謝雨漫 張?zhí)? 蔡燕 張連虎 張冬梅

摘 ?要：稻瘟病菌（Magnaporthe oryzae）是一種在水稻不同生育期均能引起病害的真菌。在真核生物中，蛋白激酶CK2高度保守，包含2個調(diào)節(jié)亞基和2個催化亞基。稻瘟病菌中MoCKb1和MoCKb2分別編碼MoCK2的2個調(diào)節(jié)亞基，MoCKa編碼稻瘟病菌MoCK2的催化亞基。運用反向遺傳學(xué)策略和同源重組原理，對MoCKa-GFP的pull-down實驗結(jié)果中獲得的一個絲氨酸/蘇氨酸磷酸酶MoPpz1進(jìn)行功能分析。經(jīng)過生物信息學(xué)研究分析發(fā)現(xiàn)Ppz1在不同的真菌中具有不同的功能，同時與其他模式真菌的Ppz1蛋白序列具有較高同源性。在獲得基因敲除突變體后，通過表型分析發(fā)現(xiàn)，與野生型Ku80相比，ΔMoppz1突變體菌落的營養(yǎng)生長和產(chǎn)孢量等方面均無明顯差異，但分生孢子的萌發(fā)和附著胞的形成滯后于野生型菌株，且對水稻的致病能力減弱。激光共聚焦顯微分析表明，MoPpz1定位在菌絲、分生孢子和附著胞的細(xì)胞質(zhì)中。綜上所述，蛋白磷酸酶MoPpz1可能參與稻瘟病菌分生孢子萌發(fā)、附著胞形成以及對水稻致病性的調(diào)控。

關(guān)鍵詞：稻瘟病菌;基因敲除;ΔMoppz1;功能分析中圖分類號：S435.111.4+1??????文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A

Functional Analysis of Serine/Threonine Phosphatase MoPpz1?in Magnaporthe oryzae

XIE Yuman， ZHANG Tian， CAI Yan， ZHANG Lianhu， ZHANG Dongmei^*

College of Plant Protection， Fujian Agriculture and Forestry University /?State Key Laboratory of Ecological Pest Control for Fujian and Taiwan Crops， Fuzhou， Fujian?350002， China

Abstract： Magnaporthe oryzae is a fungal pathogen causing blast disease in different stages of rice. In eukaryotes， the highly conserved protein kinase CK2 contains two regulatory subunits and two catalytic subunits. MoCK2，?CK2 homologus in?M. oryzae，is encoding by three genes，?MoCKb1?and MoCKb2?encode two different regulatory subunits， and MoCKa encodes its catalytic subunit. MoPpz1， one of?serine/threonine phosphatase obtained by pull-down assay of MoCKa-GFP inM. oryzae， was researched at its function by reverse?genetic?approache?and homologous recombination principle?in our study. It was found that Ppz1 had different functions in various fungi?by?bioinformatics analysis， and?showed that Ppz1 and?its homolog?proteins in other model fungi had highly?identity?in?the protein sequences.ΔMoppz1mutant?obtained by gene knock-out and genotyping screen， while the mutant was not affected in vegetative growth and conidial production， the mutant showed development delay of conidium from germination to?appressorium and reduced?pathogenicity to rice?after phenotypic assay?comparing with wildtype strain Ku80.?Confocal laser scanning microscopy analysis showed that MoPpz1 was localized in the cytoplasm?of hyphae， conidium and appressorium. In conclusion， the protein phosphatase MoPpz1 may be involved in the regulation of conidial germination， appressorial formation inM. oryzaeand pathogenicity to rice.

Keywords： Magnaporthe oryzae; gene knockout;ΔMoppz1; functional analysis

DOI： 10.3969/j.issn.1000-2561.2020.07.019

在真核細(xì)胞中，蛋白激酶一般負(fù)責(zé)蛋白質(zhì)的磷酸化，而蛋白磷酸酶負(fù)責(zé)蛋白質(zhì)的去磷酸化。它們相反方向的作用不僅共同調(diào)控著蛋白質(zhì)的磷酸化水平，而且調(diào)節(jié)細(xì)胞各種生理活動，具體包括細(xì)胞間通訊、細(xì)胞增殖與分化、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和胞內(nèi)轉(zhuǎn)運等^[1-4]。蛋白的磷酸化主要發(fā)生在3個含有羥基的絲氨酸、蘇氨酸和酪氨酸上。同理，根據(jù)作用底物的位點不同，磷酸酶分為酪氨酸磷酸酶和絲氨酸/蘇氨酸磷酸酶。相比蛋白激酶的研究進(jìn)展情況，目前對蛋白磷酸酶的研究還相對不足^[5-6]。對蛋白磷酸酶進(jìn)行深入研究將有利于從去磷酸化的角度來闡釋細(xì)胞的生理機制。

