于卓然，陳程鵬，張耀，邱曉曼，莫晶，田冉，洪厚勝,2*

1(南京工業(yè)大學 生物與制藥工程學院，江蘇 南京，211816)2(南京匯科生物工程設備有限公司，江蘇 南京，210009)

紅曲起源于中國，古稱丹曲、神曲，是以蒸熟的大米為原料經(jīng)紅曲菌固態(tài)發(fā)酵而成，廣泛應用于食品著色、腐乳、食醋、釀酒和醫(yī)藥等領域，既是食品，也是具有降血壓降血脂功能的傳統(tǒng)中藥[1-2]。功能性紅曲是以降膽固醇活性物質(zhì)Monacolin K為主要成分的紅曲。高血壓是最常見的心血管疾病，是引發(fā)心腦血管疾病、腦卒中和冠心病的最主要因素，相較于其他降脂藥品，以紅曲為主要成分的藥品和保健品毒性更小，具有更高的安全性，因此紅曲發(fā)酵產(chǎn)品具有廣闊的市場前景[3]。

1979年，日本學者遠藤章在對紅曲的研究中，從紅色紅曲菌(Monascusruber)中分離得到了一種能夠抑制人體內(nèi)膽固醇合成的物質(zhì)，并將其命名為Monacolin K[4]。1980年，美國學者ALBERTS在土曲霉培養(yǎng)液中分離出了與Monacolin K化學結(jié)構(gòu)相似的代謝產(chǎn)物，命名為mevinolin，現(xiàn)稱為洛伐他汀(lovastatin)，經(jīng)過后續(xù)研究證明，遠藤章發(fā)現(xiàn)的Monacolin K與洛伐他汀為同一種物質(zhì)[5]。酸式Monacolin K的結(jié)構(gòu)與人體內(nèi)膽固醇合成途徑中的HMG-CoA的結(jié)構(gòu)相似，能與膽固醇合成過程中的限速酶HMG-CoA形成競爭性抑制，從而抑制膽固醇的合成，而內(nèi)酯式Monacolin K只是一種前體藥物，本身并無活性，需要被人體內(nèi)的羧基酯酶轉(zhuǎn)化為酸式結(jié)構(gòu)，才能夠進一步發(fā)揮降膽固醇的作用，酸式Monacolin K的含量是衡量紅曲產(chǎn)品的降脂效果的一項重要指標[6]。目前國內(nèi)外對紅曲發(fā)酵產(chǎn)Monacolin K的研究多以Monacolin K總量的提升作為目標，以提高酸式Monacolin K含量為目的的研究鮮有報道[7]。Monacolin K的代謝調(diào)控是紅曲發(fā)酵工藝研究的新熱點，代謝調(diào)控就是從分子水平上控制Monacolin K的合成[8-10]。具體方法為通過基因改造或者添加代謝調(diào)控物質(zhì)使代謝過程中相關基因抑制表達或過表達，從而達到控制Monacolin K合成途徑的目的[11-12]。研究表明，谷氨酸能夠影響紅曲菌Monacolin K生物合成基因簇的表達[13]，本實驗在此基礎上選取L-谷氨酸作為代謝調(diào)控物質(zhì)優(yōu)化功能性紅曲固態(tài)發(fā)酵工藝。本實驗以紫色紅曲菌(CGMCC No.18110)為發(fā)酵菌種，以酸式Monacolin K產(chǎn)量為評價指標，將L-谷氨酸作為其代謝調(diào)控物質(zhì)，首次采用在發(fā)酵不同階段添加L-谷氨酸的固態(tài)發(fā)酵技術[14]，利用響應面優(yōu)化發(fā)酵條件，通過觀察菌體形態(tài)在發(fā)酵過程中的變化情況并聯(lián)系現(xiàn)有的研究報道進行分析，為紅曲產(chǎn)品的開發(fā)生產(chǎn)提供工藝方法和基礎實驗數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

大米,中國黑龍江；實驗菌種CGMCC No.18110(紫色紅曲菌，Monascuspurpureus),中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心。

