吳海維 周娜娜 姜宇 朱曙光 鮑立寧

摘 要：以某工廠處理水剩余污泥為菌種來(lái)源，經(jīng)過(guò)分離、培養(yǎng)，篩選出一株最大耐Pb2+濃度為800 mg/L的耐鉛菌株，命名為J2，應(yīng)用16S rDNA基因測(cè)序，結(jié)合形態(tài)觀察和生理生化特性試驗(yàn)確定其類別，并對(duì)其Pb2+去除特性進(jìn)行初步研究。結(jié)果表明：J2菌株屬于寡養(yǎng)單胞菌屬（Stenotrophomonas）細(xì)菌;其去除鉛的最佳pH值為9、最適接種量為5%、最適溫度為30℃、最佳發(fā)酵時(shí)間為96 h;根據(jù)J2菌株吸附鉛前后掃描電鏡結(jié)果，結(jié)合菌株生長(zhǎng)曲線分析，認(rèn)為J2菌株對(duì)鉛的去除機(jī)理包括前期表面吸附和后期胞內(nèi)累積或轉(zhuǎn)化2種形式。該菌株可為重金屬污染土壤微生物修復(fù)提供菌種資源。

關(guān)鍵詞：土壤重金屬污染;耐鉛菌株;篩選;鑒定;吸附特性;吸附機(jī)理

中圖分類號(hào)：Q815， X172 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A文章編號(hào)：1006-060X（2020）07-0005-04

Abstract： A lead-resistant strain survived in a maximum Pb2+ concentration of 800 mg/L was selected from the excess sludge of a plant and named J2 after isolation and culture. The obtained strain was subjected to 16S rDNA sequencing in succession to morphological observation， and physiological and biochemical charteristics tests. It was identified as Stenotrophomonas sp. based on 16S rDNA sequence similarity analysis. In addition， its Pb2+ removal characteristics was identified. The optimal lead adsorption conditions of this strain are pH 9，? inoculum concentration 5%， 30℃ and incubation 96 h. The repair mechanism of J2 strain is mainly cell surface adsorption at early stage and intracellular enrichment/transformation at late stage based on the analysis of the growth curve and scanning electron microscopy. Our studies confirm that the screened strain J2 has a good adsorption effect on lead and can provide bacteria resources for microbial remediation of heavy metal contaminated soil.

Key words： soil heavy metal pollution; lead-resistant strains; selecting; identification; adsorption characteristics; adsorption mechanism

在自然中大多數(shù)重金屬都以低濃度存在于土壤、水、巖石和生物群中，為生命系統(tǒng)提供必需的營(yíng)養(yǎng)，一旦某種或某幾種重金屬的含量過(guò)高便會(huì)引起毒性。鉛是一種自然普遍存在的金屬，但是因?yàn)槿祟惢顒?dòng)極大地提高了其在環(huán)境中的含量，例如鉛礦開采、使用鉛作為原料的工業(yè)過(guò)程、煤炭和石油的燃燒等活動(dòng)[1]。由于鉛在土壤中的停留時(shí)間長(zhǎng)，易通過(guò)水圈、大氣層影響生物圈，進(jìn)而通過(guò)食物鏈影響人類的健康，因此，土壤中的鉛污染應(yīng)引起人們的重視[2]。

為了保護(hù)環(huán)境，避免人類健康受損害，土壤重金屬污染的修復(fù)是國(guó)內(nèi)外學(xué)者研究的熱點(diǎn)。微生物修復(fù)因?yàn)橘M(fèi)用低、效果好、不會(huì)或很少造成二次污染，逐漸取代了傳統(tǒng)的物理修復(fù)和化學(xué)修復(fù)[3]。筆者擬以從某工廠處理水剩余污泥中篩選出的鉛耐性菌株為材料，應(yīng)用16S rDNA基因測(cè)序，結(jié)合形態(tài)觀察和生理生化特性試驗(yàn)確定其類別，并探索對(duì)其適宜生長(zhǎng)環(huán)境條件，利用掃描電鏡對(duì)其鉛吸附機(jī)理進(jìn)行初步分析，以明確其對(duì)重金屬鉛的吸附機(jī)制，為后期重金屬鉛污染生物修復(fù)的實(shí)際應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料及培養(yǎng)基

