押輝遠 陳葉 張巖松 許啟泰

摘 ?要：檳榔（Areca catechuL.）果實是四大南藥之一。檳榔果的研究主要集中在生理生化、生防菌、有效成分及藥理、加工和利用等方面，對檳榔果的發(fā)育及其次生物質(zhì)形成的分子機制尚不清楚。本研究對不同發(fā)育時期的檳榔果皮和果核進行轉(zhuǎn)錄組測序，鑒定檳榔果不同發(fā)育時期的關(guān)鍵基因，以探討果實發(fā)育相關(guān)基因的表達特征及次生物質(zhì)形成有關(guān)的基因調(diào)控。結(jié)果顯示，檳榔果皮中檢測到4491個差異基因，其中617個差異基因共參與了111條KEGG代謝通路，生物過程代謝類有82個通路，共257個差異基因被注釋，參與次生代謝途徑共有5個，共27個差異基因。檳榔果核中檢測到5443個差異基因，其中898個差異基因共參與了118條通路，466個差異基因被注釋在生物代謝類通路上，共涉及89條通路，參與次生代謝相關(guān)的基因有53個，參與次生代謝途徑共7條。進一步分析表明：隨著果實的發(fā)育，果皮中80%次級代謝通路差異相關(guān)基因呈下調(diào)表達趨勢;而果核中71.4%次級代謝通路差異相關(guān)基因呈上調(diào)表達趨勢。本研究結(jié)果在轉(zhuǎn)錄組水平揭示了檳榔果發(fā)育的生物學過程，發(fā)現(xiàn)了不同時期檳榔果皮和果核中次級代謝相關(guān)調(diào)控基因表達的變化規(guī)律，也為檳榔的遺傳育種研究奠定了基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：檳榔;果實發(fā)育時期;轉(zhuǎn)錄組中圖分類號：S31??????文獻標識碼：A

Analysis of Transcriptome Characteristics of ArecaatDifferent Developmental Stages

YA Huiyuan¹， CHEN Ye¹， ZHANG Yansong¹， XU Qitai^1，2

1. School of Food and Medicine， Luoyang Normal University， Luoyang， Henan 471934，?China; 2. Hainan Green Areca Science &?Technology Development Co.， Ltd.， Dingan， Hainan 571200， China

Abstract： Areca（Areca catechu L.）?is?one of the four primary medicinal plants in south China.?In the study， the high-throughput sequencing technology was used to sequence the transcriptome of the peel and kernel in different periods to find differentially expressed genes in different developmental stages. Among the peels， 4491 differential genes were divided， of which 617 differential genes were involved in 111 KEGG metabolic pathways，257 differential genes with 82 pathways in the biological process metabolism class， and a total of 27 genes with 5 genes involved in the secondary metabolic pathway. There were 5443 differential genes in the betel nut kernel， according to the KEGG pathway annotation results， 898 differential genes were involved in 118 pathways， 466 differential genes were annotated on biological metabolic pathways for 89 pathways， 53 genes involved in secondary metabolism with 7 secondary metabolic pathways involved. Further analysis showed that with the development of fruit， 80% of the secondary metabolic pathways in the pericarp showed a down-regulated expression of the genes， while 71.4% of the secondary metabolic pathways in the kernel showed up-regulated expression. The results of the study preliminarily revealed the overall characteristics of the transcriptome of different tissues and different developmental stages of areca nut， and found that the expression of secondary metabolism-related regulatory genes in betel nut and pit were observed in different stages， which was the medicinal development and secondary of betel nut.

Keywords： Areca catechuL.;?fruit development period; transcriptome

DOI： 10.3969/j.issn.1000-2561.2020.07.001

檳榔（Areca catechuL.）是棕櫚科檳榔屬常綠喬木，廣泛分布于南亞和東南亞等國家^[1]。在我國，檳榔主要種植于云南、海南和臺灣等地，種植面積居世界第五，產(chǎn)量居世界第三，是我國熱帶、亞熱帶地區(qū)僅次于橡膠的第二大產(chǎn)業(yè)^[2-4]。檳榔果營養(yǎng)價值豐富，是一種天然的藥食兩用食品，被稱為四大南藥之首^[5]。