內(nèi)酯式Monacolin K標準品(純度≥98%)、L-谷氨酸,aladdin公司；大豆粉、玉米粉、甘油,上海麥克林生化科技有限公司；麥芽浸粉、蛋白胨,青島高科工業(yè)園海博生物技術有限公司；無水葡萄糖、瓊脂、NaNO3、K2HPO4、MgSO4·7H2O、NaOH、無水乙醇、磷酸(均為分析純),國藥集團化學試劑有限公司；乙腈(色譜純),上海吉至生化科技有限公司。

1.2 儀器與設備

PYX-DHS-BS-Ⅱ 隔水式電熱恒溫培養(yǎng)箱,上海恒躍醫(yī)療器械有限公司；ZQTY-70臺式全溫振蕩培養(yǎng)箱,上海知楚儀器有限公司；GZX-9140MBE電熱恒溫鼓風干燥箱、YXQ-LS-50S-Ⅱ 立式壓力蒸汽滅菌器、SW-CJ-2FD凈化工作臺,上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設備廠；KQ-100超聲波清洗器,昆山市超聲儀器有限公司；1260 Infinity高效液相色譜儀，美國安捷倫公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 培養(yǎng)基配制

1.3.1.1 固態(tài)種子培養(yǎng)基

蛋白胨30 g/L，麥芽汁浸粉30 g/L，瓊脂15 g/L，無菌水定容至100 mL，0.1 MPa、121 ℃滅菌20 min[15]。

1.3.1.2 液態(tài)種子培養(yǎng)基

無水葡萄糖60 g/L，蛋白胨25 g/L，玉米粉10 g/L，NaNO32 g/L，K2HPO41 g/L，MgSO4·7H2O 1 g/L，無菌水定容至100 mL，0.1 MPa、121 ℃滅菌20 min[16]。

1.3.2 固體種子培養(yǎng)

將紫色紅曲菌(CGMCC No.18110)接種到平板固體種子培養(yǎng)基中，在30 ℃條件下培養(yǎng)7 d。

1.3.3 液體種子培養(yǎng)

用無菌水將培養(yǎng)基上的孢子洗脫，打散搖勻，制成濃度為106CFU/mL的孢子懸液。將孢子懸液按5%的接種量接種到盛有200 mL液體種子培養(yǎng)基的500 mL三角瓶中，在32 ℃、180 r/min條件下振蕩培養(yǎng)48 h，制得紫色紅曲菌株活化液[17]。

1.3.4 基于兩階段L-谷氨酸添加的功能性紅曲固態(tài)發(fā)酵工藝

將大米浸泡1～2 h，瀝干水分，蒸熟。稱取150 g放入500 mL三角瓶中，用透氣封口膜封口，121 ℃滅菌20 min，冷卻后在無菌條件下向每個三角瓶中的固態(tài)發(fā)酵基質(zhì)中接入液體種子，拌勻后封口。

根據(jù)前期預試驗的結(jié)果，固態(tài)發(fā)酵的發(fā)酵條件為接種量15%，發(fā)酵周期22 d(前3 d為常溫發(fā)酵階段，發(fā)酵溫度30 ℃，使菌絲快速生長布滿發(fā)酵基質(zhì)，后19 d為低溫發(fā)酵階段，發(fā)酵溫度20 ℃，便于次級代謝產(chǎn)物Monacolin K的積累[18-20])。在此基礎上，選取甘油為外加碳源，大豆粉為外加氮源，L-谷氨酸為前體物質(zhì)和代謝調(diào)控物質(zhì)，并在低溫發(fā)酵5 d后再次添加L-谷氨酸(將L-谷氨酸溶于10 mL無菌水，在超凈工作臺上打開封口，滴入L-谷氨酸溶液，再重新封口繼續(xù)發(fā)酵)。發(fā)酵結(jié)束后將發(fā)酵物于55 ℃條件下烘干，磨粉后過40目篩，收集紅曲粉保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.5 功能性紅曲固態(tài)發(fā)酵條件優(yōu)化

