鄭思夢，張濤，江波

(食品科學與技術國家重點實驗室(江南大學)，江蘇 無錫，214122)

D-阿拉伯醇在自然界中主要存在于蘑菇類和地衣類中[1]，具有較低的卡路里含量，可抑制齲菌的生長和產(chǎn)酸[2]，可減少體內(nèi)脂肪組織，其功效類似于可溶性膳食纖維[3]，也可作為藥物中間體合成藥物[4]。因此D-阿拉伯醇在口腔保健，糖尿病患者產(chǎn)品和制藥工業(yè)中具有廣泛應用前景[5-6]。

D-阿拉伯醇的生產(chǎn)可采用自然提取法、化學催化加氫法和微生物發(fā)酵法。由于發(fā)酵法具有條件溫和、成本低、環(huán)境友好等特點，已成為當前研究熱點[7]。目前已報道的能生產(chǎn)D-阿拉伯醇的微生物多為耐高滲酵母[8]。SAHA等[9]利用分離的魯氏接合酵母以葡萄糖為底物發(fā)酵生產(chǎn)D-阿拉伯醇，產(chǎn)量達到83.4 g/L；ZHU等[6]從蜜蜂蜂巢中篩選到1株奧默柯達酵母菌，經(jīng)72 h發(fā)酵后D-阿拉伯醇產(chǎn)量為81.2 g/L；蔡莉等[10]從環(huán)境中分離得到1株柯達屬酵母菌，D-阿拉伯醇產(chǎn)量為82.2 g/L；宋衛(wèi)斌等[11]從花粉中篩選得到1株假絲酵母菌，D-阿拉伯醇產(chǎn)量為86.55 g/L；張麗麗[12]通過富集培養(yǎng)從環(huán)境中篩選出1株D-阿拉伯醇產(chǎn)量為105.41 g/L的巴利漢遜酵母菌，可見目前發(fā)酵法生產(chǎn)D-阿拉伯醇的產(chǎn)量并不理想。為提高D-阿拉伯醇產(chǎn)量，利用基因工程方法通過改變一個或幾個關鍵酶基因的表達來提高產(chǎn)物產(chǎn)量仍存在一定困難，傳統(tǒng)的誘變選育仍是獲得高產(chǎn)菌株的有效方法[3,13]，而多數(shù)情況下化學誘變效果好于物理誘變[14]。

本研究使用硫酸二乙酯誘變處理，經(jīng)過搖瓶發(fā)酵篩選、遺傳穩(wěn)定性驗證獲得D-阿拉伯醇高產(chǎn)菌株，并使用單因素與正交試驗對發(fā)酵培養(yǎng)基成分進行優(yōu)化，以進一步提高產(chǎn)量，為D-阿拉伯醇的工業(yè)化生產(chǎn)奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 菌株

近平滑假絲酵母菌(Candidaparapsilosis)SK26.002，本實驗室保藏，用作本實驗原始菌株。

1.1.2 培養(yǎng)基

平板培養(yǎng)基(g/L)：葡萄糖20，酵母提取物20，瓊脂20，pH 5.0。

種子培養(yǎng)基(g/L)：葡萄糖20，酵母提取物20，pH 5.0。

初始發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L)：葡萄糖200，酵母提取物30，CaCl20.1，F(xiàn)eCl3·6H2O 0.03，pH 4.0。

1.1.3 主要試劑

硫酸二乙酯、硫代硫酸鈉、乙腈及其他常規(guī)試劑(分析純),國藥集團；D-阿拉伯醇標準品,美國Sigma公司。

1.1.4 儀器與設備

HYL-B型恒溫培養(yǎng)搖床，太倉市強樂有限公司；CT88A標準型滅菌器，廈門和譜儀器有限公司；Waters e2695高效液相色譜儀，上海沃特世科技有限公司；發(fā)酵罐，Eppendorf公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 培養(yǎng)方法

