顧國民 朱曉丹 朱紅革 劉春玲

摘要：目的? 探討新疆地區(qū)的非小細(xì)胞肺癌（NSCLC）患者的驅(qū)動基因類型，同時通過案例分析和評估二代測序應(yīng)用在靶向治療的價(jià)值，為臨床工作提供理論依據(jù)。方法? 選取2015 年9 月～2017 年8月在新疆醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院肺內(nèi)科二病區(qū)診治的NSCLC患者43例，使用二代測序技術(shù)選取與肺癌密切相關(guān)的40個基因的全部外顯子區(qū)域的40基因panel，對納入本研究的患者的外周血樣本進(jìn)行高通量測序。結(jié)果? 對本研究3例NSCLC患者外周血樣本通過高通量測序發(fā)現(xiàn)突變位點(diǎn)為52個，其中有9例患者存在雙突變或多個突變位點(diǎn)。EGFR的突變率為40%;EGFR 19 DEL為23.2%;EGFR L858R突變率為7%;EGFR T790M突變率為11.6%;EGFR的少見突變率為7%，18例患者中存在5例雙突變。ALK融合突變率為2%，ROS1融合突變率為2%，HER突變率為4%，DNMT3A的突變率為4%，其余基因突變率為2%。對患者的外周血樣本進(jìn)行NGS測序，本研究中篩選出3例NGS檢測陽性后服用靶向藥物的患者，服用相應(yīng)靶向藥物后，腫瘤病灶均有明顯縮小，患者身體狀態(tài)均有改善。結(jié)論新疆地區(qū)的非小細(xì)胞肺癌患者的基因分型和東亞基因分型類似，二代測序液體活檢有助于指導(dǎo)臨床靶向治療提供參考。

關(guān)鍵詞：非小細(xì)胞肺癌;基因分型; EGFR;ALK;ROS1

中圖分類號：R743.2? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?DOI：10.3969/j.issn.1006-1959.2020.15.026

文章編號：1006-1959（2020）15-0085-04

Abstract：Objective? To discuss the driver gene types of non-small cell lung cancer （NSCLC） patients in Xinjiang， and at the same time analyze and evaluate the value of next-generation sequencing in targeted therapy through case analysis and provide theoretical basis for clinical work.Methods? A total of 43 patients with NSCLC who were diagnosed and treated in the second ward of the Department of Pulmonary Medicine，the Affiliated Tumor Hospital of Xinjiang Medical University from September 2015 to August 2017， were selected using next-generation sequencing technology to select all exon regions of 40 genes closely related to lung cancer the 40-gene panel for high-throughput sequencing of the peripheral blood samples of patients included in this study.Results? High-throughput sequencing of the peripheral blood samples of 3 NSCLC patients in this study found 52 mutation sites， of which 9 patients had double mutations or multiple mutation sites. The mutation rate of EGFR was 40%; the mutation rate of EGFR 19 DEL was 23.2%; the mutation rate of EGFR L858R was 7%; the mutation rate of EGFR T790M was 11.6%; the rare mutation rate of EGFR was 7%. There were 5 double mutations in 18 patients. The ALK fusion mutation rate was 2%， the ROS1 fusion mutation rate was 2%， the HER mutation rate was 4%， the mutation rate of DNMT3A was 4%， and the mutation rate of other genes was 2%. NGS sequencing was performed on the peripheral blood samples of the patients. In this study， 3 patients who took targeted drugs after NGS testing were screened out. After taking the corresponding targeted drugs， the tumor lesions were significantly reduced and the patient's physical condition was improved.Conclusion? The genotyping of patients with non-small cell lung cancer in Xinjiang is similar to that of East Asia. The next-generation sequencing liquid biopsy can help guide clinical targeted therapy and provide a reference.