1.3.5.1 功能性紅曲固態(tài)發(fā)酵工藝條件的單因素試驗

結(jié)合報道研究和預試驗結(jié)果[21-22]，基于兩階段L-谷氨酸添加的功能性紅曲固態(tài)發(fā)酵工藝采用大米為發(fā)酵底物，大豆粉為外加氮源，甘油為外加碳源，L-谷氨酸為前體物質(zhì)和代謝調(diào)控物質(zhì)，分別固定裝料量150 g，接種量15%，發(fā)酵時間22 d，采用變溫發(fā)酵(常溫發(fā)酵溫度30 ℃，低溫發(fā)酵溫度20 ℃)，分別考察大豆粉添加量、甘油添加量、常溫發(fā)酵階段L-谷氨酸添加量、低溫發(fā)酵階段L-谷氨酸添加量(各因素添加量均為質(zhì)量分數(shù))等單因素對功能性紅曲固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)酸式Monacolin K的影響。根據(jù)單因素的試驗結(jié)果，選擇對酸式Monacolin K產(chǎn)量影響顯著的因素進行響應面試驗設計。

1.3.5.2 功能性紅曲固態(tài)發(fā)酵工藝條件的響應面優(yōu)化試驗

在單因素試驗的基礎上，根據(jù)Box-Behnken試驗設計原理，以酸式Monacolin K產(chǎn)量為響應值，大豆粉添加量、常溫發(fā)酵階段L-谷氨酸添加量、低溫發(fā)酵階段L-谷氨酸添加量為自變量，采用Design-Expert軟件設計3因素3水平的響應面優(yōu)化試驗，設計因素和水平如表1所示。

表1 響應面試驗因素及水平

1.3.6 酸式Monacolin K含量的檢測方法

1.3.6.1 樣品處理

將發(fā)酵物在55 ℃條件下烘干8～10 h，研磨過40目篩，取0.3 g于50 mL比色管中，用體積分數(shù)為70%乙醇溶液定容至30 mL，55 ℃水浴1 h，每20 min搖勻1次，水浴結(jié)束后取5 mL萃取液過0.22 μm濾膜過濾[23]。

1.3.6.2 色譜條件

色譜柱為C18色譜柱(150 mm×4.6 mm，5 μm)，流動相為V(乙腈)∶V(水溶液)=55∶45，用H3PO4調(diào)至pH 2.5，流速1 mL/min，紫外檢測波長238 nm，進樣量20 μL，柱溫28 ℃。

1.3.6.3 酸式Monacolin K標準曲線的繪制

精密稱定內(nèi)酯式Monacolin K標準品20 mg，置于100 mL量瓶中，加入55 ℃的體積分數(shù)為70%乙醇溶液90 mL，以質(zhì)量濃度為200 g/L NaOH溶液調(diào)節(jié)pH至7.7，再用體積分數(shù)為70%乙醇溶液定容至100 mL，55 ℃水浴30 min，制得200 mg/L酸式Monacolin K母液，分別稀釋成質(zhì)量濃度為12.5、25、100、150、200 mg/L標準液，用HPLC檢測其峰面積，以酸式Monacolin K標準溶液峰面積y對質(zhì)量濃度x線性回歸，可得回歸方程為y=64.198x+23.938，R2=0.999 9，線性關系良好。

1.4 數(shù)據(jù)處理及分析

本實驗所有數(shù)據(jù)取3次重復實驗的平均值，采用Origin 9.1、SPSS Statistics 17.0、Design-Expert 7.0軟件進行數(shù)據(jù)處理與分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 功能性紅曲固態(tài)發(fā)酵工藝條件的單因素試驗結(jié)果

