林錕，楊雪，譚麗菊，王江濤*

( 1. 中國海洋大學(xué) 海洋化學(xué)理論與工程技術(shù)教育部重點實驗室，山東 青島 266100)

1 引言

2008 年6 月，黃海我國海域暴發(fā)的滸苔（Ulva prolifera）綠潮覆蓋了超過2 400 km2的水域，被認(rèn)為是有史以來最大的綠潮災(zāi)害之一[1]。自此之后的10 年多，在黃海海域每年都會暴發(fā)大型綠潮[2]。經(jīng)過多年的研究調(diào)查表明，黃海滸苔起源于江蘇沿岸紫菜養(yǎng)殖筏架定生綠藻的機(jī)械脫落[3-4]，在表層海流的攜帶下，向北漂移，最終在山東半島南部海域聚集堆積[5]。滸苔綠潮的暴發(fā)不僅阻礙海上航運(yùn)，對漁業(yè)、旅游業(yè)造成重大損失，并且對海洋生態(tài)環(huán)境與海洋生物群落結(jié)構(gòu)都造成巨大的影響。

滸苔是一種常見的大型藻類，屬于綠藻門（Chlorophyta)，綠藻綱(Chlorophyta)，石莼目(Ulvales)，石莼科(Ulvaceae)，石莼屬(Ulva)[6]。滸苔藻體直立，呈管狀中空結(jié)構(gòu)，光合作用過程藻體釋放氧氣形成氣泡，易漂浮在海面[7]。該種屬于廣溫、廣鹽、耐干露性強(qiáng)的大型海藻，有很強(qiáng)的環(huán)境適應(yīng)能力，在適宜條件下可以大規(guī)模繁殖[8]。由于海水富營養(yǎng)化加劇，春、夏季水溫上升，光照變強(qiáng)等因素促使?jié)G苔大規(guī)模生長，常見于山東、江蘇沿岸南黃海海域，可以通過與其他浮游植物的相互作用，影響綠潮發(fā)生海域的物種分布和生態(tài)結(jié)構(gòu)[9]。

滸苔暴發(fā)海域，富營養(yǎng)化嚴(yán)重，2017 年在南黃海海域出現(xiàn)了罕見的綠潮、金潮和赤潮等有害藻華共發(fā)現(xiàn)象，其中包含鏈狀裸甲藻（Gymnodinium catenatum）和東海原甲藻（Prorocentrum donghaiense）等多種甲藻[10]。作為典型的赤潮微藻之一，東海原甲藻在我國海域已經(jīng)盛行多年。與其他赤潮微藻相比，東海原甲藻生長速率較高，具有垂直遷移能力，在低營養(yǎng)鹽環(huán)境下對有機(jī)態(tài)營養(yǎng)物質(zhì)具有較高的競爭吸收能力，進(jìn)而形成東海原甲藻赤潮[11-14]。該赤潮具有生物量高、持續(xù)時間長、覆蓋面積廣的特點，直接影響浮游動物的群落結(jié)構(gòu)，進(jìn)而對生態(tài)系統(tǒng)造成破壞[15]。所以當(dāng)前對于我國來說，尋找一種控制東海原甲藻赤潮暴發(fā)的有效方法迫在眉睫。

滸苔與微藻同處于海洋生態(tài)系統(tǒng)的初級生產(chǎn)者地位，生態(tài)位有一定的重疊，不可避免會產(chǎn)生資源競爭。同一海域，大型藻類的生長和暴發(fā)往往與浮游植物的生長呈現(xiàn)明顯的負(fù)相關(guān)[16]。已有研究表明，新鮮滸苔與微藻共培養(yǎng)能顯著抑制微藻的生長，且對不同微藻會產(chǎn)生不同的抑制作用?；粼拥萚17]發(fā)現(xiàn)滸苔能產(chǎn)生化感物質(zhì)，有效抑制米氏凱倫藻（Karenia mikimotoi）的生長；史華明和石曉勇[18]發(fā)現(xiàn)滸苔能抑制中肋骨條藻（Skeletonema costatum）生長，而活性磷酸鹽可能是一次性培養(yǎng)中影響競爭的主要原因；劉青等[19]發(fā)現(xiàn)滸苔早期發(fā)育的微觀繁殖體可抑制赤潮微藻的生長，表明這種抑制作用不僅局限在成熟的藻體階段；滸苔干粉末在不同溶劑的提取下對赤潮微藻的抑制作用不同，滸苔產(chǎn)生的化感物質(zhì)具有相對較高的極性[20-21]?？傮w來說，在大型海藻與赤潮微藻共培養(yǎng)體系中，大藻對微藻的抑制作用明顯大于微藻對大藻的抑制作用[22]。