蛋白激酶CK2是真核生物中一類高度保守的四亞基復(fù)合體，包括2個催化亞基和2個調(diào)節(jié)亞基。在稻瘟病菌中，有3個基因分別編碼蛋白激酶CK2，其中1個基因MGG_03696（命名為MoCKa）編碼CK2的2個催化亞基，另外2個基因MGG_00446（命名為MoCKb1）和MGG_05651（命名為MoCKb2）分別編碼CK2的2個調(diào)節(jié)亞基^[7-8]。本研究對稻瘟病菌MoCKa的pull-down實驗獲得的1個絲氨酸/蘇氨酸磷酸酶MGG_00149展開功能研究。MGG_00149在酵母中的同源蛋白為Ppz1，故將其命名為MoPpz1。Ppz1與磷蛋白質(zhì)磷酸酶家族（PPPs）中常見的PP1相比，Ppz1磷酸酶僅限于真菌^{[6，9，10-11]}。在不同的真菌中，Ppz1具有不同的功能。在釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）中，Ppz1的缺失使酵母耐受鈉離子和鋰離子的毒性增加，從而影響細(xì)胞壁完整性、細(xì)胞周期、翻譯效率和滲透壓穩(wěn)定性等重要的細(xì)胞生理過程^{[9，12-16]}。而裂殖酵母（Schizosaccharomyces pombe）Ppz1調(diào)節(jié)其對鹽的耐受性^[17]。在粗糙脈孢菌（Neurospora crassa）中，Ppz1調(diào)節(jié)耐鹽性、細(xì)胞壁完整性和細(xì)胞周期等^[18]。在白色念珠菌（Candida albicans）中，Ppz1與陽離子平衡、細(xì)胞壁完整性和致病性有關(guān)^[19]。在構(gòu)巢曲霉（Aspergillus nidulans）中，Ppz1雖然不影響耐鹽性和細(xì)胞壁完整性，但與在釀酒酵母（S. cerevisiae）和白色念珠菌（C. albicans）等其他模型生物中一樣，Ppz1缺失都會增加對氧化脅迫的敏感性^[20]。

稻瘟病是世界范圍內(nèi)危害水稻的三大病害之一。稻瘟病菌是闡明植物真菌病害分子基礎(chǔ)的重要模式生物^[21]。因此，運用反向遺傳學(xué)策略，利用同源重組原理，對基因MoPpz1進(jìn)行基因敲除和基因回補;參照野生型，分析ΔMoppz1突變體和ΔMoppz1-Com（敲除和回補）在營養(yǎng)生長、產(chǎn)孢量和對水稻的致病性等生物性狀方面的異同，進(jìn)而闡釋其生物學(xué)功能。通過對該基因功能的研究和分析，以期對稻瘟病菌致病機制研究和稻瘟病防治提供一定的理論基礎(chǔ)。

1 ?材料與方法

1.1 材料

1.1.1 ?供試植物??實驗材料易感病水稻品種CO39，保存于福建農(nóng)林大學(xué)功能基因組學(xué)研究中心（真菌實驗室）。

1.1.2 ?供試菌株和載體??稻瘟病菌野生型菌株Guy11及背景菌株Ku80，基因敲除所獲得的突變體及回補菌株等均保存于福建農(nóng)林大學(xué)功能基因組學(xué)研究中心（真菌實驗室）。帶有潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基團(tuán)（HPH）的載體pBS-HYG用于構(gòu)建ΔMoppz1突變體敲除載體（pBS-HYG-ko）。pKNTG-GFP用于構(gòu)建在Ku80背景下的敲除的ΔMoppz1突變體的回補載體（pKNT-GFP-com）。所有菌株和載體均保存于福建農(nóng)林大學(xué)功能基因組學(xué)中心（真菌實驗室）。