Key words：Non-small cell lung cancer;Genotyping;EGFR;ALK;ROS1

肺癌（lung cancer）是一種常見的惡性腫瘤，其發(fā)病率和病死率一直居全球各類腫瘤的首位，大約每年有1800萬患者診斷為肺癌，每年約有1600萬肺癌患者死亡[1，2]。因?yàn)榉制诤偷貐^(qū)差異，肺癌5年生存率為4%～17%。其中非小細(xì)胞肺癌占全部肺癌的80%～90%，且近年來隨著環(huán)境污染的日益加重，肺癌的患病人數(shù)持續(xù)增加[1，3]。肺癌的惡性程度較高，且容易復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移，嚴(yán)重影響患者的治療和預(yù)后，因此，選擇合理有效的治療方式對于提高患者的生活質(zhì)量，延長其生存期并進(jìn)一步降低死亡率具有重要的意義[2]。目前，臨床上治療肺癌的方式主要有外科手術(shù)、化療、放療、中醫(yī)治療、分子靶向治療、免疫治療等，手術(shù)治療是最為常用也是最有效的治療方式，可有效切除癌變組織，防止其轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)，治療效果較好，但大多數(shù)患者初診時已為局部晚期或晚期，失去了手術(shù)的機(jī)會[3-7]。分子靶向藥物治療具有安全性好、耐用性強(qiáng)等特點(diǎn)，且可以直接作用于癌變組織，現(xiàn)已成為治療惡性腫瘤的重要手段[8-12]。本研究通過新一代測序技術(shù)（next-generation sequencing technology）對新疆地區(qū)的非小細(xì)胞肺癌患者的外周血中的ctDNA基因檢測，為了進(jìn)一步探討新疆地區(qū)的非小細(xì)胞肺癌患者的基因分型，同時通過案例分析和評估二代測序在靶向治療的治療效果為臨床提供理論依據(jù)。

1資料與方法

1.1一般資料? 本研究經(jīng)過新疆醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院倫理文員會審批，選取2015年9月～2017年8月在新疆醫(yī)科大學(xué)第三附屬腫瘤醫(yī)院肺內(nèi)科二病區(qū)診治的NSCLC患者43例為研究對象，患者知情同意并簽署同意書。其中男性27例，女性16例;年齡41～75歲，平均年齡（56.96±12.43）歲;納入標(biāo)準(zhǔn)：? ①患者臨床資料保存完整;②患者均有外周血樣本;③抽取外周血樣本前兩周內(nèi)未接收化療藥物治療 和未發(fā)生有炎癥的患者;④患者的NSCLC分期均為Ⅲb～Ⅳ期。

1.2標(biāo)本采集? 對納入本研究的患者于診斷明確后或疾病進(jìn)展后低脂飲食狀態(tài)下進(jìn)行血液標(biāo)本采集，抽取10ml 外周血，使用專門為保存循環(huán)腫瘤DNA（ctDNA）BCT管，血液收集在BCT管后立即上下顛倒混勻10次，常溫15 ℃～37 ℃運(yùn)輸。

1.3檢測方法? 采用二代測序，使用諾禾致源的與腫瘤密切相關(guān)的40個基因的全部外顯子區(qū)域的40基因panel對納入本研究的患者的外周血樣本進(jìn)行高通量測序。

1.4評判標(biāo)準(zhǔn)? 肺腺癌TNM 分期以AJCC 第七版分期系統(tǒng)為標(biāo)準(zhǔn)[5];治療療效采用實(shí)體瘤療效評價(jià)標(biāo)準(zhǔn)RECIST標(biāo)準(zhǔn)1.1 版[6]，療效分為完全緩解、部分緩解、疾病穩(wěn)定和疾病進(jìn)展?？偩徑饴?（完全緩解+部分緩解）/總例數(shù)×100%。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)方法? 采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料采用（x±s）進(jìn)行描述，組間比較使用t 檢驗(yàn);計(jì)數(shù)資料采用（%）進(jìn)行描述，組間比較使用？字2檢驗(yàn)。以P<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1患者的一般病理特征? 不同性別、年齡、吸煙史、PS評分、EGFR突變狀態(tài)比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）;其中腺癌患者占多數(shù)，鱗癌患者占26%，大細(xì)胞癌占4.3%。不同病理類型及不同期別比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），見表1。

2.2新疆地區(qū)非小細(xì)胞肺癌患者基因類型? 本研究中43例NSCLC患者外周血樣本高通量測序發(fā)現(xiàn)突變位點(diǎn)為52個，其中有9例患者存在雙突變或多個突變位點(diǎn)。EGFR的突變率為40%;EGFR 19 indel為23.2%;EGFR L858R突變率為7%;EGFR T790M突變率為11.6%;EGFR的稀有突變率為7%，18例患者存在5例雙突變。ALK融合突變率為2%，ROS1融合突變率為2%，HER突變率為4%，DNMT3A的突變率為4%，其余基因突變率為2%，見圖1。