近年來，大型綠藻對赤潮微藻的競爭作用研究越來越多[23]，東海原甲藻作為中國近海常見赤潮種也備受關(guān)注，但是對于不同狀態(tài)滸苔對東海原甲藻生長的影響仍沒有系統(tǒng)化的研究。本研究通過不同狀態(tài)滸苔設(shè)置不同含量梯度與東海原甲藻共培養(yǎng)，來具體探究滸苔對東海原甲藻生長的影響，推斷滸苔對東海原甲藻產(chǎn)生的化感作用，為利用滸苔等大型藻類治理東海原甲藻赤潮提供可行的方向。

2 材料與儀器

2.1 實驗材料

滸苔采自江蘇鹽城近海，低溫保存帶回實驗室，用滅菌海水反復(fù)清洗3～4 次，以去除泥沙和其他附生物，添加1 mg/L 的GeO2溶液消除硅藻的影響[24]。鏡檢確認(rèn)無雜藻后，在f/2 培養(yǎng)液中培養(yǎng)。同時在培養(yǎng)液中添加0.15 mg/L 抗生素（4%卡那霉素）對藻體表面進(jìn)行滅菌處理[25]。1 周后從培養(yǎng)瓶中挑選生長狀況良好的滸苔藻體，用吸水紙吸干藻體表面水分進(jìn)行實驗。東海原甲藻由中國海洋大學(xué)海洋污染生態(tài)化學(xué)實驗室提供，在f/2 培養(yǎng)液里培養(yǎng)，每天定時搖晃微藻培養(yǎng)瓶，防止其貼壁生長，培養(yǎng)至指數(shù)生長期備用（初始密度為18 000 cells/mL）。

培養(yǎng)瓶置于恒溫光照培養(yǎng)箱，培養(yǎng)溫度為20℃，光照強(qiáng)度為4 000 lx，光暗比為12 h∶12 h（D∶L）。實驗用培養(yǎng)瓶酸泡后洗凈，高溫滅菌后備用。海水采集自江蘇鹽城近海（鹽度為29），用孔徑0.45 μm 的醋酸纖維濾膜過濾，高溫滅菌后備用。

2.2 實驗儀器

GXZ-500B 恒溫光照培養(yǎng)箱（寧波市江南儀器廠），DM4000B 電子顯微鏡（德國徠卡公司），LDZX-50FBS 立式壓力蒸汽滅菌器（上海中安醫(yī)療器械廠），BS224S 電子分析天平（德國賽多利斯集團(tuán)），DHG-9240A 電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（上海精宏實驗設(shè)備有限公司）。

3 實驗設(shè)計與方法

實驗設(shè)計了東海原甲藻與不同狀態(tài)滸苔（新鮮藻體共培養(yǎng)、濾液培養(yǎng)、干粉末共培養(yǎng)）實驗，探究滸苔對東海原甲藻的競爭抑制作用。

3.1 滸苔新鮮藻體對東海原甲藻的影響

設(shè)置0 g/L、1.0 g/L、2.0 g/L、5.0 g/L、10.0 g/L、15.0 g/L 不同鮮重梯度的滸苔置于1 000 mL 錐形瓶中，加入500 mL 滅菌海水，加入f/2 培養(yǎng)基。加入指數(shù)生長期的東海原甲藻，置于恒溫光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每天定時搖晃錐形瓶，防止微藻貼壁生長。為消除位置對實驗結(jié)果的影響，不同錐形瓶在培養(yǎng)箱中的分布是隨機(jī)的，每隔3 h 更換一次錐形瓶的位置。實驗周期共8 d，每組設(shè)置兩組重復(fù)試驗。

3.2 滸苔培養(yǎng)濾液對東海原甲藻的影響

將0 g/L、1.0 g/L、2.0 g/L、5.0 g/L、10.0 g/L、15.0 g/L不同鮮重梯度的滸苔置于含500 mL 滅菌海水的錐形瓶中，加入f/2 培養(yǎng)基。培養(yǎng)7 d 后，將滸苔撈出，培養(yǎng)液經(jīng)0.45 μm 的醋酸纖維濾膜過濾，根據(jù)所測營養(yǎng)鹽濃度重新加富達(dá)到f/2 培養(yǎng)基的要求，加入同指數(shù)生長期的東海原甲藻培養(yǎng)。培養(yǎng)條件和實驗方法同3.1 節(jié)。