1.1.3 ?試劑及測序??無水乙醇、氯仿及苯酚等常規(guī)試劑均從國藥集團(tuán)化學(xué)試劑（北京）有限公司購買;所用引物均由擎科生物技術(shù)（廣州）有限公司和生工生物工程股份（上海）有限公司生物合成;質(zhì)粒測序由擎科生物技術(shù)（廣州）有限公司完成;凝膠DNA純化回收試劑盒以及質(zhì)粒提取試劑盒均由天根生化科技（北京）有限公司和美基生物科技（廣州）有限公司提供;限制性內(nèi)切酶由諾唯贊生物技術(shù)（南京）有限公司提供;普通Taq酶、KOD plus Neo酶、T4連接酶和多片段無縫克隆酶等均由Takara公司（北京）提供;Southern雜交試劑盒由泰京生物技術(shù)（廈門）有限公司代為訂購。

1.2 ?方法

1.2.1 ?生物信息學(xué)分析??根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）中找到絲氨酸/蘇氨酸蛋白磷酸酶MoPpz1蛋白序列，并在NCBI數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行BLAST對比分析，得到其在各個模式真菌中的同源蛋白，再用MEGA?7.0軟件，采用Neighbor-joining方法構(gòu)建進(jìn)化樹。

1.2.2 ?重組片段的擴增和轉(zhuǎn)化子的篩選??采用同源重組的方法進(jìn)行目的基因敲除。在NCBI數(shù)據(jù)庫（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）中找到目的基因的DNA序列，在其開放閱讀框（ORF）區(qū)域上下游分別選擇長度為1000?bp左右的片段（命名為A、B片段），設(shè)計引物MoPpz1-AF和-AR、MoPpz1-BF和-BR，分別添加合適的酶切位點，進(jìn)行目的基因上下游片段PCR擴增，通過酶切、回收和連接實驗將上下游同源片段連接到有潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基團(tuán)（HPH）標(biāo)簽的載體pBS-HYG的兩端，進(jìn)行基因敲除載體的構(gòu)建。然后，在Ku80背景下，制備原生質(zhì)體，并進(jìn)行原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化，通過潮霉素選擇壓力進(jìn)行轉(zhuǎn)化子的初步篩選。提取稻瘟病菌轉(zhuǎn)化子DNA，引物MoPpz1-OF和-OR擴增MoPpz1部分ORF片段;引物MoPpz1-UA-F和H853擴增A片段上游和潮霉素內(nèi)部片段。ORF擴增不到片段且UA擴增得到片段的轉(zhuǎn)化子，進(jìn)一步經(jīng)過Southern blot驗證確定基因敲除轉(zhuǎn)化子。

在NCBI數(shù)據(jù)庫（https：//www.ncbi.nlm.nih.?gov/）上找到基因ORF區(qū)上游3000?bp的基因序列，然后在網(wǎng)站promoter?2.0（http：//www.cbs.dtu.?dk/services/Promoter/）進(jìn)行啟動子預(yù)測，根據(jù)預(yù)測的結(jié)果、ORF和所選擇的載體進(jìn)行引物設(shè)計和載體構(gòu)建。互補載體構(gòu)建選用多片段無縫克隆方法，將片段分別進(jìn)行擴增后，再用多片段無縫克隆酶將多片段進(jìn)行連接，將構(gòu)建好的載體轉(zhuǎn)入敲除突變體原生質(zhì)體中，經(jīng)分子驗證和熒光檢測獲得正確的回補轉(zhuǎn)化子。該實驗所用引物序列見表1。

1.2.3 ?表型分析??菌落形態(tài)觀察及生長速率的測定：在實驗相關(guān)菌株SYM平板的菌落外緣，用直徑0.5?cm的打孔器打孔，取直徑0.5 cm的菌絲塊，分別接種在新的SYM平板中央，在培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)10?d后，測量并記錄菌落生長的直徑，然后拍照。

