肖宇梅，徐雯欽，蘇玉萍，2*，張立香，佘晨興，廖福萍

(1.福建師范大學(xué)環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院，福建 福州 350007；2.福建省污染控制和資源循環(huán)重點實驗室，福建 福州 350007)

隨著我國對海洋開發(fā)力度的增大，海洋的生態(tài)環(huán)境和資源受到了嚴(yán)峻的考驗，海洋經(jīng)濟(jì)的發(fā)展也受其影響。隨之引發(fā)的赤潮發(fā)生的頻率和規(guī)模也呈現(xiàn)上升趨勢。據(jù)統(tǒng)計，我國近海海域2001—2013年間引發(fā)赤潮的種類中以甲藻門為優(yōu)勢種的有27種，次之以硅藻門為優(yōu)勢種的有20種，其他如金藻門、藍(lán)藻門、黃藻門等，共60種[1]。東海近海海域已成為我國赤潮高發(fā)區(qū)之一，東海原甲藻(Prorocentrumdonghaiense)也已成為該海域赤潮的優(yōu)勢種[2]之一。相關(guān)數(shù)據(jù)顯示，2001—2013年東海原甲藻赤潮在我國每年均有爆發(fā)，其中2013年作為第一優(yōu)勢種引發(fā)赤潮多達(dá)16次[1]。東海原甲藻屬于甲藻綱，原甲藻目，原甲藻科，原甲藻屬，主要在東海長江口、浙江近海至福建沿岸海域引發(fā)赤潮[3-4]。福建省是我國赤潮頻發(fā)的省份之一。據(jù)統(tǒng)計，福建省每年平均發(fā)生赤潮16.1起[5]。2013—2017年東海原甲藻赤潮共12起。東海原甲藻已成為海洋研究工作者密切關(guān)注的一個藻種，探討東海原甲藻赤潮的形成機制、預(yù)警應(yīng)急以及藻種生長與環(huán)境因子的關(guān)系等已成為研究熱點。

磷(Phosphorus，P)是微藻生長的必需營養(yǎng)元素之一，也是大多數(shù)代謝結(jié)構(gòu)和功能所必需的元素[6]。海洋中的磷主要以溶解性無機磷(Dissolved inorganic phosphorus，DIP)和溶解性有機磷(Dissolved organic phosphorus，DOP)存在，且因DIP在水生系統(tǒng)中含量較低而通常成為浮游植物生長的第一個限制因素[7-8]。Zhang等研究發(fā)現(xiàn)東海原甲藻對DIP限制表現(xiàn)出積極的生理和轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，DIP的限制影響東海原甲藻的生長速率[9]，同時也在劇毒卡爾藻(Karlodiniumveneficum)[10]和米氏凱輪藻(Kareniamikimotoi)中體現(xiàn)[11]。東海原甲藻可直接利用無機磷，但其可分泌堿性磷酸酶間接利用葡萄糖-6-磷酸(G-6-P)、三磷酸腺苷(ATP)和核糖核酸(RNA)等有機磷(Organic phosphorus，OP)化合物維持生長，與無機磷相比發(fā)現(xiàn)有機磷對東海原甲藻的增殖作用稍好，對堿性磷酸酶的測定也反映出東海原甲藻對有機磷的利用方式不同[12-14]。林森杰等發(fā)現(xiàn)缺磷條件下細(xì)胞周期G1期受阻，但在缺磷培養(yǎng)基中加入有機磷ATP后，ATP等可以完全補充東海原甲藻的無機磷源并迅速恢復(fù)細(xì)胞分裂，東海原甲藻的轉(zhuǎn)錄組和mRNA表達(dá)與有機磷利用相關(guān)的基因表達(dá)量顯著上調(diào)，說明東海原甲藻具有利用核酸、ATP、脂類等多種有機磷[15-16]包括葡萄糖-6-磷酸、磷肌酸、2-磷酸甘油酸、核苷酸、三磷酸腺苷等種類[13]的能力。

前人的研究主要集中在無機磷和有限種類的有機磷對東海原甲藻增殖的影響[13]。鑒于此，本文研究PM4A多磷源對東海原甲藻增殖的影響，選取了59種磷(54種有機磷、5種無機磷)作為磷源，探究東海原甲藻對有機磷的利用特性，結(jié)果對于研究東海原甲藻赤潮的發(fā)生規(guī)律和應(yīng)對措施具有現(xiàn)實意義。

1 材料與方法

1.1 藻種的培養(yǎng)和有機磷

以東海原甲藻為研究對象，藻株來自于廈門大學(xué)海洋藻類資源研究中心(株CCMAXU-364)。所有藻類培養(yǎng)實驗均在光照培養(yǎng)箱中進(jìn)行，光照采用白色冷光源，光照強度2 500 lx，光暗比12 h∶12 h，溫度設(shè)置為(20±1)℃，培養(yǎng)期間每天定時微振細(xì)胞培養(yǎng)板，防止藻細(xì)胞黏附及缺氧。實驗用f/2培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)實驗。購自于美國Biolog公司的PM4A磷源板，提供了54種有機磷(DOP)和5種無機磷(DIP)。

