羅陽瑞，王 晗，代奉林，黃紅云，樊汶樵，姜玉松，李曉英

(重慶文理學(xué)院林學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院 重慶文理學(xué)院水生動(dòng)物疫病防控研究所，重慶 永川 402168)

抗菌肽是分子質(zhì)量小、兩親性、帶正電的非特異性物質(zhì)[1-2]，多為α螺旋結(jié)構(gòu)，天蠶素是最早被發(fā)現(xiàn)的，目前研究最清晰，效果最顯著的一類抗菌肽。早在1972年，瑞典科學(xué)家Boman等[3]從美國希古比天蠶蛹(Hyalophoracecropia)中獲得抗菌肽，并將其命名為Cecropin；隨后，Boman等測(cè)定了天蠶素抗菌肽A (Cecropin A) 和天蠶素抗菌肽B (Cecropin B)的一級(jí)結(jié)構(gòu)[4]。目前，天蠶素抗菌肽家族已被分為A、B、C、D、E共5個(gè)成員，其中Cecropin B具有最高的抗菌活性[5-6]。

魚類是較低等的脊椎動(dòng)物，缺乏完善的免疫系統(tǒng)來抵抗微生物的侵襲，其皮膚、黏膜存在的免疫活性因子在主動(dòng)防御中發(fā)揮著重要作用[7]?？咕氖囚~類自身先天免疫的重要組成成分，研究抗菌肽在魚類中的應(yīng)用，不僅為預(yù)防魚類病害開辟新途徑，還能拓展抗菌肽在漁業(yè)生產(chǎn)中潛在的應(yīng)用領(lǐng)域。天蠶素抗菌肽B抗菌譜廣，對(duì)多種細(xì)菌性疾病有很強(qiáng)抗性[8]，對(duì)不同種類的病毒也有抵御作用，使其在水產(chǎn)行業(yè)有很好的應(yīng)用前景。

1 Cecropin B的結(jié)構(gòu)與作用機(jī)理

Cecropin B是最早從希古比天蠶中分離得到，由35個(gè)L-氨基酸殘基組成的抗菌肽，其序列為KWKIFKKIEKVGRNIRNGIIKAGPAVAVLGEAKAL[9]，分子量約4 kDa。Hu等[10]認(rèn)為天蠶素抗菌肽B具有兩親性的α螺旋結(jié)構(gòu)，N端形成親水性的α螺旋結(jié)構(gòu)，C端形成疏水性的α螺旋結(jié)構(gòu)且酰胺化[11]。Srisailam等[12]用NMR(核磁共振)測(cè)定Cecropin B1的結(jié)構(gòu)(圖1)，發(fā)現(xiàn)其N端堿性很強(qiáng)，帶正電荷，親水，富含賴氨酸(Lys)和精氨酸(Arg)，N端氨基酸序列比C端對(duì)于其活性具有更重要的作用；如N端第2位上的色氨酸，因色氨酸上有苯環(huán)，會(huì)影響其活性；天蠶素抗菌肽B一般不含半胱氨酸(Cys)，所以不能形成分子內(nèi)的二硫鍵[11-13]。

圖1 Cecropin B1的結(jié)構(gòu)示意圖[12]A：N-末端α-螺旋; B：鉸鏈區(qū); C：C-末端α-螺旋

Cecropin B帶正電，與細(xì)菌接觸時(shí)通過靜電作用，吸附于細(xì)菌表面，先破壞細(xì)菌細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)，使大量的Cecropin B選擇性的堆積在細(xì)胞膜脂質(zhì)表面，達(dá)到一定濃度時(shí)，因?yàn)槠銫端疏水性強(qiáng)，插入細(xì)菌胞膜，造成膜缺陷或形成“孔隙”，改變細(xì)胞通透性，使細(xì)菌內(nèi)容物大量外流，最終導(dǎo)致細(xì)菌死亡[14-16]。其作用機(jī)制如中插彩版圖2所示。