菌株篩選土壤樣品采自某工廠處理水剩余污泥。

基礎(chǔ)牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基：牛肉膏3 g/L，蛋白胨10 g/L，氯化鈉5 g/L，加蒸餾水至1 000 mL;調(diào)節(jié)pH值至7.0～7.2;1×105 Pa滅菌20 min。如配置固體培養(yǎng)基添加20 g瓊脂。

選擇培養(yǎng)基：稱取16 g Pb（NO3）2溶于超純水，用容量瓶定容至100 mL，配置成濃度為100 g/L的鉛母液。將配置好的母液加入基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，調(diào)節(jié)至相應(yīng)濃度。

1.2 菌株的分離與篩選

稱取10 g污泥樣品于90 mL無(wú)菌水中，30℃、150 r/min搖床振蕩24～48 h，靜置后取上清液涂布在鉛濃度為200 mg/L的初篩培養(yǎng)基上，30℃培養(yǎng)24 h。在平板上挑選長(zhǎng)勢(shì)較好的菌落進(jìn)行劃線分離純化，將初篩得到的菌株分別接種到不同鉛濃度培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，逐步提高培養(yǎng)基中的鉛濃度（50、100、150… mg/L 逐漸遞增）進(jìn)行復(fù)篩[4]，最終篩選出一株抗性最好的菌株，命名為J2，用于后續(xù)試驗(yàn)。

1.3 菌株的鑒定

1.3.1 菌株形態(tài)學(xué)觀察和生理生化特征鑒定 在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中觀察菌落的形態(tài)、邊緣和顏色等，用革蘭氏染色法染色，在光學(xué)顯微鏡下觀察菌株形態(tài)。通過(guò)糖醇發(fā)酵、甲基紅（M.R）、乙酰甲基甲醇（V.P）、明膠液化、過(guò)氧化氫酶、纖維素分解、乙醇氧化、淀粉水解、七葉靈水解、尿素水解等試驗(yàn)，研究篩選菌株的生理生化特征[5-7]。

1.3.2 菌株16S rDNA的序列分析 采用16S rDNA序列測(cè)定法，委托青島派森諾基因生物科技有限公司進(jìn)行16S rDNA測(cè)序。將所得序列進(jìn)行相似性比對(duì)分析，利用MEGA-X軟件生成系統(tǒng)發(fā)育樹[5]。

1.4 菌株生長(zhǎng)曲線的測(cè)定

挑取篩選菌株單菌落，30℃、150 r/min于液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)24 h，用無(wú)菌移液管分別吸取1 mL菌液接種至50 mL液體培養(yǎng)基中，并在相同條件下將菌液接種至含鉛200 mg/L的培養(yǎng)基中（設(shè)空白對(duì)照），30℃、150 r/min搖床培養(yǎng)，在96 h培養(yǎng)周期里，每2 h取樣1次。在8 000 r/min條件下離心5 min，沉淀的菌體用生理鹽水洗滌3次后，重新懸浮于生理鹽水中，在可見(jiàn)分光光度計(jì)下測(cè)定660 nm處菌體的OD值;上清液經(jīng)稀釋、過(guò)濾后用電感耦合等離子光譜儀測(cè)定鉛濃度，以不接入菌體的空白含鉛培養(yǎng)基為對(duì)照組，計(jì)算鉛去除率[8]。

鉛去除率=×100%

1.5 不同因素對(duì)耐鉛菌株生長(zhǎng)量和對(duì)Pb2+去除能力的研究

以溶液pH值、接種量和吸附溫度為單因素[9]，考察菌株在各條件下的生長(zhǎng)情況和對(duì)鉛的去除效果。首先設(shè)定溶液pH值為5、6、7、8、9，鉛濃度為200 mg/L，接種量為5%，30℃、150 r/min搖床培養(yǎng)24 h，按照上述方法檢測(cè)菌體生長(zhǎng)情況和對(duì)鉛的去除效果。然后依次確定接種量（2%、3%、5%、8%、10%）和培養(yǎng)溫度（20、25、30、35℃）的最佳值。

