、Mg²⁺分別對(duì)4種澳系睡蓮花粉萌發(fā)有較好的促進(jìn)作用。但是B³⁺、Ca²⁺、K⁺、Mg²⁺的單因素試驗(yàn)與正交試驗(yàn)結(jié)果不完全吻合。例如，在單因素試驗(yàn)的BK培養(yǎng)基中，75 mg/L?H₃BO₃處理的‘默笙花粉萌發(fā)率最高，而在正交試驗(yàn)的9號(hào)培養(yǎng)基中，125?mg/L H₃BO₃處理的‘默笙花粉萌發(fā)率更高，其原因可能是各因素存在交互作用，H₃BO₃與不同濃度的蔗糖、Ca²⁺、K⁺、Mg²⁺互作產(chǎn)生了不一樣的效應(yīng)。毛立彥等^[13]對(duì)‘保羅蘭睡蓮花粉的研究發(fā)現(xiàn)，蔗糖、CaCl₂、H₃BO₃對(duì)睡蓮花粉萌發(fā)存在極顯著的交互作用;常海龍等^[26]研究表明，在硼酸、蔗糖、硝酸鈣、硫酸鎂4個(gè)因素中，蔗糖對(duì)甘蔗花粉萌發(fā)的影響最大，硼酸次之，它們對(duì)花粉管的生長(zhǎng)最為關(guān)鍵。4種澳系睡蓮花粉的最適培養(yǎng)基的各組分濃度不同，合理配比可以增加花粉的萌發(fā)率。通過(guò)花粉離體萌發(fā)法，可以直觀(guān)、有效地評(píng)價(jià)花粉生活力，在睡蓮的雜交育種過(guò)程中，對(duì)于父本材料的篩選有指導(dǎo)意義。在本研究中，‘白巨睡蓮的花粉生活力較低，不適宜作為父本育種材料。

低溫保存可以降低花粉呼吸作用、水分代謝、延長(zhǎng)花粉生活力^[27]，是解決花期不育、異地授粉的主要手段。聶超仁等^[28]研究表明，鐘花櫻花的花粉可在?20、?80?℃條件下保存150 d仍保持20%以上的萌發(fā)率;吳月亮等^[29]研究證明，?80?℃超低溫條件保存文冠果花粉1年，花粉萌發(fā)率接近50%，而常溫條件下僅能保存15?d。本試驗(yàn)中，4種澳系睡蓮的花粉在4?℃下保存相對(duì)較好，但72 h后花粉均喪失生活力，仍然無(wú)法解決睡蓮雜交育種中異地授粉、跨花期授粉等問(wèn)題。

花粉含水量是影響花粉低溫保存時(shí)間長(zhǎng)短的因素，在低溫冷凍過(guò)程中，含水量過(guò)高，在低溫下細(xì)胞內(nèi)結(jié)冰過(guò)多，造成細(xì)胞膜受損，影響保存后的生活力^[30]。趙嬋璞等^[31]研究表明，未干燥的有斑百合花粉?80?℃保存480?d后萌發(fā)率下降至2.3%，經(jīng)過(guò)8 h干燥處理的花粉（含水量21.3%）?80?℃貯藏720?d后，萌發(fā)率為20.7%。時(shí)婷婷等^[32]發(fā)現(xiàn)，經(jīng)干燥處理的‘索邦和‘西伯利亞百合新鮮花粉超低溫保存420?d后的花粉萌發(fā)率分別為60.12%和58.02%，而CK（未干燥的花粉）萌發(fā)率僅為3.20%和2.21%。本試驗(yàn)沒(méi)有考慮澳系睡蓮花粉的含水量對(duì)花粉低溫保存的影響，有待后續(xù)進(jìn)一步研究。

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