產(chǎn)孢量的統(tǒng)計：用2?mL無菌水洗下培養(yǎng)基表面的孢子，再用擦鏡紙過濾到2?mL離心管中后，用無菌水將孢子液定容至2?mL。最后，吸取10?μL孢子液于血球計數(shù)板上，用血球計數(shù)板在顯微鏡下統(tǒng)計孢子數(shù)目。

孢子萌發(fā)率和附著胞形成率的統(tǒng)計：用無菌水收集孢子液并將濃度調(diào)至15×10⁴個/mL左右。

用10?μL無菌水將疏水蓋玻片（Fisher?brand公司產(chǎn)品）固定在載玻片上（防止疏水蓋玻片在實驗過程中隨意滑動），再在疏水玻片表面滴上10?μL孢子液，放在保濕盒中進(jìn)行保濕和黑暗處理，分別在4、8、12?h時在顯微鏡下觀察孢子萌發(fā)率和附著胞形成率并記錄。

水稻致病性測定：用含0.025%?（W/V）?Tween 20的無菌水收集孢子液并將濃度調(diào)至8×10⁴個/mL左右。對3葉1心時期的水稻易感病品種CO39進(jìn)行噴霧接種，黑暗保濕24?h后，光照保濕5～7?d。觀察水稻發(fā)病實際情況后，再對實驗結(jié)果進(jìn)行掃描保存。

以上實驗均重復(fù)3次，每次每個菌株均3個重復(fù)，并根據(jù)實驗所得數(shù)據(jù)進(jìn)行計算和處理。

2 ?結(jié)果與分析

2.1 稻瘟病菌MoPpz1生物信息學(xué)分析

對稻瘟病菌Ppz1與其他不同真菌（鐮刀菌、酵母菌、粗糙脈孢菌和灰霉菌等）Ppz1同源蛋白用MEGA?7.0采用Neighbor-joining構(gòu)建進(jìn)化樹（圖1）。從該進(jìn)化樹可以看出MoPpz1和NcPpz1在同一個分支上，說明這兩者的親緣關(guān)系較近。同時，稻瘟病菌MoPpz1與這些真菌同源蛋白（鐮刀菌、酵母菌、粗糙脈孢菌和灰霉菌等）氨基酸序列比對分析結(jié)果顯示，在不同模式的真菌中，MoPpz1蛋白序列高度保守（圖2）。

2.2 稻瘟病菌MoPpz1基因功能分析

2.2.1 ?稻瘟病菌MoPpz1基因敲除突變體和互補菌株的篩選和驗證??利用帶潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基團(tuán)（HPH）標(biāo)簽的載體pBS-HYG構(gòu)建敲除載體（pBS-HYG-ko），轉(zhuǎn)入菌株Ku80原生質(zhì)體中，經(jīng)過一系列的篩選和驗證，獲得了敲除突變體（圖3，即ΔMoppz1突變體的Southern blot驗證）。同理，把構(gòu)建好的互補載體（pKNT-GFP-com）轉(zhuǎn)入敲除突變體的原生質(zhì)體中，篩選和驗證后，最終獲得互補菌株。

2.2.2 ?菌落生長速度和產(chǎn)孢量統(tǒng)計??根據(jù)對在SYM平板上生長10?d的菌落進(jìn)行半徑測量和拍照，發(fā)現(xiàn)稻瘟病菌MoPpz1基因敲除不影響菌落的生長（圖4）。這說明MoPpz1基因缺失不影響稻瘟病菌的營養(yǎng)生長。同時，對ΔMoppz1突變體的產(chǎn)孢量進(jìn)行了統(tǒng)計，發(fā)現(xiàn)MoPpz1基因的缺失不影響產(chǎn)孢量（表2）。

2.2.3 ?孢子萌發(fā)率和附著胞形成率??通過對野生型、突變體和互補菌株在4、8、12?h不同時間段的孢子萌發(fā)率和附著胞形成率實驗發(fā)現(xiàn)，突變體的孢子萌發(fā)率在萌發(fā)前期滯后于野生型，在萌發(fā)后期和野生型相似，而突變體的附著胞形成在整個發(fā)育時間段均滯后于野生型，實驗結(jié)果表明MoPpz1基因缺失影響稻瘟病菌的孢子萌發(fā)和附著胞形成（表3，表4）。