2.1.1 發(fā)酵時間對酸式Monacolin K產(chǎn)量的影響

由圖1可知，酸式Monacolin K的產(chǎn)量隨著發(fā)酵時間的變化呈先上升至最高值后下降的趨勢。在發(fā)酵的前14 d，酸式Monacolin K產(chǎn)量快速增高，之后增長速度減緩。發(fā)酵22 d后酸式Monacolin K產(chǎn)量呈下降趨勢。在發(fā)酵過程中，隨著發(fā)酵時間的增長，次級代謝產(chǎn)物不斷累積，而在發(fā)酵的后期發(fā)酵基質(zhì)消耗殆盡，菌體生長代謝受到抑制并開始消耗發(fā)酵產(chǎn)物，導致酸式Monacolin K產(chǎn)量下降，因此固定發(fā)酵周期為22 d，并將此條件下的發(fā)酵樣品作為空白對照，即對照組酸式Monacolin K含量為0.562 mg/g。

圖1 發(fā)酵時間對酸式Monacolin K產(chǎn)量的影響

2.1.2 大豆粉添加量對酸式Monacolin K產(chǎn)量的影響

實驗發(fā)現(xiàn)，外加氮源對菌體的生長速度有一定的影響，適量加入氮源有利于菌體的生長和次級代謝產(chǎn)物的累積，結(jié)合實際生產(chǎn)成本，選擇大豆粉作為外加氮源[24]。由圖2可知，大豆粉添加量低于2%(質(zhì)量分數(shù))時,酸式Monacolin K產(chǎn)量呈增加的趨勢，當添加量大于2%(質(zhì)量分數(shù))時,酸式Monacolin K產(chǎn)量呈下降趨勢。氮源添加量過高會導致菌體生長繁殖過快，營養(yǎng)基質(zhì)消耗過快，導致次級代謝產(chǎn)物合成量降低。綜上所述，最佳大豆粉添加量為2%(質(zhì)量分數(shù))。

圖2 大豆粉添加量對酸式Monacolin K產(chǎn)量的影響

2.1.3 甘油添加量對酸式Monacolin K產(chǎn)量的影響

研究表明甘油作為外加碳源可以提高紅曲菌固態(tài)發(fā)酵中Monacolin K的產(chǎn)量[25]，而其對于酸式Monacolin K產(chǎn)量的提升還需要進一步驗證。由圖3可知，隨著甘油添加量的增加,酸式Monacolin K的產(chǎn)量呈先增加后降低的趨勢，甘油添加量2.5%(質(zhì)量分數(shù))時，酸式Monacolin K的產(chǎn)量最高，對比空白對照組，甘油添加量對于酸式Monacolin K產(chǎn)量的影響并不顯著，過量添加會抑制酸式Monacolin K的產(chǎn)生。雖然研究表明，甘油作為外加碳源可以促進Monacolin K總產(chǎn)量的提高，但是其對于單一酸式Monacolin K的產(chǎn)量影響不大，因此本試驗不選擇甘油作為響應面的優(yōu)化條件。

圖3 甘油添加量對酸式Monacolin K產(chǎn)量的影響

2.1.4 常溫發(fā)酵階段L-谷氨酸添加量對酸式Monacolin K產(chǎn)量的影響

如圖4所示，酸式Monacolin K的產(chǎn)量呈先增加后降低的趨勢，在L-谷氨酸添加量(質(zhì)量分數(shù))為2%時，酸式Monacolin K產(chǎn)量達到最高，添加方式為直接在發(fā)酵基質(zhì)中加入相應質(zhì)量比的L-谷氨酸。酸式Monacolin K作為一種他汀類物質(zhì)，其合成途徑為聚酮化合物合成途徑[26]，L-谷氨酸作為前體物質(zhì)，可以被利用到酸式Monacolin K的生物合成中，適當添加可以有效提高他汀類物質(zhì)的生物合成量[27]。綜上，常溫發(fā)酵階段L-谷氨酸的最適添加量為2%(質(zhì)量分數(shù))。