3.3 滸苔干粉末對東海原甲藻的影響

將新鮮滸苔在55℃干燥箱里烘干，并用研缽研磨成粉末后過篩（0.33 mm），用電子天平稱重，根據(jù)實驗室培養(yǎng)實驗測得滸苔干濕重?fù)Q算系數(shù)1∶4.4，設(shè)置0 g/L、0.2 g/L、0.4 g/L、0.6 g/L、1.2 g/L、2.4 g/L 不同干重梯度，加入到含500 mL 滅菌海水的錐形瓶中，加入f/2 培養(yǎng)基與同指數(shù)生長期東海原甲藻共培養(yǎng)。培養(yǎng)條件和實驗方法同3.1 節(jié)。

3.4 實驗方法

在每天同一時間從培養(yǎng)瓶中取東海原甲藻藻液2 mL 并用Lugol's 的試劑固定，藻細(xì)胞密度用浮游生物計數(shù)框在顯微鏡下計數(shù)，每個樣品計數(shù)兩次。生長抑制率計算方法為I= (1?N/N0) ×100%[26]，式中，N為實驗組微藻細(xì)胞密度，N0為對照組細(xì)胞密度。

3.5 數(shù)據(jù)處理

各實驗組組間實驗數(shù)據(jù)差異用SPSS 23 進(jìn)行單因素方差分析（one-way ANOVA） 統(tǒng)計分析，比較不同狀態(tài)、不同含量滸苔對微藻生長抑制率的差異。p＜0.05 作為顯著性差異的標(biāo)準(zhǔn)[27]。

4 實驗結(jié)果

4.1 不同鮮重滸苔藻體對東海原甲藻生長的影響

從圖1 可發(fā)現(xiàn)，在滸苔和東海原甲藻共培養(yǎng)體系中，高含量（大于1 g/L）滸苔新鮮藻體明顯抑制東海原甲藻的生長，且抑制效果隨滸苔鮮重的增加而增加。實驗前期（0～3 d），6 組東海原甲藻的生長狀況相似。在不含滸苔的空白對照組里，東海原甲藻細(xì)胞密度呈持續(xù)上升的趨勢。在含有1 g/L 滸苔的共培養(yǎng)體系中，東海原甲藻的細(xì)胞密度與空白組沒有明顯差別（one-way ANOVA，p＞0.05）。2 g/L、5 g/L、10 g/L、15 g/L實驗組第5 天與第8 天的細(xì)胞密度差別很小，表明東海原甲藻的生長受滸苔的影響，提前到達(dá)穩(wěn)定生長期。2 g/L 和5 g/L 新鮮滸苔添加組分別在第8 天和第5 天后出現(xiàn)與對照組有差異的藻細(xì)胞密度，含有10 g/L和15 g/L 滸苔添加組在第3 天的藻細(xì)胞密度就明顯小于對照組，之后的生長速率也比其他組更緩慢。在第8 天，測得各滸苔鮮重下對東海原甲藻的抑制率分別為1.3%、20.1%、21.1%、32.2%、40.1%（圖2）?？梢?，滸苔新鮮藻體和東海原甲藻共培養(yǎng)時，滸苔添加質(zhì)量越大對東海原甲藻的抑制作用越強(qiáng)，且抑制現(xiàn)象越提前出現(xiàn)。

圖 1 東海原甲藻與不同含量新鮮滸苔共培養(yǎng)的生長曲線Fig. 1 Growth curves of P. donghaiense in co-cultures with different contents of fresh U. prolifera

圖 2 不同含量新鮮滸苔共培養(yǎng)對東海原甲藻生長抑制率（第8 天）Fig. 2 The growth inhibition rate of P. donghaiense in co-cultures with different contents of fresh U. prolifera (the 8th day)