1.6 掃描電鏡分析

收集吸附鉛前后的菌樣，樣品經(jīng)過(guò)固定、脫水、真空冷凍干燥等步驟，制備超薄菌株切片樣品，置掃描電鏡下觀察，對(duì)篩選菌株吸附鉛的機(jī)理進(jìn)行初步分析[10]。

2 結(jié)果與分析

2.1 耐鉛菌株的篩選與鑒定

在不斷增加培養(yǎng)基的鉛濃度后，最終經(jīng)過(guò)分離與篩選，得到了能在濃度為800 mg/L的含鉛培養(yǎng)基中生長(zhǎng)的菌株，將其命名為J2。

2.1.1 菌株形態(tài)特征 形態(tài)學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)，J2菌株呈黃色，菌株為圓形，表面隆起，有極生鞭毛，其菌落邊緣整齊、有粘性。

2.1.2 菌株生理生化結(jié)果 對(duì)J2菌株進(jìn)行革蘭氏染色，結(jié)果表明其為革蘭氏陰性菌。J2菌株生理生化試驗(yàn)結(jié)果如表1所示，J2菌株可利用葡萄糖、乳糖和蔗糖進(jìn)行發(fā)酵，M.R和V.P試驗(yàn)均呈陽(yáng)性，可分解明膠、七葉靈和淀粉，不能分解纖維素和尿素，能分泌過(guò)氧化氫酶，不能氧化乙醇。

2.1.3 基于16S rDNA基因序列的菌株分子生物學(xué)鑒定 對(duì)J2菌株的16S rDNA進(jìn)行擴(kuò)增，用NCBI Blast程序?qū)⑵唇雍蟮男蛄形募cNCBI 16S數(shù)據(jù)庫(kù)中的數(shù)據(jù)進(jìn)行比對(duì)，初步鑒定J2菌株為寡養(yǎng)單胞菌屬（Stenotrophomonas sp.），系統(tǒng)發(fā)育樹結(jié)果見(jiàn)圖1。

2.2 菌株的生長(zhǎng)曲線測(cè)定

由圖2可知，J2菌株對(duì)鉛的吸附率隨著時(shí)間的延長(zhǎng)、菌體數(shù)目的增加呈上升趨勢(shì)。接種0～5 h菌株處于生長(zhǎng)調(diào)整期，5～36 h處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，36 h后菌株開始進(jìn)入穩(wěn)定期，60 h后進(jìn)入衰亡期。

J2菌株去除培養(yǎng)基中重金屬鉛的過(guò)程，主要表現(xiàn)為2個(gè)階段。第一個(gè)階段是在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期和穩(wěn)定期，去除率隨菌體數(shù)量的增加呈上升趨勢(shì)。當(dāng)菌體生長(zhǎng)進(jìn)入穩(wěn)定期末期和衰亡期時(shí)，鉛去除率變化進(jìn)入第二階段，經(jīng)過(guò)平臺(tái)期后，繼續(xù)持續(xù)增長(zhǎng)。第一階段，J2菌株細(xì)胞表面的化學(xué)基團(tuán)可以吸附重金屬鉛。這個(gè)過(guò)程不需要依靠微生物自身代謝，發(fā)生過(guò)程很迅速，因此表現(xiàn)為菌體數(shù)量和去除率變化保持同步。在第二階段菌體數(shù)量開始下降時(shí)，鉛去除率依然在上升，表明J2菌株還存在著對(duì)鉛的累積或轉(zhuǎn)化作用。這個(gè)過(guò)程J2菌株對(duì)鉛的去除表現(xiàn)為主動(dòng)吸附，即將重金屬由表面轉(zhuǎn)移到內(nèi)部的過(guò)程，該過(guò)程需要菌株細(xì)胞自身代謝產(chǎn)生的能量，因此這一過(guò)程需要一定時(shí)間[11]。