圖4 常溫發(fā)酵階段L-谷氨酸添加量對酸式Monacolin K產(chǎn)量的影響

2.1.5 低溫發(fā)酵階段L-谷氨酸添加量對酸式Monacolin K產(chǎn)量的影響

在常溫發(fā)酵階段菌體增長與代謝速度快，功能性紅曲固態(tài)發(fā)酵周期長達20 d，L-谷氨酸在常溫發(fā)酵階段被大量消耗，因此選擇在發(fā)酵的第8天(低溫發(fā)酵的第5天)再次添加L-谷氨酸，對紅曲發(fā)酵酸式Monacolin K進行代謝調(diào)控。添加的方式為將相應質(zhì)量比的L-谷氨酸溶解于10 mL無菌水中，在無菌條件下均勻加入發(fā)酵物中。如圖5所示，酸式Monacolin K產(chǎn)量隨低溫階段L-谷氨酸添加量的增加而增加，當添加量為3.25%(質(zhì)量分數(shù))時酸式Monacolin K產(chǎn)量最高。因此選擇低溫發(fā)酵階段L-谷氨酸添加量3.25%(質(zhì)量分數(shù))為最佳條件。

圖5 低溫發(fā)酵階段L-谷氨酸添加量對酸式Monacolin K產(chǎn)量的影響

2.2 功能性紅曲固態(tài)發(fā)酵工藝條件的單因素試驗結(jié)果

以單因素的試驗結(jié)果為基礎，選擇對酸式Monacolin K產(chǎn)量影響較大的3個因素：大豆粉添加量、常溫發(fā)酵階段L-谷氨酸添加量和低溫發(fā)酵階段L-谷氨酸添加量。固定裝料量150 g，接種量15%，發(fā)酵時間22 d(前3 d為常溫發(fā)酵，后19 d為低溫發(fā)酵)，常溫發(fā)酵溫度30 ℃，低溫發(fā)酵溫度20 ℃，采用Box-Behnken試驗設計試驗方案，進一步優(yōu)化發(fā)酵工藝條件，試驗設計及結(jié)果如表2所示。利用Design-Expert軟件對表2中的試驗數(shù)據(jù)進行回歸分析，表3為二次回歸模型方差分析結(jié)果。對表3中數(shù)據(jù)進行二次多項回歸擬合，得到酸式Monacolin K產(chǎn)量(Y)與大豆粉添加量(A)、常溫發(fā)酵階段L-谷氨酸添加量(B)、低溫發(fā)酵階段L-谷氨酸添加量(C)的二次多項式回歸方程為：Y=6.68-0.05A+0.23B+0.24C-0.13AB+0.14AC+0.084BC-0.91A2-0.31B2-0.32C2。

表2 Box-Behnken試驗設計與結(jié)果

由表3可知，二次項回歸方程擬合性良好，該模型對于基于兩階段添加L-谷氨酸的功能性紅曲固態(tài)發(fā)酵酸式Monacolin K工藝優(yōu)化具有實際應用意義。

表3 回歸模型方差分析結(jié)果

二次項回歸方程分析表明，各因素對酸式Monacolin K產(chǎn)量的影響程度為B>A>C，即常溫發(fā)酵階段L-谷氨酸添加量>大豆粉添加量>低溫發(fā)酵階段L-谷氨酸添加量；模型的二次項A2影響顯著(P<0.05)，B2影響極顯著(P<0.01)，且交互項AB、AC影響顯著(P<0.05)，BC影響極顯著(P<0.01)。

由圖6-a可知，大豆粉添加量與常溫發(fā)酵階段L-谷氨酸添加量交互作用顯著。由圖6-b可知，大豆粉添加量和低溫發(fā)酵階段L-谷氨酸添加量交互作用顯著。由圖6-c可知，常溫發(fā)酵階段L-谷氨酸添加量與低溫發(fā)酵階段L-谷氨酸添加量交互作用顯著。

a-大豆粉添加量和常溫發(fā)酵階段L-谷氨酸添加量響應面;b-大豆粉添加量和低溫發(fā)酵階段L-谷氨酸添加量響應面;c-常溫發(fā)酵階段L-谷氨酸添加量和低溫發(fā)酵階段L-谷氨酸添加量響應面；d-大豆粉添加量和常溫發(fā)酵階段L-谷氨酸添加量等高線；e-大豆粉添加量和低溫發(fā)酵階段L-谷氨酸添加量等高線；f-常溫發(fā)酵階段L-谷氨酸添加量和低溫發(fā)酵階段L-谷氨酸添加量等高線圖6 各因素交互作用對酸式Monacolin K產(chǎn)量影響的響應面和等高線