1.2 實驗設(shè)計

實驗藻種先饑餓處理72 h以耗盡藻細(xì)胞內(nèi)磷酸鹽。在紫外線滅菌后的超凈臺下，向PM4A plate微孔中加入100 μL滅菌海水，充分溶解微孔中磷營養(yǎng)物質(zhì)作為實驗用磷源母液，將各微孔中的磷源母液轉(zhuǎn)移50 μL到細(xì)胞培養(yǎng)板對應(yīng)微孔中。細(xì)胞培養(yǎng)板各微孔中分別加入150 μL磷饑餓處理后的東海原甲藻藻液，進(jìn)行藻類培養(yǎng)實驗，實驗體積為200 μL，設(shè)置2組平行實驗。細(xì)胞培養(yǎng)板同時放置于同一個光照培養(yǎng)箱進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)周期為10 d。同時為防止孔板中的培養(yǎng)液蒸發(fā)和邊緣效應(yīng)，2組培養(yǎng)板分別套上透明的塑封袋，并在空微孔中加入滅菌海水。接種后暫養(yǎng)1 d，次日起為第1天，之后每天定期放入酶標(biāo)儀(Perlong DNM-9602)中檢測各微孔的吸光度。

1.3 測定和計算方法

1.3.1 細(xì)胞計數(shù)

在徠卡顯微鏡(Leica BM-E)下用0.1 mL(20 mm×20 mm)浮游生物計數(shù)框計數(shù)，根據(jù)公式(1)[17]計算細(xì)胞初始密度，考慮到實驗藻種增殖期間單個細(xì)胞的體積差較大，本實驗以生物量評價藻種在不同磷源中的生長情況。實驗東海原甲藻初始密度為1.04×107cells/L，于徠卡顯微鏡下拍照計算東海原甲藻的直徑大小并取其平均值，將東海原甲藻視為球體計算出體積，藻類的比重接近1，因此，可由藻類體積直接換算生物量(濕重)，藻類生物量為細(xì)胞密度乘以藻體平均體積，單位為mg/L或g/m3[17]，實驗藻種東海原甲藻的平均體積為0.08×10-4mg/L，由此初始生物量為83.20 mg/L。

(1)

式中，N為細(xì)胞豐度(cells/L)；S為計數(shù)框面積(mm2)；S0為計數(shù)視野面積(mm2)；V0為濃縮后體積(mL)；V為計數(shù)體積(mL)；n為計數(shù)所得藻類個數(shù)(cells)。

1.3.2 酶標(biāo)儀分析

為了方便測量細(xì)胞數(shù)量，每天同一時間用酶標(biāo)儀測定各孔板的OD值，檢測波長450 nm處的吸光度[18]。本研究先測定波長為450 nm下不同細(xì)胞密度(cells/L)對應(yīng)不同生物量(mg/L)的藻體與OD值之間的線性關(guān)系，發(fā)現(xiàn)東海原甲藻生物量在OD450 nm線性關(guān)系較好。

藻體生物量(mg/L)=(OD450-0.136 1)/0.000 2(R2=0.927 2)

(2)

1.3.3 生長動力學(xué)參數(shù)

比生長速率(μ)的計算公式(3)[19]：

μ=(lnXt-lnX0)/t

(3)

式中，X0表示初始細(xì)胞生物量(mg/L)；Xt表示t天后細(xì)胞生物量(mg/L)；t表示天數(shù)(d)。

2 結(jié)果與討論

通過單培養(yǎng)東海原甲藻結(jié)果發(fā)現(xiàn)其對不同磷源的利用具有選擇性，圖1為不同時期單培養(yǎng)東海原甲藻時磷源生態(tài)位分布。根據(jù)每天計算的各微孔中的生物量水平和變化情況發(fā)現(xiàn)，培養(yǎng)第8天總體生物量水平達(dá)到最高，培養(yǎng)第9天生物量水平存在下降趨勢，培養(yǎng)實驗第10天結(jié)束。東海原甲藻對不同磷源利用的比生長率如圖2所示。