2.2.4 ?致病性分析??用相關(guān)菌株的孢子懸浮液對活體水稻葉片進(jìn)行致病性分析。通過對水稻病斑觀察發(fā)現(xiàn)（圖5），與野生型產(chǎn)生的典型的梭形病斑相比，突變體影響病斑在水稻葉片上的擴展，突變體產(chǎn)生的病斑多為細(xì)點狀，同時，統(tǒng)計水稻葉片病斑數(shù)量也證明了在ΔMoppz1突變體對水稻進(jìn)行活體噴霧接種后，ΔMoppz1突變體產(chǎn)生的擴展病斑數(shù)量更少（表5）。這些均說明MoPpz1基因缺失影響其對水稻的致病性。

2.2.5 ?定位分析??為了確定稻瘟病菌MoPpz1基因在細(xì)胞內(nèi)的定位情況，構(gòu)建了GFP在N端的載體MoPpz1-GFP，轉(zhuǎn)入野生型的原生質(zhì)體后，經(jīng)過篩選和驗證得到了突變體。激光共聚焦顯微分析確定了該蛋白在菌絲（圖6）、分生孢子（圖7）和附著胞（圖7）的定位均在細(xì)胞質(zhì)中。

3 ?討論

稻瘟病菌中編碼蛋白激酶CK2包括1個催化亞基（MoCKa）和2個調(diào)節(jié)亞基（MoCKb1、

MoCKb2）。該研究中的MoPpz1是通過MoCKa的pull-down實驗中獲得的一系列基因中的一個絲氨酸/蘇氨酸磷酸酶。說明MoPpz1可能和MoCKa之間有互作。通過酵母雙雜交實驗驗證發(fā)現(xiàn)MoPpz1和MoCKa并無直接互作;同時，也驗證了MoPpz1和蛋白激酶CK2?2個調(diào)節(jié)亞基（MoCKb1、MoCKb2）的互作情況，證實MoPpz1與調(diào)節(jié)亞基之間也無直接互作。在細(xì)胞內(nèi)，由于調(diào)節(jié)亞基和催化亞基構(gòu)成全酶發(fā)揮功能，所以可以認(rèn)為它們可能是通過MoCK2全酶或其他組分蛋白或某個接頭蛋白與MoPpz1間接互作。

另外，生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，稻瘟病菌Mo Ppz1與粗糙脈孢菌Ppz1親緣關(guān)系較近，在進(jìn)化上是保守的，但是在不同的真菌中，Ppz1具有不同的功能。例如，在白色念珠菌（C. albicans）和煙曲霉（A. fumigatus）中的Ppz1是決定致病性的因素，而在玉米黑粉菌（Ustilago maydis）中，Ppz1不是決定致病性的因素^[11]。研究發(fā)現(xiàn)稻瘟病菌ΔMoppz1突變體在易感病水稻葉片上多為細(xì)點狀病斑，這也說明稻瘟病菌Ppz1蛋白在對水稻致病性方面發(fā)揮了一定作用。

表型分析結(jié)果顯示稻瘟病菌MoPpz1基因缺失不影響其營養(yǎng)生長和產(chǎn)孢數(shù)量，但是突變體的孢子萌發(fā)率在萌發(fā)前期滯后于野生型，附著胞形成率在整個發(fā)育時間段均滯后于野生型。這表明MoPpz1與稻瘟病菌的孢子萌發(fā)和附著胞形成過程直接相關(guān)。MoPpz1基因敲除突變體進(jìn)行基因回補時，在MoPpz1基因N端融合了1個GFP熒光標(biāo)簽。激光共聚焦顯微分析發(fā)現(xiàn)，無論在菌絲、孢子還是附著胞，MoPpz1均定位在細(xì)胞質(zhì)中。今后的研究中可以進(jìn)一步探索MoPpz1基因敲除突變體對減弱水稻致病性是否與穿透植物細(xì)胞表皮的能力相關(guān);通過水稻葉鞘侵染實驗等進(jìn)行深入研究，從該基因敲除是否影響稻瘟病菌在植物細(xì)胞內(nèi)的侵染生長和拓展的角度，解釋稻瘟病菌MoPpz1基因?qū)λ局虏×p弱，進(jìn)而為稻瘟病菌防治提供一定的理論依據(jù)。

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