根據(jù)響應面軟件分析計算得到功能性紅曲固態(tài)發(fā)酵酸式Monacolin K的最佳工藝條件為大豆粉添加量1.89%(質(zhì)量分數(shù))、常溫發(fā)酵階段L-谷氨酸添加量2.18%(質(zhì)量分數(shù))、低溫發(fā)酵階段L-谷氨酸添加量3.88%(質(zhì)量分數(shù))、裝料量150 g、接種量15%、發(fā)酵時間22 d。在此條件下，模型預測酸式Monacolin K產(chǎn)量的理論值為7.118 mg/g。

2.3 回歸模型的驗證實驗結(jié)果

根據(jù)響應面分析所得的最優(yōu)工藝條件，結(jié)合實際操作情況，設置驗證實驗的條件為大豆粉添加量2%(質(zhì)量分數(shù))、常溫發(fā)酵階段L-谷氨酸添加量2%(質(zhì)量分數(shù))、低溫發(fā)酵階段L-谷氨酸添加量4%(質(zhì)量分數(shù))、裝料量150 g、接種量15%、發(fā)酵時間22 d(常溫30 ℃發(fā)酵3 d，低溫20 ℃發(fā)酵19 d，并在低溫發(fā)酵5 d后再次添加L-谷氨酸)，在此條件下進行3次重復實驗，取平均值。驗證試驗中酸式Monacolin K產(chǎn)量的平均值為6.848 mg/g，與模型預測值相近，表明優(yōu)化模型可靠。

2.4 L-谷氨酸對于固態(tài)發(fā)酵紅曲菌代謝調(diào)控原理及菌絲體形態(tài)的影響

Monacolin K的生物合成途徑主要包括九酮主體的合成和二酮側(cè)鏈的合成，九酮主體與二酮側(cè)鏈合成的都是以丙二酸和乙酸為起始物質(zhì)，其中九酮主體的合成是乙酸和丙二酸由九酮合酶(lovastatin nonaketide synthase, LNKS)、酮基還原酶(ketoreduetase,KR)、烯醇還原酶(enoyl reductase,ER)以及甲基轉(zhuǎn)移酶(methyltransferase，MeT)催化，經(jīng)縮合、還原、脫水形成中間體二酮(diketide)，而后重復這一過程形成己烯酮(hexaketide)，己烯酮再經(jīng)過環(huán)化作用生成雙環(huán)萘烷骨架再經(jīng)過一系列催化形成九酮體壬烯酮，后者經(jīng)聚酮合酶(polyketidesynthase,PKS)釋放再經(jīng)氧氣作用形成3α-羥基-3,5-二氫Monacolin L，后者在進一步脫氫轉(zhuǎn)化為Monacolin L，Monacolin L在有氧條件下經(jīng)P450單加氧酶轉(zhuǎn)化為Monacolin J，最后Monacolin J再經(jīng)轉(zhuǎn)酯酶作用與二酮側(cè)鏈連接形成Monacolin K。研究表明紅曲菌中的mokE是上述代謝途徑中脫氫酶的編碼基因，L-谷氨酸能夠正向調(diào)節(jié)mokE基因的表達，增加中間產(chǎn)物Monacolin J的轉(zhuǎn)化量，從而提高Monacolin K的產(chǎn)量[28]。