目前已從檳榔中分離鑒定出生物堿、黃酮類、單寧、三萜類、類固醇、脂肪酸等多種化學成分。生物堿具有顯著的生物活性，有驅(qū)蟲、消積、利氣利水、利濕除疸等功效^[6]。植物生物堿分為萜類吲哚生物堿、哌啶生物堿、芐基異喹啉生物堿、茛菪堿和煙堿、嘌呤生物堿等。已有研究表明，檳榔堿是檳榔中的主要生物堿，屬于哌啶類生物堿，其含量為0.3%～0.7%^[7-8]。目前，國內(nèi)外對檳榔生物堿的研究主要集中在檳榔堿及其衍生物的分離鑒定與藥理、生理作用、免疫等方面^[5]?，F(xiàn)代醫(yī)學研究表明，檳榔堿在促進胃腸道運動、抗腫瘤、鎮(zhèn)痛、消炎、抗氧化、保護心血管系統(tǒng)等方面均有作用^[1]。

迄今為止，檳榔堿及其多種衍生物已被分離和鑒定^[9]。檳榔的生物堿含量與其果實成熟度相關(guān)^[10]，成熟果胚乳中的檳榔堿含量高于青果胚乳，而成熟果果皮的含量低于青果果皮^[11]。不同發(fā)育時期檳榔花序的檳榔堿含量也存在顯著差異，其含量隨著檳榔花的成熟而不斷降低^[12]。然而，不同的檳榔品種由于成分也有較大差異，所以其藥用成分含量差異也較大，這種差異性極大地影響了檳榔用于中藥的藥效穩(wěn)定性^[13-15]。關(guān)于檳榔生物堿等次級代謝產(chǎn)物生物合成的遺傳控制和分子調(diào)控至今還不清楚，這種狀況極大地阻礙了檳榔新品種的選育和藥用成分的有效利用。

轉(zhuǎn)錄組測序能夠從整體水平研究基因表達量以及基因結(jié)構(gòu)，揭示特定生物學過程中的分子機理，目前已廣泛應用于基礎(chǔ)研究、臨床診斷、藥物研發(fā)和分子育種等領(lǐng)域。檳榔果是藥食兩用的組織部位，研究檳榔果果實發(fā)育的遺傳基礎(chǔ)、果實內(nèi)次生物質(zhì)合成的分子調(diào)控，將十分有助于檳榔分子育種的快速發(fā)展。本研究對海南檳榔的檳榔果皮和檳榔果核進行轉(zhuǎn)錄組測序，分析篩選不同時期果皮和果核的差異基因，探究檳榔果生長發(fā)育過程中生物堿等次級代謝產(chǎn)物的分子調(diào)控機理。

1??材料與方法

1.1材料

本研究于海南省定安縣采集坐果30 d和坐果180 d的檳榔（圖1）作為實驗材料用于轉(zhuǎn)錄組測序，每組樣品設置3個實驗重復（表1）。

1.2方法

1.2.1 ?檳榔轉(zhuǎn)錄組RNA提取及轉(zhuǎn)錄組測序??材料總RNA提取方法參照天根（TIANGEN）公司的TRNzol Universal總RNA提取試劑使用說明書，分別提取檳榔果的果皮和果核的總RNA。用安捷倫2100系統(tǒng)檢測總RNA完整性，Qubit?RNA測定試劑盒純度質(zhì)量，將樣品送至百邁客生物公司在Illumina Hiseq平臺進行轉(zhuǎn)錄組的測序。

1.2.2??檳榔轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的功能注釋和代謝通路分析??使用BLAST^[16]軟件將Unigene序列與NR^[17]、Swiss-Prot^[18]、Gene Ontology（GO）^[19]、Clusters of Orthologous Groups（COG）^[20]、euKaryotic Orthologous Groups（KOG）^[21]、eggNOG?4.5^[22]、Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes（KEGG）^[23]數(shù)據(jù)庫比對，使用KOBAS?2.0軟件^[24]得到Unigene在KEGG中的KEGG Orthology結(jié)果，預測Unigene的氨基酸序列后，使用HMMER^[25]軟件與Protein family（Pfam）^[26]數(shù)據(jù)庫比對，獲得Unigene的注釋信息。

1.2.3??檳榔轉(zhuǎn)錄組表達差異分析??將皮爾遜相關(guān)系數(shù)r（pearson correlation coefficient）作為樣品間相關(guān)性的評估指標^[27]。r²越接近1，說明2個樣品的相關(guān)性越強。采用DESeq^[28]進行樣品組間的差異表達分析，獲得2個條件之間的差異表達基因集;在差異表達分析過程中采用了公認有效的Benjamini-Hochberg方法對原有假設檢驗得到的顯著性P值（P-value）進行校正，并最終采用校正后的P值，即False Discovery Rate（FDR）作為差異表達基因篩選的關(guān)鍵指標，以降低對大量基因的表達值進行獨立的統(tǒng)計假設檢驗帶來的假陽性。在篩選過程中，將FDR小于0.01且差異倍數(shù)Fold Change（FC）大于或等于2作為篩選標準。其中，F(xiàn)C表示兩樣品（組）間表達量的比值。