4.2 不同含量滸苔培養(yǎng)濾液對東海原甲藻生長的影響

高含量（大于1 g/L）滸苔培養(yǎng)濾液對東海原甲藻生長有明顯的抑制作用。從圖3 中可知，滸苔濾液對東海原甲藻的抑制效果隨濾液初始滸苔含量增加而增加。添加含有1 g/L 滸苔培養(yǎng)濾液中的東海原甲藻細(xì)胞密度與空白對照組相似，在此濾液含量下東海原甲藻的生長受到的抑制作用很小。但1 g/L 滸苔濾液添加組中的東海原甲藻藻密度在第4 天明顯高于對照組藻密度（p＜0.05），說明微藻生長受到一定的促進(jìn)作用。除了1 g/L 滸苔濾液添加組，其他組均呈現(xiàn)對東海原甲藻較大的抑制作用，在實驗后期微藻細(xì)胞密度下降明顯，出現(xiàn)致死效應(yīng)。根據(jù)圖4 可直接觀察到實驗?zāi)┢趯φ战M中東海原甲藻呈現(xiàn)出淺棕黃色，而15 g/L 滸苔濾液培養(yǎng)實驗組中溶液已變得澄清，在顯微鏡下觀察微藻數(shù)量較低。實驗第8 天，各含量滸苔濾液培養(yǎng)對東海原甲藻的抑制率（圖5）分別為2.4%、17.1%、19.5%、26.8%、80.5%，可見隨著滸苔新鮮藻體質(zhì)量增大，其培養(yǎng)濾液對東海原甲藻抑制率也逐漸增大。

4.3 不同含量滸苔干粉末對東海原甲藻生長的影響

從圖6 中可發(fā)現(xiàn)，滸苔干粉末對東海原甲藻生長有抑制作用，且抑制效果隨干粉末的含量增加而越發(fā)明顯。未添加干粉末的空白對照組里東海原甲藻細(xì)胞密度呈現(xiàn)穩(wěn)定上升的趨勢，添加0.2 g/L 滸苔干粉末實驗組實驗前期（0～4 d）東海原甲藻藻密度與空白對照組差別不大，東海原甲藻的生長沒有受到明顯的抑制作用；在第5 天，東海原甲藻藻密度明顯超過對照組（p＜0.05），但在6 天之后出現(xiàn)了輕微的抑制作用。在其他含量下東海原甲藻的生長都有受到明顯的抑制作用，生長速率明顯低于空白組，而且細(xì)胞密度開始下降的時間隨培養(yǎng)瓶內(nèi)滸苔干粉末含量的增加而提前。含有1.2 g/L 和2.4 g/L 滸苔干粉末的東海原甲藻沒有繼續(xù)生長繁殖，細(xì)胞密度逐漸降低，最后數(shù)量接近為0，在光學(xué)顯微鏡下觀察到后期的細(xì)胞形態(tài)往往沒有前期的清晰，破碎較多。在第8 天，不同含量滸苔干粉末對東海原甲藻的抑制率（圖7）分別為15.5%、57.8%、76.5%、97.7%、99.7%，可見滸苔干粉末對東海原甲藻有較強(qiáng)的抑制作用，且隨著滸苔干粉末的增加抑制作用逐漸增大。

圖 3 東海原甲藻在不同含量滸苔濾液培養(yǎng)中的生長曲線Fig. 3 Growth curves of P. donghaiense in different contents of U. prolifera filtrate culture

圖 4 實驗?zāi)┢?5 g/L 滸苔濾液培養(yǎng)（5?1，5?2）和對照組（0?1，0?2）中的東海原甲藻的生長狀況Fig. 4 Growth of P. donghaiense in 15 g/L U. prolifera filtrate culture (5?1，5?2) and control group (0?1，0?2) at the end of the experiment

圖 5 不同含量滸苔濾液培養(yǎng)對東海原甲藻生長抑制率（第8 天）Fig. 5 The growth inhibition rate in different contents of U.prolifera filtrate culture on P. donghaiense (the 8th day)

圖 6 東海原甲藻與不同含量滸苔干粉末共培養(yǎng)的生長曲線Fig. 6 Growth curves of P. donghaiense in co-cultures with different content of U. prolifera dry powder

5 討論

研究表明，滸苔作為一種大型藻類對赤潮微藻的生長有一定的競爭抑制作用[28]，這種抑制作用可能來源于對氮、磷等營養(yǎng)物質(zhì)的資源競爭，另一方面可能來自大型藻類釋放的化感物質(zhì)，進(jìn)而影響微藻的生長[29]。

通過采用不同狀態(tài)的滸苔探究其對東海原甲藻生長的競爭作用，發(fā)現(xiàn)滸苔作為一種大型藻類對東海原甲藻生長產(chǎn)生了一定的抑制作用。隨滸苔的狀態(tài)、含量不同表現(xiàn)出不同的抑制性，極低含量的滸苔抑制率相對較低，甚至在中間生長過程中，藻密度超過了對照組，說明可能存在一定的“低促高抑”現(xiàn)象[20,30]。低含量的滸苔，一定程度上會促進(jìn)東海原甲藻的生長，而較高含量的滸苔則出現(xiàn)抑制作用，且隨著滸苔含量的逐漸增加，對東海原甲藻的抑制作用也越來越強(qiáng)。以往的研究也表明，大型藻類對赤潮微藻存在“低促高抑”的影響，并且對于不同的生物種、屬存在特異性[21,31?32]。

