劉瓊丹，黎 敏，朱兆榮,2，劉 娟,2

(1.西南大學動物科學學院中藥創(chuàng)新實驗室，重慶 榮昌 402460 ； 2.重慶市高校獸醫(yī)科學工程研究中心中獸藥創(chuàng)新實驗室，重慶 榮昌 402460)

雛雞在生長發(fā)育過程中，由于體溫調節(jié)機制不健全、消化系統(tǒng)發(fā)育不健全、抵抗力弱等生理特點，使其容易遭受外邪入侵，從而導致發(fā)病，嚴重影響雛雞的生長發(fā)育，給養(yǎng)殖業(yè)帶來了很大的經濟損失。研究表明，中藥具有防病促生長的作用[1-3]。故根據(jù)中藥配伍原則，選用自擬方蒲翹散為受試藥物，主要由蒲公英、金銀花、連翹等中藥材組成，此中藥方具有清熱解毒、理氣健脾等功效，蒲公英、金銀花、連翹具有提高機體免疫的功能[4-6]。由于中草藥的細胞具有細胞壁，常規(guī)的一些提取方法很難將其破壞，導致包漿中的有效成分提取不充分，提取率降低、使中草藥藥效降低[7]。大量研究表明，經微生物發(fā)酵后，有效成分釋放出來，可以使中草藥有效成分提取率提高，毒性降低、藥效提高?？莶菅挎邨U菌是生存能力強的好氧菌，具有調節(jié)腸道菌群平衡、增強動物免疫力、提高生長性能等諸多功能，被認為是最理想的益生菌[8]，因此廣泛應用于中藥發(fā)酵的研究。本試驗通過自擬方蒲翹散，以枯草芽孢桿菌作為發(fā)酵菌種，篩選出最佳發(fā)酵條件，并通過動物體內試驗對發(fā)酵處方的藥效進行初步觀察，為蒲翹散發(fā)酵物的臨床用藥提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 菌種及藥材 枯草芽孢桿菌(由本校微生物實驗室提供)，蒲公英、金銀花、連翹等，購自重慶市迪盛醫(yī)藥有限公司。

1.2 培養(yǎng)基和試劑 營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基(BR，批號:20160408)、營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基(BR，批號:20160116)，均購自北京奧博星生物技術責任有限公司；蘆丁對照品，購自中國食品藥品檢定研究院，批號:100080-201409。

1.3 主要儀器 立式壓力蒸汽滅菌器(型號：YXQ-LS-30S)，購自上海博訊實業(yè)有限公司；隔水式恒溫培養(yǎng)箱(型號：GNP-9080)，購自上海精宏實驗設備有限公司；MLL-16A型低溫離心機，購自海菲恰爾分析儀有限公司。

1.4 實驗動物 1日齡健康紅羽肉雞，公母各半，初始平均體重為51.29 g/只，由西南大學榮昌校區(qū)實驗動物科提供。

1.5 蒲翹散發(fā)酵條件篩選

1.5.1 發(fā)酵菌種的活化 將保存的枯草芽孢桿菌接種到營養(yǎng)肉湯液體培養(yǎng)基的試管中，于37 ℃培養(yǎng)24 h，傳代2次后的菌液用鉤菌環(huán)將其接種于營養(yǎng)瓊脂固體培養(yǎng)基，于37 ℃培養(yǎng)24 h，挑取單個菌落于裝有10 mL液體培養(yǎng)基的試管中，于37 ℃培養(yǎng)24 h，置4 ℃冰箱中備用。

1.5.2 種子液的制備 將活化好的枯草芽孢桿菌按1%的量接種于裝有營養(yǎng)肉湯液體培養(yǎng)基，于震蕩培養(yǎng)箱，溫度37 ℃，轉速180 r/min培養(yǎng)24 h，置4 ℃冰箱保存，備用。