1.2.4??差異基因富集分析與關(guān)鍵功能基因篩選??差異表達基因GO功能富集，差異表達基因COG分類，差異表達基因KEGG注釋，差異表達基因KEGG通路富集分析，差異表達基因蛋白互作網(wǎng)絡。

2??結(jié)果與分析

2.1轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)統(tǒng)計

選擇坐果30?d和180?d的檳榔果果皮和果核各3次重復，共12個樣品，獲得104.78?Gb Clean Data，各樣品Clean Data均達到8.73?Gb，Q30堿基百分比在88.78%及以上（表2）。

轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)集已保藏在NCBI SRA數(shù)據(jù)庫中，編號：PRJNA590547。

組裝后共獲得259?401條轉(zhuǎn)錄本序列，平均長1779.75?bp，N50長2827?bp。獲得94?562條轉(zhuǎn)錄本序列組裝單基因序列，其中長度在1?kb以上的Unigene有31?381條，對轉(zhuǎn)錄本序列組裝單基因序列進行功能注釋，包括與NR、Swiss-Prot、KEGG、COG、KOG、GO和Pfam數(shù)據(jù)庫的比對，共獲得35?806條單基因序列的注釋結(jié)果（表3）。

2.2單基因功能注釋

通過BLAST軟件將Unigene序列與NR、Swiss-Prot、GO、COG、KOG、eggNOG?4.5、KEGG數(shù)據(jù)庫比對，共得到35 806個基因獲得注釋（表4）。有8664（24.20%）條基因在COG數(shù)據(jù)庫中獲得了注釋，有17?155（47.91%）條基因在GO數(shù)據(jù)庫中獲得了注釋，有10 510（29.35%）條基因在KEGG數(shù)據(jù)庫中獲得了注釋，有17 917（50.04%）條基因在KOG數(shù)據(jù)庫中獲得了注釋，有18?072（50.47%）條基因在Pfam數(shù)據(jù)庫中獲得了注釋，有17 224（48.10%）條基因在Swiss-Prot數(shù)據(jù)庫中獲得了注釋，有30 231（84.43%）條基因在eggNOG?4.5數(shù)據(jù)庫中獲得了注釋，有34 334（95.89%）條基因在NR數(shù)據(jù)庫中獲得了注釋。

2.3檳榔果皮不同發(fā)育時期差異表達基因篩選和富集分析

以AcF3為實驗組，AcF1為對照組，共篩選到4491個差異基因，上調(diào)差異基因1991個，下調(diào)差異基因2500個。1563個差異基因在GO功能得到注釋，共分成3大類，45個小類。生物學過程（biological process）主要涉及細胞過程、代謝過程、單一機體過程、應激反應和生物調(diào)節(jié)5種生物學過程;細胞組分（cellular components）主要涉及細胞核、細胞器和質(zhì)膜3種細胞組分;分子功能（molecular function）主要涉及蛋白結(jié)合和催化活性2種分子功能（表5）。

一般認為，經(jīng)過校正的P值（P-FDR）≤0.05 時，此GO功能存在顯著富集情況。在檳榔果皮差異基因的GO注釋結(jié)果顯示，生物學過程中差異基因顯著有單一生物體過程、生物調(diào)節(jié)、細胞成分的組織或者生物合成、信號、多生物過程、免疫生物進程和生物粘附。細胞組分中細胞器、細胞器部分、大分子復合物、細胞外區(qū)和細胞連接的差異基因有顯著差異。分子功能的催化活性、結(jié)構(gòu)分子活性和轉(zhuǎn)運活性的差異基因數(shù)有顯著差異。

將果皮差異基因與KEGG數(shù)據(jù)庫進行比對，共有617個差異基因注釋在111個通路上，包括138個上調(diào)表達基因，479個下調(diào)表達基因。KEGG生化代謝通路共分成5個生物過程，包括代謝（metabolism）、遺傳信息過程（genetic informa tion processing）、細胞學過程（cellular processes），環(huán)境信息過程（environmental information processing）和有機體系統(tǒng)（organismal systems）。