2.3案例分析? 對患者的外周血樣本進(jìn)行NGS測序篩選出3例NGS檢測陽性后服用靶向藥物的患者，服用相應(yīng)靶向藥物后，腫瘤病灶均有明顯縮小，患者身體狀態(tài)均有改善。

2.3.1 EGFR-TKI耐藥后T790M陽性服用奧西替尼1例? 患者XX，女性，59歲，漢族，2016年11月確診為“左肺上葉腺癌cTxN3M1 Ⅳ期（EGFR L858R M+），左鎖骨上淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，腦、骨轉(zhuǎn)移”，于2016年11月18日行全腦放療，40 Gy/20F，并行鹽酸?？颂婺?125 mg tid po，靶向治療，療效PR。2017年5月17日復(fù)查PD。血標(biāo)本進(jìn)行二代基因檢測示T790M+（突變豐度17.332%），自5月31日起予以奧西替尼80 mg 口服，1次/d，D1-30靶向治療，期間患者仍間斷抽搐，予以抗癲癇等對癥處理，兩月后復(fù)查療效SD，見圖2。定期復(fù)查至2018年4月疾病進(jìn)展，姑息治療后于2018年7月12日死亡。

2.3.2 ALK基因融合陽性服用ALK-TKI 1例? 患者XX，男性 57歲，漢族，2016年9月確診為“右肺上葉腺癌 cT3N2M1 雙肺轉(zhuǎn)移 基因狀態(tài)不明”，給予“培美曲塞+順鉑”方案化療兩周期，復(fù)查疾病進(jìn)展，發(fā)現(xiàn)腦及腦膜轉(zhuǎn)移，惡心、嘔吐、頭暈、頭痛癥狀反復(fù)出現(xiàn)并快速加重。行NGS檢測結(jié)果示ALK基因融合，于2016年11月19日給予克唑替尼進(jìn)行靶向治療，服藥半月后患者頭暈、頭痛及惡心、嘔吐癥狀明顯減輕，一般情況得到明顯改善?；颊哂?017年1月7日入院復(fù)查CT及核磁示肺原發(fā)病灶及腎上腺、顱內(nèi)轉(zhuǎn)移灶均較前好轉(zhuǎn)，且患者腦轉(zhuǎn)移及腦膜轉(zhuǎn)移癥狀基本完全緩解，療效評價(jià)為PR。繼續(xù)服用分子克唑替尼進(jìn)行靶向治療?；颊哂?017年2月20日逐漸出現(xiàn)頭暈、惡心，癥狀逐漸加重，并出現(xiàn)頭痛、納差、消瘦、乏力等癥狀，就診我院復(fù)查，肺部病灶穩(wěn)定，腦轉(zhuǎn)移進(jìn)展，后癥狀進(jìn)行加重并反復(fù)出現(xiàn)抽搐及嗜睡。于2017年3月初患者自服勞拉替尼進(jìn)行靶向治療，服藥后1月復(fù)查療效評價(jià)為PR，癥狀逐漸好轉(zhuǎn)，服藥后有雙下肢浮腫，一般? ?情況明顯恢復(fù)，2018年8月復(fù)查疾病仍為SD，? ?見圖3。

2.3.3 ROS1基因融合陽性服用克唑替尼1例? 患者XX，51歲，男性， 因“咳嗽”就診行CT見右肺上葉占位，并行“右肺上葉腫物切除術(shù)”，術(shù)后診斷右肺腺癌肺內(nèi)轉(zhuǎn)移、胸膜轉(zhuǎn)移（T4N0M1 Ⅳ期）， 2016年10月13日復(fù)查病情進(jìn)展，患者提供的病理切片用ARMS PCR 對EGFR、ALK基因的檢測，結(jié)果示均無突變。后推薦NGS檢測，NGS顯示ROS基因融合，2016年11月5日自行開始口服克唑替尼 200 mg? 2次/d靶向治療，服藥后患者咳嗽氣短癥狀明顯改善，2016年12月7日來院復(fù)查療效SDa，2017年2月23日、4月26日復(fù)查SD，見圖4。2018年4月復(fù)查疾病進(jìn)展，2018年7月21日死亡。