1.5.3 蘆丁標準曲線制備 取蘆丁對照品9.7 mg，精密稱量，置于50 mL量瓶中，加適量的甲醇溶解，再加蒸餾水至刻度，搖勻，即得對照品標準溶液(每1 mL含蘆丁0.194 mg)。精密量取對照品溶液，0.0、0.2、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mL和3.0 mL，分別置10 mL容量瓶中，各加蒸餾水至3 mL，加5%亞硫酸鈉溶液0.4 mL，混勻，放置6 min；再加10%硝酸鋁溶液0.4 mL，混勻，放置6 min；加4%氫氧化鈉溶液4.0 mL，再加蒸餾水至刻度，搖勻，放置15 min，以加對照品溶液0.0 mL的試劑為空白，質量濃度為橫坐標，計算回歸方程，制定標準曲線，作為中藥發(fā)酵物黃酮含量檢測備用。

以相應試劑為空白，在波長為510 nm處測吸光度，得蘆丁標準曲線圖，見圖1，得到回歸方程：y=12.242x-0.010 6，R2=0.998 3。結果表明，蘆丁檢測濃度在0.005～0.06 mg/mL 范圍內與吸光度呈良好線性關系。

圖1 標準品蘆丁的標準曲線

1.5.4 發(fā)酵條件優(yōu)化 采用單因素試驗方法對初始pH值、發(fā)酵溫度、接菌量、轉速、時間進行優(yōu)化，每組3個平行，并測定總黃酮含量，確定最佳發(fā)酵條件。

(1)發(fā)酵培養(yǎng)基初始pH值：對發(fā)酵培養(yǎng)基發(fā)酵前的pH值(4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0)進行篩選。(2)發(fā)酵溫度：對不同溫度(25、30、35、40 ℃和45 ℃)進行篩選。(3)發(fā)酵接菌量：對不同接菌量(0.5%、1%、2%、4%、6%、8%)進行篩選。(4)發(fā)酵轉速：對不同轉速(120、150、180、210 r/min 和240 r/min)進行篩選。(5)發(fā)酵時間：對不同時間(12、24、36、48 h和60 h)進行篩選。

1.5.5 優(yōu)化發(fā)酵條件驗證 將以上優(yōu)化后的發(fā)酵條件組合，進行驗證試驗，并將蒲翹散藥液與發(fā)酵液進行比較，每組3個平行，發(fā)酵后對其總黃酮含量進行測定。

1.6 對肉雛雞生產性能和免疫功能的影響

1.6.1 動物分組與處理 用1日齡健康紅羽肉雛雞180只，隨機分為空白組、菌液組(菌液組)，發(fā)酵藥液組(即未經滅菌處理的)I、II、III組，發(fā)酵藥液滅菌組(IV組)，共6個組，每組設3個重復，每個重復10只。各組處理為：空白組肉雞飼料中添加0.5%的蒸餾水；菌液組添肉雞飼料中加0.5%的菌液(含菌量與試驗II組一致); 發(fā)酵藥液I、II、III組肉雞飼料中分別添加蒲翹散發(fā)酵液0.25%、0.5%、1.0%；發(fā)酵藥滅菌組肉雞飼料中添加0.5%的經滅菌處理的蒲翹散發(fā)酵物。8日齡接種新-流二聯(lián)苗，21日齡接種傳染性囊病活疫苗，以點眼滴鼻方式接種，飼料配方及營養(yǎng)見表1。

表1 基礎日糧組成及營養(yǎng)水平 (%)

1.6.2 測定指標及方法

1.6.2.1 生長性能指標 試驗期間，每天記錄飼喂飼料量，剩余飼料量，灑落飼料量，并計算出每天的實際采食量。計算各階段平均日增重、料重比。平均日增重=(階段末重-階段始重)/階段天數(shù)；料重比=階段實際總采食量/階段總增重。

1.6.2.2 免疫器官指數(shù) 將上述46日齡雛雞采血后致死，取脾臟、法氏囊稱重，計算免疫器官指數(shù)。免疫器官指數(shù)=免疫器官重量(g)/宰前空腹活重(100 g)。

1.7 數(shù)據(jù)處理 采用Excel對數(shù)據(jù)進行收集和簡單處理，再用SPSS 22.0統(tǒng)計軟件用方差分析度數(shù)據(jù)進行系統(tǒng)分析，結果采用平均值±標準差。