代謝類通路共257個差異基因被注釋，參與了82個通路，主要涉及氨基酸代謝、碳水化合物代謝、能量代謝、脂質(zhì)代謝和其他次級代謝產(chǎn)物的生物合成等。其中，參與次生代謝相關(guān)的基因有27個，參與次生代謝途徑共有5個，苯丙烷生物合成途徑（phenylpropanoid biosynthesis），類黃酮生物合成途徑（flavonoid biosynthesis），芪類、二芳基庚烷和姜醇生物合成途徑（stilbenoid， diarylheptanoid and gingerol biosynthesis），異喹啉類生物堿生物合成途徑（isoquinoline alkaloid biosynthesis），萜類、哌啶和吡啶生物堿合成途徑（tropane， piperidine and pyridine alkaloid biosynthesis）。其中，上調(diào)差異表達只有苯丙烷生物合成途徑，共3個基因包含的酶有4-香豆酸-CoA連接酶、肉桂酰輔酶A還原酶。下調(diào)差異表達基因分布在5個次生代謝途徑中：苯丙烷生物合成途徑，類黃酮生物合成途徑，芪類、二芳基庚烷和姜醇生物合成途徑，異喹啉類生物堿生物合成途徑，萜類、哌啶和吡啶生物堿合成途徑。下調(diào)基因共10個。調(diào)控酶：反式肉桂酸4-單加氧酶、咖啡酰-CoA O-甲基轉(zhuǎn)移酶、雙功能天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶和谷氨酸/天冬氨酸-預苯酸氨基轉(zhuǎn)移酶、伯胺氧化酶;協(xié)同調(diào)控苯丙烷生物合成途徑和萜類、哌啶和吡啶生物堿合成途徑共17個基因，包含β-葡萄糖苷酶、肉桂醇脫氫酶、過氧化物酶、托品酮還原酶I（表6）。

2.4檳榔果核不同發(fā)育時期差異表達基因篩選和富集分析

以AcN3為實驗組，AcN1為對照組，共篩選到5443個差異基因，上調(diào)差異基因2958個，下調(diào)差異基因2485個。這些差異基因有2452個在GO數(shù)據(jù)庫得到注釋，共分成3大類，48個小類。生物學過程（biological process）主要涉及細胞過程、代謝過程、單一機體過程、應激反應和生物調(diào)節(jié)基因5種，其中，呈顯著差異的有單一生物體過程、對刺激的響應、生物調(diào)節(jié)、復制、生物學階段。細胞組分（cellular components）主要涉及細胞核、細胞器和質(zhì)膜3種，細胞器和大分子復合物的差異基因數(shù)有顯著差異。分子功能（molecular function）主要涉及蛋白結(jié)合和催化活性2種，有顯著差異的包含催化活性和轉(zhuǎn)運活性（表7）

將果核差異基因與KEGG數(shù)據(jù)庫進行比對，共有898個差異基因注釋在118個通路上，包括595個上調(diào)表達基因，303個下調(diào)表達基因，其中466個差異基因被注釋在代謝類通路上，共涉及89條通路。

參與次生代謝相關(guān)的基因53個，參與次生代謝途徑共7條，包括咖啡因生物合成途徑（caffeine metabolism），黃酮和黃酮醇生物合成途徑（flavone and flavonol biosynthesis），類黃酮生物合成途徑，異喹啉類生物堿生物合成途徑，苯丙類生物合成途徑，芪類、二芳基庚烷和吡啶生物合成途徑，萜類、哌啶和吡啶生物堿合成途徑。其中，參與上調(diào)表達的基因41個，1個咖啡因生物合成途徑基因，12個苯丙類生物合成途徑基因，15個類黃酮生物合成途徑基因，5個黃酮和黃酮醇生物合成途徑基因，4個異喹啉類生物堿生物合成途徑基因，3個芪類、二芳基庚烷和吡啶生物合成途徑基因，3個萜類、哌啶和吡啶生物堿合成途徑基因，上調(diào)表達涉及的酶有尿酸氧化酶、伯胺氧化酶、4-羥基苯丙酮酸雙加氧酶、3-羥基丁?；?CoA脫氫酶、苯丙氨酸氨裂解酶、反式肉桂酸4-單加氧酶、4-香豆酸-輔酶A連接酶、反式肉桂酸4-單加氧酶、反式肉桂酸4-單加氧酶、查爾酮合成酶、查爾酮異構(gòu)酶類、黃酮3-單加氧酶、類黃酮3，5-羥化酶、白細胞花青素還原酶、花青素還原酶、類黃酮3，5-羥化酶、類黃酮3-單加氧酶、酪氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶、酪氨酸脫羧酶（表8）。