平板培養(yǎng)：取甘油管保存的原始菌株或菌懸液接種于平板上，將平板倒置于恒溫培養(yǎng)箱中30 ℃培養(yǎng)24 h，于4 ℃冰箱保藏待用。

種子液培養(yǎng)：挑取單菌落1環(huán)接種于裝有50 mL生長培養(yǎng)基的250 mL搖瓶中，30 ℃、200 r/min培養(yǎng)21 h。

搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)：以4%接種量將種子液接種于裝有50 mL發(fā)酵培養(yǎng)基的250 mL搖瓶中，30 ℃、200 r/min培養(yǎng)96 h。

1.2.2 硫酸二乙酯誘變及突變株篩選

(1)種子生長曲線測定。每隔3 h取種子液，測量菌體OD600。

(2)菌懸液的制備。取對數(shù)期種子液，12 000 r/min離心10 min，菌體用無菌的9 g/L生理鹽水洗滌并適當稀釋，使用血球計數(shù)板將細胞濃度調(diào)整為107個/mL[15]。

(3)致死率曲線測定。取4 mL菌懸液加入16 μL硫酸二乙酯，在28 ℃、200 r/min下分別振蕩處理10、20、30、40、50、60 min后立即取100 μL菌懸液加入100 μL 250 g/L的硫代硫酸鈉溶液混合均勻以終止反應。對照組為用生理鹽水代替硫酸二乙酯，其他條件相同。將誘變處理后的菌懸液與對照組菌懸液適當稀釋，取100 μL涂布于平板上培養(yǎng)，然后進行菌落計數(shù)，并計算致死率，如公式(1)所示：

(1)

(4)突變株篩選。根據(jù)致死率曲線確定誘變時間，在該條件下按1.2.2(3)方法進行誘變處理和平板培養(yǎng)，挑選生長較好的單菌落進行發(fā)酵培養(yǎng)。發(fā)酵結束后取發(fā)酵液于12 000 r/min下離心10 min，收集上清液，測定D-阿拉伯醇含量。

(5)遺傳穩(wěn)定性試驗。將篩選出的D-阿拉伯醇產(chǎn)量提高的突變株在平板上連續(xù)傳代8代，分別測定第2、4、6、8代突變株的D-阿拉伯醇產(chǎn)量，篩選出生產(chǎn)性能穩(wěn)定的突變株。

1.2.3 發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化

(1)葡萄糖質(zhì)量濃度。改變初始發(fā)酵培養(yǎng)基中的葡萄糖質(zhì)量濃度，選取的葡萄糖質(zhì)量濃度為150、200、250、300、350、400 g/L。

(2)氮源種類及質(zhì)量濃度。將酵母提取物分別與胰蛋白胨、尿素、(NH4)2SO4和NaNO3搭配，酵母提取物添加量為20 g/L，其他氮源添加量均為10 g/L。并優(yōu)化最適復合氮源的比例及質(zhì)量濃度。

(3)金屬離子種類及質(zhì)量濃度。將不同質(zhì)量濃度梯度的金屬離子(CuSO4·5H2O、MgCl2·6H2O、MnCl2·4H2O、FeCl3·6H2O、NaCl、CaCl2、ZnCl2、CoCl2·6H2O、K2HPO4·3H2O)添加到培養(yǎng)基中。

(4)正交試驗設計。根據(jù)單因素優(yōu)化結果，以葡萄糖、酵母提取物+尿素、FeCl3·6H2O、CaCl2質(zhì)量濃度為4因素，選擇3水平，設計L9(34)正交試驗。

1.2.4 發(fā)酵罐擴大培養(yǎng)

在優(yōu)化培養(yǎng)條件下，將近平滑假絲酵母在3 L發(fā)酵罐中進行培養(yǎng)，裝液量1.2 L，接種量4%，通氣量2 vvm，轉速400 r/min，30 ℃培養(yǎng)120 h，定期取樣測定發(fā)酵過程中菌體量、pH、葡萄糖以及D-阿拉伯醇含量的變化。