3討論

我國肺癌發(fā)病率為48.32/10萬，死亡率為39.27/10萬，發(fā)病率和死亡率均居惡性腫瘤的首? ?位[3-6]。近年來晚期NSCLC 的治療快速發(fā)展，靶向治療已成為部分肺癌患者治療的重要方式。EGFR基因是目前研究最為成熟的肺癌驅(qū)動基因，EGFR基因突變率在不同種族的人群中存在差異，該基因突變在亞洲人群中最常見。文獻(xiàn)報(bào)道[2]，亞洲人口EGFR基因突變率達(dá)40%，而高加索人群則不足10%。新疆維吾爾自治區(qū)位于中國西北邊陲，地處亞歐大陸腹地，周邊與俄羅斯、哈薩克斯坦、蒙古、印度、阿富汗等8個國家接壤，是個多民族聚居地區(qū)，其中維吾爾族和漢族是兩大主要民族。有研究報(bào)道，當(dāng)前我國新疆地區(qū)的維吾爾族是漢唐時期的回鶻人以及漢族人等人種互相融合的結(jié)果，因此，在本研究中通過新一代測序技術(shù)對新疆地區(qū)的非小細(xì)胞肺癌患者的外周血中的ctDNA基因檢測，為了進(jìn)一步探討新疆地區(qū)的非小細(xì)胞肺癌患者的基因分型，本研究中的43例NSCLC患者外周血樣本通過高通量測序，發(fā)現(xiàn)突變位點(diǎn)為52個，其中有9例患者存在雙突變或多個突變位點(diǎn)。EGFR的突變率為40%;ALK融合突變率為2%，ROS1融合突變率為2%，HER突變率為4%，這與東亞人群的基因分型基本一致，由于本研究樣本較少，可能需要擴(kuò)大樣本群體，進(jìn)一步研究才能提供更可靠的基因突變比例[4，7，10，15]。

甲醛固定石蠟包埋（formalin-fixed paraffin-embedded，F(xiàn)FPE）組織樣本是目前臨床腫瘤最常見的樣本類型[9，10]。但FFPE樣本應(yīng)用于腫瘤個體化治療的分子病理檢測仍有亟待解決的臨床問題，如樣本珍貴，難以再次獲得;核酸高度片段化;DNA、RNA和蛋白質(zhì)產(chǎn)量低等問題。除組織樣本以外，目前血液樣本也被逐漸認(rèn)可，可以作為組織不可取時的首選補(bǔ)充樣本。腫瘤是多基因疾病，若使用單基因檢測平臺進(jìn)行多基因數(shù)據(jù)收集，則不可避免要面臨樣本量不足以完成所需檢測項(xiàng)目、檢測周期長、費(fèi)用昂貴等問題，不利實(shí)現(xiàn)個體化治療[11-14]。近年二代基因測序技術(shù)快速發(fā)展，其應(yīng)用已進(jìn)展至臨床檢測[14，15]。NGS相比于對標(biāo)獲批的AMRS、FISH還是傳統(tǒng)方法Sanger測序或靈敏度更高的數(shù)字PCR平臺均有較高的靈敏度和特異性，同時還能實(shí)現(xiàn)多基因的突變檢出，在節(jié)約樣本和時間的同時，有效降低了檢測費(fèi)用，為患者治療效果的提升提供極大幫助，另外對于新發(fā)現(xiàn)的稀有基因變異，也可以供臨床醫(yī)生做一定的科學(xué)研究，提高醫(yī)院科室的學(xué)術(shù)水平[8，11，14，15]。本研究對患者的外周血樣本進(jìn)行NGS測序，篩選出3例NGS檢測陽性后服用靶向藥物的患者，服用相應(yīng)靶向藥物后，腫瘤病灶均有明顯縮小，患者身體狀態(tài)均有改善。因此，二代測序液體活檢可以為指導(dǎo)臨床靶向藥物用藥的提供參考。

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收稿日期：2020-06-02;修回日期：2020-06-28

編輯/肖婷婷