2.1 東海原甲藻對有機磷的利用差異

東海原甲藻對各磷源的利用效果和方式存在差異。由實驗結(jié)果得出有47種磷(5種DIP、42種DOP)可以被東海原甲藻利用。本研究發(fā)現(xiàn)東海原甲藻對磷酸乙醇酸(Phospho-glycolic acid)利用效果最好，次之D-甘露糖-1-磷酸(D-mannose-1-phosphate)和磷酸烯醇式丙酮酸(Phosphoenol pyruvate)，三者可以促進(jìn)東海原甲藻的增殖，第8天生物量分別高達(dá)1 107.00、802.00和619.50 mg/L，培養(yǎng)周期結(jié)束時第10天的比生長速率分別為0.249、0.214和0.209 d-1，東海原甲藻對部分核苷酸(3′-單磷酸胞苷，3′-AMP)、葡萄糖-6-磷酸(D-glucose-6-phosphate，G-6-P)、D-2-磷酸甘油酸(D-2-phospho-glyceric acid)的利用效果較好，3′-AMP能促進(jìn)東海原甲藻的增殖，其比生長率為0.13 d-1；G-6-P比生長率為0.16 d-1；D-2-磷酸甘油酸比生長率為0.13 d-1。本研究結(jié)果與眾多學(xué)者在東海原甲藻對有機態(tài)磷的利用效果的研究方面的結(jié)果相似，說明東海原甲藻在天然海水中可利用的磷源種類較多，在無機磷限制的海域可能具有較強的增殖能力。

從事光呼吸作用研究的學(xué)者發(fā)現(xiàn)了磷酸乙醇酸為該反應(yīng)過程提供原料。光呼吸作用曾被認(rèn)為是無用的耗能過程，但近年來的研究結(jié)果表明光呼吸過程具有重要的意義，如緩解磷不足對于光合作用的限制，從而減輕光抑制[20]。這為解釋東海原甲藻對磷酸乙醇酸的利用效果最佳提供了一個可能原因。

關(guān)于藻類吸收利用有機磷的機理，許多學(xué)者都提出了自己的理論。洪華生等認(rèn)為：一是對于小分子有機磷，其利用機制與無機磷相似，可以直接利用；二是對于大分子有機磷，可能需要通過藻類分泌如堿性磷酸酶等物質(zhì)的作用，被間接利用[21]。林森杰等探究米氏凱倫藻對G-6-P的生物利用度及分子機制，發(fā)現(xiàn)G-6-P可以被直接利用，認(rèn)為可能是因為其作為多種代謝途徑的底物，直接攝取能節(jié)省水解有機磷和磷酸化的能量[22]。而相比于直接利用，相關(guān)誘導(dǎo)酶的合成和分泌可能需要一段時間，這可能會造成藻體生物量水平變化的差異[13]。因此，在本實驗結(jié)果中，各種磷的利用效果的差異可能與藻類對不同磷源的利用機理和體內(nèi)酶的種類有關(guān)，具體機理還有待進(jìn)一步研究。

2.2 東海原甲藻對某些有機磷和無機磷的利用效果比較

由本研究實驗結(jié)果(圖1和圖2)所知，東海原甲藻對某些有機磷的利用效果與對無機磷的利用效果相當(dāng)甚至更高。東海原甲藻利用的5種無機態(tài)磷：磷酸鹽、焦磷酸鹽、三偏磷酸鈉、三聚磷酸鹽、次磷酸鈉，其最高生物量(第8天)分別達(dá)到502.00、467.00、279.50、314.50、159.50 mg/L，培養(yǎng)周期結(jié)束時(第10天)生物量分別為362.00、379.50、147.00、182.00、89.50 mg/L，比生長速率分別為0.14、0.15、0.06、0.08、0.01 d-1。東海原甲藻對硫代磷酸鹽(酯)、磷酸烯醇式丙酮酸、磷酸乙醇酸、D-甘露糖-1-磷酸、D-甘露糖-6-磷酸、六磷酸肌醇(植酸)在生物量最高和培養(yǎng)周期結(jié)束時的生物量水平均高于無機態(tài)磷，這6種有機磷和二硫代磷酸鹽、D-G6P等磷源培養(yǎng)的東海原甲藻比生長率也高于上述5種無機態(tài)磷。趙艷芳等利用NaH2PO4、G-P、ATP 和G-6-P等4種磷源對東海原甲藻進(jìn)行培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)有機磷源對東海原甲藻的增殖作用效果比無機磷酸鹽稍好[13]，與本次實驗結(jié)果相似，這表明有機磷化合物在東海原甲藻赤潮的形成過程中可能發(fā)揮著不可忽視的作用。

2.3 東海原甲藻可利用的有機態(tài)磷的酯鍵比較

3 結(jié)論

1)東海原甲藻可以利用PM4A 板上59種磷源中的47種磷，其中無機磷5種、有機磷42種，但是利用效果各不相同，對磷酸乙醇酸、D-甘露糖-1-磷酸和磷酸烯醇式丙酮酸的利用效果較好。

2)東海原甲藻對PM4A 板上的含有C-O-P酯鍵的有機磷利用效果更好，某些有機磷對于東海原甲藻的營養(yǎng)價值高于無機磷，這表明有機磷可能成為影響東海原甲藻類生長的重要磷源。