2 Cecropin B在細(xì)菌病中的應(yīng)用

引起魚類疾病的致病菌繁多，主要?dú)w屬于氣單胞菌屬(Aeromonas)、假單胞菌屬(Pseudomonas)、維氏氣單胞菌(A.veronii)、殺鮭氣單胞菌(A.salmonicida)、鰻弧菌(Vibrioanguillarum)等。氣單胞菌會(huì)引起淡水魚細(xì)菌性敗血病、細(xì)菌性腸炎、癤瘡等，假單胞菌屬主要危害鯉魚、草魚等，能引起草魚100%的死亡。Sarmasik A等[17]報(bào)道重組的Cecropin B和Cecropin P1單細(xì)胞克隆入大鱗大麻哈魚(Oncorhynchustshawytscha)胚胎細(xì)胞中，表達(dá)出的雜合天蠶素抗菌肽對(duì)嗜水氣單胞菌(A.hydrophila)、熒光假單胞菌(P.fluorescens)等病原菌有很強(qiáng)的抑菌效果；盧強(qiáng)等[18]將綠色熒光蛋白(GFP)基因與Cecropin B突變體ABP-S1基因進(jìn)行融合表達(dá)，發(fā)現(xiàn)對(duì)銅綠假單胞菌(P.Aeruginosa)、嗜水氣單胞菌等多種病原菌有抑菌效果；王自蕊等[19]向湘云鯽的鰭部注射0.5 mL嗜水氣單胞菌活菌液后，發(fā)現(xiàn)添加Cecropin B組比對(duì)照組的存活率更高。林鑫等[20]在感染維氏氣單胞菌的魚類中添加Cecropin B，10 d后，錦鯉的累積死亡率顯著降低；Kjuul等[21]研究發(fā)現(xiàn)，Cecropin B對(duì)魚的殺鮭氣單胞菌、鰻弧菌、鮭弧菌等多種病原菌都有抑制作用，還發(fā)現(xiàn)隨著氯化鈉鹽濃度的升高，Cecropin B的活性會(huì)明顯降低；Sallum等[22]用鰻弧菌、嗜鹽弧菌(Vibriohalophilus)和耶爾森菌(Yersinia)感染青鳉魚時(shí)，發(fā)現(xiàn)Cecropin B的表達(dá)量會(huì)持續(xù)升高，增強(qiáng)青鳉魚的抵抗力，且這3種誘導(dǎo)產(chǎn)生的抗性與它們超微結(jié)構(gòu)的可逆變化相關(guān)。Lin X等[23]將天蠶素抗菌肽加入到雜交羅非魚日常飼料中，研究發(fā)現(xiàn)，與未添加相比，添加組在生長性能、非特異性免疫能力及對(duì)維氏氣單胞菌的抗感染能力方面均有提高。Elaswad A[24]將Cecropin B的基因轉(zhuǎn)移到鯰魚魚種中，用多毛魚虱(Ichthyophthiriusmultifiliis)這種寄生蟲去感染后，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因鯰魚存活率比普通魚高；Bugg W[25]將Cecropin B的基因轉(zhuǎn)移到斑點(diǎn)叉尾鮰(Ictaluruspunctatus)形成轉(zhuǎn)基因魚，用柱狀黃桿菌(Flavobacteriumcolumnare)和愛德華菌(Edwardsiellaictaluri)去感染，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因魚存活率都要高于普通魚。一系列的報(bào)道表明，Cecropin B在魚類抗細(xì)菌感染中發(fā)揮著重要的作用。

3 Cecropin B在病毒病中的應(yīng)用

病毒性疾病會(huì)嚴(yán)重危害魚類的生長，甚至導(dǎo)致死亡。目前關(guān)于Cecropin B對(duì)魚類病毒性疾病的研究較少。Lo J H等[26]發(fā)現(xiàn)合成肽Cecropin B和模擬Cecropin B結(jié)構(gòu)的模擬肽CF17，能明顯抑制感染性造血壞死病毒(IHNV)、病毒性出血性敗血病病毒(VHSV)、蛇頭棒病毒(SHRV)和感染性胰腺壞死病毒(IPNV)等重要魚類病毒性病原對(duì)機(jī)體的侵襲。2014年，Chiou P P等[27]人工合成Cecropin B基因并構(gòu)建CF-17轉(zhuǎn)基因載體后，植入虹鱒魚精子，隨后用IHNV感染轉(zhuǎn)基因與非轉(zhuǎn)基因的虹鱒，發(fā)現(xiàn)CF-17轉(zhuǎn)基因親本魚對(duì)IHNV的感染具有顯著的抗性；Chia等[28]發(fā)現(xiàn)Cecropin B對(duì)致海洋魚類在幼年期大規(guī)模死亡的神經(jīng)壞死病毒(NNV)有較強(qiáng)的抑制作用。

4 展望

Cecropin B抗菌譜廣，對(duì)魚類多種細(xì)菌性病原體有不同程度的抑制或殺傷作用；鑒于天蠶素抗菌肽結(jié)構(gòu)中沒有二硫鍵，重組表達(dá)中不涉及二硫鍵的重構(gòu)，且鮮有Cecropin B產(chǎn)生耐藥性的報(bào)道，證實(shí)了Cecropin B成為新型抗生素替代品的潛力。然而從希古比天蠶蛹或其他動(dòng)物中提取的Cecropin B含量很少，目前一般采取人工合成的方式獲取該抗菌肽；但人工合成抗菌肽價(jià)格高昂還容易降解，影響了Cecropin B在生產(chǎn)中的廣泛應(yīng)用。在具體的研究中，針對(duì)重組Cecropin B外源蛋白表達(dá)量低、穩(wěn)定性差等問題，研究者多將2個(gè)及以上的目的基因進(jìn)行串聯(lián)表達(dá)，取得了較好的進(jìn)展[29]。隨著基因重組和表達(dá)技術(shù)的不斷進(jìn)步，大量獲得外源性Cecropin B逐漸成為現(xiàn)實(shí)，Cecropin B必將在實(shí)際生產(chǎn)中得到更為廣泛的應(yīng)用。