1.2.5 檢測方法

生物量測定方法為將培養(yǎng)液用去離子水適當稀釋，以水作為對照，于600 nm下測量菌體OD值。

葡萄糖及D-阿拉伯醇含量測定：發(fā)酵液于12 000 r/min 離心5 min，取上清液經(jīng)樹脂除鹽和0.22 μm膜過濾處理，然后采用高效液相色譜法檢測發(fā)酵液中葡萄糖和D-阿拉伯醇含量。色譜條件：示差折光檢測器；色譜柱為Shodex Asahipak NHP-50 4E(4.6 mm×250 mm)，柱溫為30 ℃；流動相為70%乙腈，流速為1 mL/min；進樣量為10 μL。

2 結果與分析

2.1 誘變及突變株篩選

2.1.1 種子生長曲線

如圖1所示，原始菌株在12 h開始進入對數(shù)期，27 h進入穩(wěn)定期。對數(shù)期的細胞代謝活力高，生長旺盛，酶系活躍，易受外界刺激影響，此時進行誘變育種菌株突變的概率較大，因此選擇對種齡21 h的菌種進行誘變。

圖1 種子生長曲線

2.1.2 誘變時間選擇

如圖2所示，當誘變時間為13～18 min時致死率為60%～80%，30 min時菌體基本全部死亡。誘變程度是關鍵因素，誘變時間太短會降低細胞突變的概率，且低致死劑量下易發(fā)生負突變，誘變時間太長會使大量細胞死亡[16]。因此選用70%的致死率條件，即處理時間為15 min。

圖2 誘變致死率曲線

2.1.3 突變株篩選

如圖3所示，83株突變株產(chǎn)量高于原始菌株，正突變率為59.71%，其中突變株D8、D15、D68、D89、D129、D130、D137產(chǎn)量較原始菌株提高15%以上，突變株D137產(chǎn)量最高為27.29 g/L，較原始菌株提高26.11%(原始菌株產(chǎn)量為21.64 g/L)。硫酸二乙酯是一種烷化劑，能夠烷化DNA分子上的堿基，當DNA受到損傷時機體會啟動SOS修復機制，修復結果是維持基因組的完整性，提高細胞生存率，但產(chǎn)生的錯誤較多，從而使細胞發(fā)生突變[17]，這些變化可能是遺傳特性、生物體性狀或生活周期等[18]。結果表明，使用硫酸二乙酯誘變來提高產(chǎn)量是一種可行且有效的方法。

A-篩選結果Ⅰ;B-篩選結果Ⅱ圖3 突變株篩選結果

2.1.4 遺傳穩(wěn)定性試驗

菌株誘變后生物活性高，但產(chǎn)量不一定穩(wěn)定，若突變株的遺傳性狀不穩(wěn)定，對于工業(yè)生產(chǎn)就沒有實際意義，因此經(jīng)過誘變處理后，需要對突變株進行遺傳穩(wěn)定性檢驗。結果如表1所示，突變株D8、D15、D129、D130、D137的D-阿拉伯醇產(chǎn)量較穩(wěn)定，其中突變株D137產(chǎn)量最高且生產(chǎn)能力較穩(wěn)定，平均產(chǎn)量為28.75 g/L，因此選擇D137作為目標菌株用于進一步研究。

表1 突變株傳代穩(wěn)定性

2.2 培養(yǎng)基成分對D-阿拉伯醇生產(chǎn)的影響

2.2.1 葡萄糖質(zhì)量濃度

酵母菌發(fā)酵產(chǎn)D-阿拉伯醇能以多種碳源為底物，例如葡萄糖、果糖、蔗糖、麥芽糖、半乳糖、甘露糖、淀粉和甘油等[19-21]，目前研究發(fā)現(xiàn)葡萄糖是多種碳源中較適宜且經(jīng)濟的底物，既能較好地用于細胞生長又具有相對較高的底物轉化率[22]。因此本實驗研究了葡萄糖質(zhì)量濃度對D-阿拉伯醇生產(chǎn)的影響。