由圖7-a可知，該紅曲菌在未添加L-谷氨酸的固態(tài)發(fā)酵基質(zhì)中的形態(tài)結(jié)構(gòu)是以無性繁殖為主，菌絲有大量繁雜分枝，菌絲體相互呈網(wǎng)結(jié)聯(lián)合。圖7-b為添加L-谷氨酸的發(fā)酵基質(zhì)中紅曲菌的菌絲體形態(tài)，對比圖7-a可以看出，菌絲之間網(wǎng)聯(lián)結(jié)合減少，菌絲更加緊密繁茂。圖7-c與圖7-d提高放大倍數(shù)進行觀察，可以看出添加L-谷氨酸的發(fā)酵基質(zhì)中紅曲菌的菌絲體更為粗短，能夠促進絲狀真菌次級代謝產(chǎn)物的產(chǎn)生[29]。表明L-谷氨酸可以使紅曲菌的網(wǎng)結(jié)聯(lián)合減少、菌絲更緊密繁茂、菌絲體更粗短，有利于其次級代謝產(chǎn)物酸式Monacolin K產(chǎn)生[30]。根據(jù)林琳等[31-32]的進一步研究表明，L-谷氨酸能夠使Monacolin K生物合成基因簇中的mokE基因過表達，mokE基因過表達除了能夠在代謝途徑調(diào)節(jié)Monacolin K的產(chǎn)量，還會使菌絲體形態(tài)更為粗短，并且抑制紅曲菌的有性繁殖，有利于次級代謝產(chǎn)物的產(chǎn)生。

a-未添加L-谷氨酸的發(fā)酵基質(zhì)中的紅曲菌(×5 000);b-添加L-谷氨酸的發(fā)酵基質(zhì)中的紅曲菌(×5 000);c-未添加L-谷氨酸的發(fā)酵基質(zhì)中的紅曲菌絲(×10 000);d-添加L-谷氨酸的發(fā)酵基質(zhì)中的紅曲菌絲(×10 000)圖7 未添加L-谷氨酸與添加L-谷氨酸發(fā)酵基質(zhì)中紅曲菌掃描電鏡圖

3 結(jié)論

本研究以酸式Monacolin K產(chǎn)量為評價指標，改進傳統(tǒng)功能性紅曲固態(tài)發(fā)酵工藝為基于兩階段L-谷氨酸添加的功能性紅曲固態(tài)發(fā)酵工藝，首次采用在發(fā)酵的低溫階段補充加入紅曲菌代謝調(diào)控物質(zhì)L-谷氨酸的工藝方法，通過單因素試驗考察發(fā)酵時間、大豆粉添加量、甘油添加量、常溫階段L-谷氨酸添加量、低溫發(fā)酵階段L-谷氨酸添加量對紅曲固態(tài)發(fā)酵酸式Monacolin K產(chǎn)量的影響，利用Box-Behnken試驗設計進一步對發(fā)酵工藝條件進行響應面優(yōu)化試驗，得出最佳發(fā)酵條件為大豆粉添加量2%(質(zhì)量分數(shù))、常溫發(fā)酵階段L-谷氨酸添加量2%(質(zhì)量分數(shù))、低溫發(fā)酵階段L-谷氨酸添加量4%(質(zhì)量分數(shù))、裝料量150 g、接種量15%、發(fā)酵時間22 d(常溫30 ℃發(fā)酵3 d，低溫20 ℃發(fā)酵19 d，并在低溫發(fā)酵5 d后再次添加L-谷氨酸)。該條件下模型預測酸式Monacolin K產(chǎn)量的理論值為7.118 mg/g，經(jīng)驗證實驗得出酸式Monacolin K產(chǎn)量可以達到6.848 mg/g，與預測值相近，表示響應面法對于功能性紅曲固態(tài)發(fā)酵工藝的優(yōu)化是可信的。本實驗僅以酸式Monacolin K為單一目標產(chǎn)物，產(chǎn)量已符合輕工業(yè)行業(yè)標準規(guī)定的Monacolin K(包括酸式Monacolin K和內(nèi)酯式Monacolin K)含量不少于4 mg/g，高于大部分研究報導中的酸式Monacolin K產(chǎn)量。本試驗兩階段代謝調(diào)控物質(zhì)添加的工藝方法對功能性紅曲產(chǎn)品的發(fā)酵工藝方法改進具有一定的啟發(fā)意義。