對比3 組培養(yǎng)體系，不同狀態(tài)滸苔對東海原甲藻生長速率的限制表現(xiàn)為滸苔干粉末共培養(yǎng)遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于滸苔濾液培養(yǎng)和滸苔新鮮藻體共培養(yǎng)。相比滸苔濾液培養(yǎng)和滸苔新鮮藻體共培養(yǎng)，滸苔干粉末以極低的含量便可對東海原甲藻的生長起到極大的抑制作用，在含量超過1 g/L 時，直接影響東海原甲藻藻密度，使其出現(xiàn)負(fù)增長的狀態(tài)，最終死亡。根據(jù)滸苔干濕比1∶4.4 來換算，0.2 g 的滸苔干粉末大約需要0.88 g 的新鮮滸苔干燥研磨得到。0.2 g/L 的滸苔干粉末抑制率遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過1 g/L 的新鮮滸苔共培養(yǎng)時的抑制率，0.4 g/L 滸苔干粉末抑制率也大于2 g/L 滸苔新鮮藻體共培養(yǎng)時的抑制率；可以認(rèn)為滸苔干粉末對東海原甲藻的抑制作用遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過等比例滸苔新鮮藻體對東海原甲藻的抑制作用。侯俊妮[33]推測滸苔干粉末對微藻的高抑制作用是由于滸苔干粉末中的化感物質(zhì)是一次性脈沖式的添加。且觀察到實驗組的微藻細(xì)胞形狀發(fā)生很大變化，脹大破裂，可能由于滸苔釋放的一些化感物質(zhì)，破壞了微藻的細(xì)胞結(jié)構(gòu)，造成通透性降低，使微藻裂解死亡[33]。因此可以利用滸苔產(chǎn)生的化感物質(zhì)即滸苔生物抗藻劑來控制微藻暴發(fā)，防治赤潮[34]。

相比而言，滸苔新鮮藻體共培養(yǎng)和滸苔濾液培養(yǎng)在低于10 g/L 的含量范圍內(nèi)對東海原甲藻的抑制率相似，但滸苔濾液培養(yǎng)在15 g/L 的含量條件下，東海原甲藻所受的抑制作用迅速增大，抑制率高達(dá)87.1%。3 種狀態(tài)的滸苔都對東海原甲藻表現(xiàn)出不同的抑制作用，并且滸苔濾液培養(yǎng)和滸苔干粉末共培養(yǎng)后期出現(xiàn)負(fù)增長的趨勢。一方面是由于滸苔或濾液存在化感物質(zhì)影響微藻的生長，另一方面則由于連續(xù)培養(yǎng)，二者之間產(chǎn)生營養(yǎng)競爭[35]，從而阻礙微藻的生長。此外，滸苔新鮮藻體共培養(yǎng)實驗組可能存在一定的遮光效應(yīng)，滸苔漂浮在海水表層，影響東海原甲藻的生長，且含量越大遮蔽作用越強(qiáng)。本研究認(rèn)為利用滸苔干粉末產(chǎn)生的化感效應(yīng)，可以高效地抑制東海原甲藻的生長，為東海原甲藻赤潮的生物防治提供依據(jù)。

圖 7 不同含量的滸苔干粉末共培養(yǎng)對東海原甲藻生長抑制率（第8 天）Fig. 7 The growth inhibition rate of P. donghaiense in co-cultures with different contents of U. prolifera dry powder(the 8th day)

6 結(jié)論

不同狀態(tài)的滸苔在初始含量大于1 g/L 的條件下對東海原甲藻的生長都存在抑制作用，滸苔干粉末共培養(yǎng)體系的抑制強(qiáng)度遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于滸苔濾液培養(yǎng)和滸苔新鮮藻體共培養(yǎng)體系。其抑制機(jī)理一方面來自于營養(yǎng)物質(zhì)的競爭，另一方面則來源于滸苔釋放化感物質(zhì)對東海原甲藻存在一定克生作用，從而限制了東海原甲藻的生長。當(dāng)然也存在一定的“低促高抑”的現(xiàn)象，低含量滸苔共培養(yǎng)前期會在一定程度上促進(jìn)東海原甲藻生長，隨著滸苔含量升高，逐漸出現(xiàn)抑制現(xiàn)象，且抑制作用越來越強(qiáng)。