參與下調(diào)表達的基因2個，一個是苯丙類生物合成途徑基因，另一個是萜類、哌啶和吡啶生物堿合成途徑基因。下調(diào)表達涉及的酶為組氨醇-磷酸氨基轉(zhuǎn)移酶。協(xié)同調(diào)控的基因共19個，涉及的酶有雙功能天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶和谷氨酸/天冬氨酸-預苯酸氨基轉(zhuǎn)移酶、過氧化物酶、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶。

3討論

檳榔果是檳榔的藥用部位。本研究利用高通量測序技術(shù)對2個不同時期的檳榔果皮和果核的轉(zhuǎn)錄組進行測序，初步揭示了檳榔轉(zhuǎn)錄組的整體表達特征，獲得了不同時期檳榔果皮和果核中次級代謝相關(guān)調(diào)控基因表達的變化規(guī)律。本研究結(jié)果為檳榔的遺傳多樣性、分子遺傳育種、遺傳進化等研究提供大量的參考信息。

目前，已有研究表明在檳榔果實或種子中分離和鑒定出59種化合物，涉及生物堿、黃酮類化合物、單寧、三萜類和類固醇、脂肪酸等化合物，并證實其生物堿為檳榔藥理活性主要成分^[29-32]。本研究通過轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)對其次級代謝物相關(guān)基因進行了檢索分析，從果皮中檢索到次級代謝相關(guān)差異基因共33個基因，主要涉及苯丙烷生物合成途徑，類黃酮生物合成途徑，芪類、二芳基庚烷和姜醇生物合成途徑，異喹啉類生物堿生物合成途徑和萜類、哌啶和吡啶生物堿合成途徑。從果核中檢索到次級代謝相關(guān)差異基因共78個基因，主要涉及咖啡因生物合成途徑，苯丙烷生物合成途徑，類黃酮生物合成途徑，黃酮和黃酮醇生物合成途徑，芪類、二芳基庚烷和姜醇生物合成途徑，異喹啉類生物堿生物合成途徑和萜類、哌啶和吡啶生物堿合成途徑。在檳榔果皮和果核中分別找到了參與生物堿代謝相關(guān)的差異基因，果皮中參與萜類、哌啶和吡啶生物堿合成途徑的基因有4個（2個基因協(xié)同表達，2個基因呈下調(diào)表達）;果核中參與萜類、哌啶和吡啶生物堿合成途徑的基因為5個（2個基因協(xié)同表達，2個基因呈上調(diào)表達，1個下調(diào)表達）。這些研究對檳榔生物堿的生成調(diào)控機理研究具有重要意義。

有關(guān)檳榔轉(zhuǎn)錄組測序分析的研究目前僅有一則相關(guān)報道。Manimekalai等^[33]對檳榔葉片進行了轉(zhuǎn)錄組分析，在葉片中發(fā)現(xiàn)了7種高度表達的類黃酮和萜類化合物生物合成的酶。本研究在果核中僅檢測到查爾酮異構(gòu)酶、類黃酮3-單加氧酶、白細胞花青素還原酶隨時間的變化呈上調(diào)趨勢。此外，Manimekalai等^[33]在葉片中檢測到泛醌和其他萜類代謝途徑、黃酮類代謝途徑和苯丙氨酸途徑的部分基因呈現(xiàn)高表達量，而本研究中果皮和果核的差異基因所涉及的酶類并沒有找到相應的酶，這可能與所用研究材料不同相關(guān)。

Wang等^[10]在1997年就曾報道過檳榔的生物堿含量與其果實成熟度相關(guān)，劉蕊^[11]的研究結(jié)果顯示，成熟果胚乳中的檳榔堿含量高于青果胚乳，而成熟果果皮的含量低于青果果皮，這與本研究中萜類、哌啶和吡啶生物堿合成途徑差異基因表達的結(jié)果基本一致。根據(jù)表6和表8的統(tǒng)計結(jié)果顯示：隨著果實的發(fā)育，果皮中次級代謝調(diào)控相關(guān)的下調(diào)表達基因數(shù)明顯多于上調(diào)表達的基因，80%次級代謝通路差異相關(guān)基因呈下調(diào)表達趨勢;而果核中的次級代謝調(diào)控相關(guān)基因上調(diào)表達基因數(shù)多于下調(diào)表達的基因，71.4%次級代謝通路差異相關(guān)基因呈上調(diào)表達趨勢。上述比對結(jié)果表明，實驗從轉(zhuǎn)錄組水平很好地驗證了前人的研究結(jié)果，為檳榔生物堿合成的分子調(diào)控機理的下一步研究提供了數(shù)據(jù)支持。

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