2 結果

2. 1 發(fā)酵條件優(yōu)化后對蒲翅散發(fā)酵液中總黃酮含量的影響 由圖2(A)可知，隨著發(fā)酵培養(yǎng)基初始pH值的增大，蒲翹散發(fā)酵液中總黃酮的含量先增加后降低，當初始pH值為5.0時蒲翹散發(fā)酵液中總黃酮含量達到最高，發(fā)酵培養(yǎng)基初始pH值在5.0～5.5時，蒲翹散發(fā)酵液中的總黃酮含量變化不明顯，由于其發(fā)酵培養(yǎng)基發(fā)酵前未經調節(jié)的pH值在5.2～5.4，最后確定發(fā)酵培養(yǎng)基初始pH值5.2～5.4為最佳。由圖2(B)可知，蒲翹散發(fā)酵液中總黃酮含量隨溫度的增加呈現(xiàn)先增加后降低，當發(fā)酵溫度為35 ℃時蒲翹散發(fā)酵液中總黃酮含量達到最高，因此，采用35 ℃為最佳發(fā)酵溫度。由圖2(C)可知，當接菌量為2%時蒲翹散發(fā)酵液中總黃酮含量達到最高，超過2%時蒲翹散發(fā)酵液中總黃酮含量反而降低，因此，采用2%為最佳發(fā)酵接菌量。由圖2(D)可知，隨著搖床轉速的增加，蒲翹散發(fā)酵液中總黃酮含量也逐漸增加，在210 r/min時總黃酮含量達到最高，轉速超過210 r/min時，蒲翹散發(fā)酵液中總黃酮含量反而降低。因此，采用轉速為210 r/min為最佳發(fā)酵轉速。由圖2(E)可知，總黃酮含量隨著時間的不同呈現(xiàn)出一定的周期性變化，每隔24 h總黃酮含量上升后又下降，分別在24 h和48 h處出現(xiàn)峰值，但在24 h時蒲翹散發(fā)酵液中總黃酮含量最高，發(fā)酵時間相比較短，因此，采取發(fā)酵24 h為最佳發(fā)酵時間。圖2(F)可知，發(fā)酵后蒲翹散發(fā)酵液中總黃酮含為83.150 mg/g，未發(fā)酵蒲翹散中總黃酮含量為79.065 mg/g，發(fā)酵比未發(fā)酵蒲翹散總黃酮提取含量增加5.17%。

2.7 蒲翹散發(fā)酵液對肉雛雞生長性能的影響 試驗結果顯示，在0～21日齡階段，各試驗組肉雛雞的平均日增重高于空白組，差異極顯著(P<0.01)。各試驗組肉雛雞的料重比低于空白組，差異極顯著(P<0.01)。試驗Ⅱ組肉雛雞的平均日增重與空白組比較增加27.3%，料重比與空白組比較降低12.1%。在21～46日齡階段，與空白組比較，各試驗組平均日增重增加，差異極顯著(P<0.01)；與空白組比較，菌液組肉雛雞平均日增重增加18.5%，試驗Ⅰ組肉雛雞增加8.7%，試驗Ⅱ組肉雛雞增加7.0%，試驗Ⅲ組增加5.7%，試驗Ⅳ組肉雛雞增加19.8%。各試驗組的料重比與空白組比較，差異顯著(P<0.05)，其中試驗Ⅱ組的料重比最小，比空白組降低18.2%。見表2。

2.8 發(fā)酵物對肉雛雞免疫器官指數(shù)的影響 結果顯示，與空白組比較，試驗Ⅱ組和Ⅳ組肉雛雞的脾臟指數(shù)，差異顯著(P<0.05)。各試驗組肉雛雞的法氏囊指數(shù)，差異都不顯著(P>0.05)，其中除試驗Ⅱ組外，其他組肉雞的法氏囊指數(shù)都高于空白組。綜合上述結果可以得到蒲翹散發(fā)酵物對肉雛雞的免疫器官發(fā)育都有一定的促進作用，其中蒲翹散發(fā)酵經滅菌的藥物對肉雛雞脾臟和法氏囊的增重效果最好，見表3。

表2 蒲翹散發(fā)酵物對肉雛雞生長性能指標影響

3 討論

蒲翹散主要由蒲公英、金銀花、連翹等中藥材組成，具有清熱解毒、理氣健脾等功效。研究表明，大多數(shù)清熱解毒的中藥具有抗菌、抗病毒、增強機體免疫力等作用，理氣健脾的中藥可以調節(jié)腸胃、促進消化[9]，因此根據(jù)中藥處方配伍原則，選擇蒲翹散作為受試藥物。

枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)是我國農業(yè)部允許作為飼料添加劑的2種芽孢桿菌之一，現(xiàn)已在畜牧業(yè)、飼料行業(yè)中廣泛應用。枯草芽孢桿菌作為一種益生菌被研究者們廣泛應用于各種發(fā)酵研究，在發(fā)酵過程中，適宜發(fā)酵條件對菌株的發(fā)酵水平有很大影響，在不同的發(fā)酵條件下產酶量也不同?？莶菅挎邨U菌自身生長也需要一定的條件，如溫度、pH值、發(fā)酵時間、發(fā)酵轉速等都影響其生長。pH值會影響微生物對培養(yǎng)基營養(yǎng)物質的吸收，最終影響微生物的生長和代謝產物的合成[10]。溫度在微生物生長過程中通過影響其胞內生物大分子的活性來影響微生物的代謝活動，溫度太高或太低都會對微生物的生長造成不利的影響。接種量過小容易造成發(fā)酵周期的延長，而接種量過大又會引入較多的代謝廢物及快速的消耗營養(yǎng)物質，影響誘導酶的合成[11-13]。黃酮類物質是許多中藥的活性成分，具有抗菌、抗病毒、抗氧化等作用[14]。本試驗自擬方蒲翹散，其主要成分蒲公英、金銀花、連翹等含有黃銅成分[15-17]，因此，選用黃酮含量作為發(fā)酵條件優(yōu)化的判斷依據(jù)。本試驗得出，蒲翹散發(fā)酵條件為：發(fā)酵培養(yǎng)基初始pH值5.2～5.4，溫度35 ℃，接菌量2%，轉速210 r/min，發(fā)酵24 h。優(yōu)化后的初始pH值和溫度與文獻[18]研究的枯草芽孢桿菌發(fā)酵條件初始pH值為6.0，溫度為35 ℃結果相近。接菌量和發(fā)酵轉速與文獻[19]研究的枯草芽孢桿菌B908的發(fā)酵結果(接菌量2%，搖床轉速200 r/min)相似。發(fā)酵優(yōu)化后總黃酮含量提高5.17%，與文獻[20]結果一致。

表3 蒲翹散發(fā)酵物對肉雛雞免疫臟器指數(shù)的影響 (g/100 g)

發(fā)酵中藥主要被廣泛應用于畜禽生產，主要用于抗病、促生長等，通常將發(fā)酵后的中藥添加到飼料中，來代替抗生素的使用。發(fā)酵中藥組對肉雛雞的生產性能作用顯著高于中藥組[21]。張凱等研究表明，發(fā)酵黃芩提取物能顯著降低乳酸脫氫酶的活性[22]。發(fā)酵黃芪藥渣能夠提高青腳麻雞的生產性能以及免疫力水平[23]。本試驗表明，蒲翹散發(fā)酵藥物對肉雛雞的生長有促進作用，提高動物的生產性能。結果與上述研究一致，但不同添加劑量對肉雛雞的生長性能的影響有所不同，在添加劑量為0.5%時最為合適。

Rivas等研究發(fā)現(xiàn)，胸腺、脾臟和法氏囊的重量可以用來衡量雛雞的免疫力水平[24]。法氏囊是誘導B淋巴細胞分化和成熟的場所；胸腺是T淋巴細胞分化成熟的免疫中樞器官，胸腺會因為年齡的增長而逐漸退化；禽類的脾臟主要參與免疫功能。本試驗結果顯示，試驗組肉雛雞的脾臟指數(shù)和法氏囊指數(shù)均有不同程度的增加，與文獻[25]結果一致，證明蒲翹散發(fā)酵液能促進免疫器官的發(fā)育。

綜上所述，蒲翹散的最佳發(fā)酵條件為發(fā)酵培養(yǎng)基的初始pH值5.2～5.4，溫度35 ℃，接菌量2%，轉速210 r/min，發(fā)酵24 h，發(fā)酵優(yōu)化后總黃酮含量提高5.17%。發(fā)酵后能提高肉雛雞的生長性能并對免疫器官的生長發(fā)育也有一定的促進作用。