由圖4可知，當葡萄糖質(zhì)量濃度增加到300 g/L時，菌體生物量隨之增加，D-阿拉伯醇產(chǎn)量由21.05 g/L增加至46.09 g/L，底物轉化率基本不變。當葡萄糖質(zhì)量濃度增加到400 g/L時，產(chǎn)量降低到34.87 g/L，葡萄糖殘余量明顯增加，菌體生物量呈下降趨勢。當葡萄糖質(zhì)量濃度較低時，菌體缺乏合成產(chǎn)物的底物，所以隨著葡萄糖質(zhì)量濃度增加，產(chǎn)量隨之增加。當葡萄糖質(zhì)量濃度過高時，高濃度的葡萄糖使得培養(yǎng)基偏黏稠，不利于溶氧，同時滲透壓增加，致使菌體生長受到抑制，產(chǎn)量減少。因此優(yōu)選葡萄糖質(zhì)量濃度為300 g/L。

圖4 葡萄糖濃度對D-阿拉伯醇生產(chǎn)的影響

2.2.2 氮源種類及質(zhì)量濃度

如圖5-A所示，當培養(yǎng)基中氮源為酵母提取物時，D-阿拉伯醇產(chǎn)量為43.61 g/L，添加尿素后產(chǎn)量提高了15.99%，但對菌體生長的影響并不明顯，說明尿素有利于底物的轉化，對D-阿拉伯醇的合成有促進作用。相反，胰蛋白胨、(NH4)2SO4和NaNO3抑制了產(chǎn)物的合成。因此，選擇酵母提取物和尿素作為優(yōu)選復合氮源。

如圖5-B所示，當尿素與酵母提取物的質(zhì)量比為5∶1 時，D-阿拉伯醇產(chǎn)量最高為66.80 g/L，底物轉化率為30.04%，因此確定尿素與酵母提取物質(zhì)量比為5∶1。在此基礎上，本實驗又考察了復合氮源質(zhì)量濃度對產(chǎn)物合成的影響，如圖5-C所示，高質(zhì)量濃度的氮源有利于菌體生長和底物利用，但對產(chǎn)物合成沒有明顯促進效果，從底物轉化率和經(jīng)濟效益方面考慮，優(yōu)選氮源質(zhì)量濃度為30 g/L。

2.2.3 金屬離子種類及質(zhì)量濃度

由圖6-A可知，Cu2+、Co2+對產(chǎn)物合成有嚴重抑制作用，而Mg2+、Mn2+也會影響產(chǎn)物形成。Cu2+是一些生物過程中的輔酶，當Cu2+質(zhì)量濃度過大時會促使活性氧化物的產(chǎn)生，對生物大分子的生理功能有破壞作用；Co2+也會使某些蛋白質(zhì)受影響而變性[23]。Mg2+在糖酵解、三羧酸循環(huán)等過程中起重要作用，是檸檬酸裂合酶和各種激酶的輔因子，而Mn2+是丙酮酸羧化酶的輔因子[24]，因而Mg2+、Mn2+會影響微生物代謝過程中的酶反應。合適的金屬離子質(zhì)量濃度是必要的，過量的離子會抑制酶反應速度。D-阿拉伯醇的合成受到抑制可能就是因為這些金屬離子影響了微生物代謝過程中的酶反應。

由圖6-B可知，Ca2+、Fe3+、Na+、K+、Zn2+均能促進D-阿拉伯醇的產(chǎn)生，最高產(chǎn)量分別提高了15.49%、16.78%、11.95%、12.28%和8.43%。據(jù)研究發(fā)現(xiàn)，Ca2+會影響細胞膜通透性，促進胞內(nèi)產(chǎn)物的釋放[25]；Fe3+是氧化還原反應中必不可少的電子載體，在電子傳遞體系中起重要作用；Zn2+是一些醇脫氫酶的輔因子；K+對ATP的水解、磷的傳遞、滲透壓調(diào)節(jié)等起重要作用[24]。微生物對金屬離子的需求很小，微量金屬離子對菌體代謝是有益的，但過量的金屬離子可能會引起微生物中毒，所以隨著金屬離子質(zhì)量濃度的增加，D-阿拉伯醇產(chǎn)量呈下降趨勢。

