陳曼娜

（廣東省潮州市人民醫(yī)院 廣東潮州 521011）

1 引言

磺胺類藥物通過干擾細菌酶系統(tǒng)中的氨基苯甲酸，破壞其自我增值能力，對細菌產(chǎn)生極強的抑制作用，從而達到殺菌目的。由于其出色的殺菌能力，且在實際應(yīng)用中有經(jīng)濟、高效、穩(wěn)定等優(yōu)點，常被應(yīng)用于細菌性感染和原蟲感染等疾病中。控制獸藥殘留最主要的措施是加強獸藥殘留的檢測和監(jiān)控，我國規(guī)定動物性食品中單個藥物最高殘留限量為0.1 mg/kg[1]。

2 材料和檢測方法

2.1 材料和儀器

試驗對象：6只白兔，體重在2.5 kg左右；3只雞，體重在1.5 kg左右。

試驗材料：新鮮牛奶；包被原H2-OVA；免疫原H1-HSA、H1-BSA 等。

試劑：辣根過氧化物酶標記的免疫球蛋白G（HRP-IgG）；新生牛血清；卵清蛋白（OVA）；各類磺胺類藥物：磺胺二甲基嘧啶（SM2）；磺胺嘧啶（SD）；磺胺喹惡啉（SQ）；磺胺氯吡嗪鈉（SC）；磺胺甲基異惡唑（SMZ）；磺胺對甲氧嘧啶（SMD）；磺胺-6-甲氧嘧啶（SMM）[2]。

儀器：電子天平；超純水設(shè)備；酶標儀器；離心機；恒溫水槽；恒溫干燥箱。

2.2 磺胺類藥物多克隆抗體制備

2.2.1 免疫程序接種

參考常規(guī)免疫程序?qū)彝眠M行免疫試驗，在試驗前分別采用H1-BSA和H1-HSA作為免疫抗體，以0.5 mg/kg的劑量對3只新西蘭白兔進行免疫試驗。在抗原溶液中注入等體積的弗氏完全佐劑，乳化完全后，采用皮內(nèi)多點注射法對白兔后背皮肉進行注射，每次劑量控制在0.1～0.2 mL。將抗原溶液與弗氏不完全佐劑等體積融合，間隔3周后，以背部皮下注射的方式做第二次免疫，之后分別間隔2周后做第三次和第四次免疫。再間隔2周后，將1 mg完全抗原溶液溶于生理鹽水中，通過耳緣靜脈注射，進行第五次免疫，1周后對頸動脈進行分離采血得到抗血清物質(zhì)[3]。

2.2.2 純化抗血清

采用三步鹽析法對抗血清進行純化，主要試劑為飽和硫酸銨，使用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）進行純化效果的最終鑒定，并將樣本在-20℃條件下低溫保存。

2.3 建立免疫學分析法

2.3.1 酶聯(lián)免疫法（ELISA）確定最佳抗原抗體濃度

以H2-OVA為抗原溶液，以羊抗兔HRP-IgG組建酶標酶聯(lián)免疫試驗。對抗體的重點效價進行解析，得出抗原抗體的最佳濃度[4]。

2.3.2 ELISA標準曲線的建立

對于 7種常用磺胺類藥物（SM2、SD、SQ、SC、SMZ、SMD、SMM）進行間接競爭試驗，確定抗原抗體的工作條件，以競爭物底物濃度的對數(shù)為橫坐標，繪制出相應(yīng)的標準曲線，完成相關(guān)的參數(shù)分析[5]。

2.4 磺胺類藥物在多克隆抗體中的應(yīng)用

2.4.1 測定牛奶中磺胺藥的含量

對新鮮牛奶進行處理，在常溫下以4 000 r/min轉(zhuǎn)速進行離心，取樣下層清液進行分析。

2.4.2 測定雞樣品中磺胺類藥物的含量

取樣品雞宰殺，取雞胸肌和肝臟作為待測樣品，將雞胸肉和肝臟剪碎后放于離心管內(nèi)，加入乙腈和乙酸乙酯，震蕩離心，取下層溶液，添加 0.1、1.0、5.0 μg/mL 3個濃度梯度的磺胺藥，根據(jù)磺胺藥物的濃度抑制曲線和回歸方程得到最終結(jié)果的回收率。

3 結(jié)果

3.1 抗原抗體中最佳濃度值的確認

用酶聯(lián)免疫方陣對試驗做最佳濃度分析與確認，以抗效價1∶85000作為間接酶聯(lián)免疫法的最佳濃度，詳見表1。

表1 間接酶聯(lián)免疫法方陣試驗分析

3.2 標準曲線相關(guān)參數(shù)

以依據(jù)表1數(shù)據(jù)對7種磺胺類藥物的抑制率進行測算，以磺胺類藥物濃度的對數(shù)為橫坐標，抗原抗體結(jié)合率為縱坐標繪制標準曲線，詳見表2。

表2 磺胺類藥物間接競爭標準曲線相關(guān)參數(shù)

3.3 牛奶添加藥物回收率

添加100 ng/mL磺胺類藥物時，回收率為77.8%，相對標準偏差（RSD）為2.47%；添加1 000 ng/mL時，回收率為79.4%，RSD為2.62%；添加5000ng/mL，回收率為101.3%，RSD為4.1%。結(jié)果表明，磺胺類藥物在100～5 000 ng/mL時，具有良好的回收率。

4 討論

本文以磺胺類藥物母核結(jié)構(gòu)的完全抗原作為H1-HSA、H2-OVA研究的免疫原和包被原，以降低雜質(zhì)感染，提高檢測分析的靈敏度。H1-HSA對免疫家兔的抗血清體現(xiàn)了良好的靈敏性，對常用的7種磺胺藥能夠有效識別，5種檢測限低于最高殘留量（100 ng/mL）。本文主要對抗體中磺胺類藥物的殘留量進行定性分析，可以提高檢測試劑在實際應(yīng)用中的特異性、靈敏性、分離能力以及準確度，以此提高分析效率，實現(xiàn)多殘留檢測的目的。