2.3 不同因素對(duì)耐鉛菌株生長(zhǎng)量和對(duì)Pb 去除能力的研究結(jié)果

2.3.1 pH值 不同微生物對(duì)pH值的要求不同，由圖3可知，當(dāng)pH值為9時(shí)，J2菌株生長(zhǎng)情況最好且對(duì)鉛去除率最高。這可能是因?yàn)椋S著pH值的增加，菌體表面更多的負(fù)電官能團(tuán)暴露于液體中，從而有更多的吸附位點(diǎn)吸附重金屬離子鉛。

2.3.2 接種量 由圖4可知，菌株對(duì)鉛的去除率隨著接種量的增加而增加，當(dāng)接種量為5%，其去除率和菌株數(shù)目都達(dá)到最高。隨著接種量的增加，菌體表面對(duì)鉛的吸附位點(diǎn)也增加，因此鉛去除率提高;當(dāng)培養(yǎng)

基一定時(shí)，隨著接種量繼續(xù)增大，培養(yǎng)基無(wú)法提供足夠的碳源和其他養(yǎng)分，導(dǎo)致耐鉛菌株數(shù)量減少。因此當(dāng)接種量大于5%時(shí)，菌體對(duì)鉛去除率和菌體數(shù)目均呈下降趨勢(shì)。

2.3.3 溫 度 由圖5可知，在20～30℃范圍內(nèi)，J2菌

株的生長(zhǎng)情況和對(duì)鉛的去除率隨著溫度的升高而上升，當(dāng)溫度為30℃時(shí)，J2菌株數(shù)目最多，鉛去除率最高。因?yàn)闇囟鹊纳邽榫晡姐U的過(guò)程提供了能量，故提高了菌株的鉛去除率。但當(dāng)溫度超過(guò)30℃時(shí)，過(guò)高的溫度可能影響了菌體的正常代謝，對(duì)菌體細(xì)胞表面的官能團(tuán)和重金屬的結(jié)合產(chǎn)生不利影響，因此J2菌株的生長(zhǎng)量和鉛去除率都呈下降趨勢(shì)。

2.4 J2菌株掃描電鏡和能譜結(jié)果分析

為了研究J2菌株對(duì)鉛的去除機(jī)理，采用掃描電鏡對(duì)吸附鉛前后的菌體進(jìn)行觀察，結(jié)果如圖6所示。從圖6A可以看出，J2菌株的菌體細(xì)胞呈直桿狀，形態(tài)飽滿、輪廓清晰，細(xì)胞表面平整，無(wú)粘附物。相對(duì)于空白組，吸附了鉛的菌體細(xì)胞表面粗糙，細(xì)胞形態(tài)發(fā)生干癟或扭曲變形，并且出現(xiàn)不規(guī)則聚集現(xiàn)象（圖6B）。這表明J2菌株存在著對(duì)鉛的表面吸附作用，所以細(xì)胞表面變粗糙。結(jié)合2.2中生長(zhǎng)曲線的研究結(jié)果，初步推測(cè)J2菌株對(duì)鉛的去除機(jī)理包括表面吸附和胞內(nèi)累積或轉(zhuǎn)化。

3 結(jié) 論

從某工廠處理水剩余污泥中分離篩選出一株耐鉛菌株J2，通過(guò)16S rDNA初步鑒定其為寡養(yǎng)單胞菌屬（Stenotrophomonas）。對(duì)J2菌株的耐受性和吸附能力進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)J2菌株對(duì)重金屬鉛的最大耐受濃度為800 mg/L，在生長(zhǎng)96 h之后對(duì)鉛的去除率可達(dá)76%。

研究不同pH值、接種量和溫度對(duì)J2菌株生長(zhǎng)的影響，結(jié)果表明，J2菌株去除鉛的最佳pH值為9、最適接種量為5%、最適溫度為30℃。

根據(jù)J2菌株吸附鉛前后掃描電鏡結(jié)果，結(jié)合生長(zhǎng)曲線分析，認(rèn)為J2菌株對(duì)鉛的去除機(jī)理包括前期表面吸附和后期胞內(nèi)累積或轉(zhuǎn)化2種形式。

試驗(yàn)篩選的J2菌株對(duì)鉛的去除能力高，可豐富重金屬污染土壤微生物修復(fù)的生物資源，用于低質(zhì)量濃度鉛污染土壤的生物修復(fù)。

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（責(zé)任編輯：張煥裕）