A-氮源種類對D-阿拉伯醇產(chǎn)量的影響;B-氮源比例對D-阿拉伯醇產(chǎn)量的影響;C-氮源質(zhì)量濃度對D-阿拉伯醇產(chǎn)量的影響圖5 氮源對D-阿拉伯醇生產(chǎn)的影響

A-金屬離子 Ⅰ 對D-阿拉伯醇產(chǎn)量的影響；B-金屬離子 Ⅱ 對D-阿拉伯醇產(chǎn)量的影響圖6 金屬離子對D-阿拉伯醇生產(chǎn)的影響

2.2.4 正交試驗結果

考慮到各單因素間的相互作用對D-阿拉伯醇生產(chǎn)的影響，在單因素實驗基礎上設計正交試驗，試驗因素及水平如表2所示，試驗結果如表3所示。

表2 正交試驗因素水平表

由表3可知，各因素對D-阿拉伯醇生產(chǎn)的影響順序為：A>D>C>B，即葡萄糖>CaCl2>FeCl3·6H2O>氮源，優(yōu)選組合為A2B2C3D2，即葡萄糖300 g/L，氮源質(zhì)量濃度30 g/L(5 g/L酵母提取物+25 g/L尿素)，F(xiàn)eCl3·6H2O 0.1 g/L，CaCl20.02 g/L。此條件下進行搖瓶發(fā)酵，D-阿拉伯醇產(chǎn)量為87.58 g/L，較優(yōu)化前提高了2.2倍。

表3 正交試驗結果與極差分析

2.3 發(fā)酵罐擴大培養(yǎng)

如圖7所示，發(fā)酵培養(yǎng)基初始pH為4.0，滅菌后pH為8.5，這可能是因為高溫滅菌時尿素分解產(chǎn)生氨氣所致。前36 h葡萄糖消耗迅速，菌體生物量快速增長，D-阿拉伯醇沒有產(chǎn)生，說明此時底物主要用來滿足菌體生長，且菌體生長過程中產(chǎn)生了乳酸等酸性物質(zhì)致使pH急劇下降。36～72 hD-阿拉伯醇呈線性增長，說明此時底物既用于菌體生長又用于產(chǎn)物合成。72 h后細胞逐漸進入平穩(wěn)期，產(chǎn)物合成緩慢。120 h時葡萄糖基本消耗殆盡，此時D-阿拉伯醇產(chǎn)量為96.68 g/L。發(fā)酵過程中pH變化明顯，前期菌體生長時pH急劇下降，中后期產(chǎn)物合成時pH變化較小，因此考慮菌體生長和產(chǎn)物合成所需pH可能不同，可嘗試通過階段pH調(diào)節(jié)來提高D-阿拉伯醇產(chǎn)量。

圖7 突變株D137的發(fā)酵曲線

3 結論

利用化學誘變方法對近平滑假絲酵母進行誘變選育，得到1株能使D-阿拉伯醇產(chǎn)量提高且生產(chǎn)性能穩(wěn)定的突變株D137，產(chǎn)量由21.64 g/L提高至27.29 g/L。通過發(fā)酵培養(yǎng)基的優(yōu)化，產(chǎn)量進一步提高至87.58 g/L。在3 L發(fā)酵罐中進行擴大培養(yǎng)時，產(chǎn)量為96.68 g/L。結果表明，菌株誘變和發(fā)酵優(yōu)化對提高D-阿拉伯醇產(chǎn)量是一種行之有效的方法。通過傳統(tǒng)誘變獲得的菌株具有應用于實際生產(chǎn)的潛能，其結果可為D-阿拉伯醇的擴大生產(chǎn)提供參考。在D-阿拉伯醇生產(chǎn)過程中，環(huán)境也會影響其合成，因此發(fā)酵過程中的pH調(diào)節(jié)、溶氧控制等是今后研究工作的方向。