盧冰霞，劉 磊，周英寧，何 穎，秦毅斌，段群棚，李 斌，陳忠偉，梁家幸，蘇乾蓮，閉炳芬，蔣冬福，盧敬專，楊思儀，趙 武

(廣西獸醫(yī)研究所 廣西獸醫(yī)生物技術重點實驗室，廣西 南寧 530001)

豬圓環(huán)病毒(Porcine circovirus，PCV)為一種共價閉合、單股環(huán)狀DNA病毒，是迄今發(fā)現(xiàn)的最小的動物病毒[1]。2015年前，全球范圍內僅發(fā)現(xiàn)PCV1和PCV2兩個基因型[2]。其中，PCV1被認為對豬無致病性[3]，但PCV2能引起多種豬圓環(huán)病毒相關疾病(PCVAD)，主要有斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征(PMWS)、豬皮炎和腎病綜合征(PDNS)、豬呼吸道疾病綜合征(PRDC)、繁殖障礙、增生性壞死性肺炎(PNP)和腸炎等[4]。臨床上PCV2常與豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)、豬細小病毒(PPV)和豬肺炎支原體(M.hyo)等病原體混合感染。同時，感染PCV2后還容易繼發(fā)細菌感染，給養(yǎng)豬業(yè)造成巨大的經(jīng)濟損失。

2015年6月，美國北卡羅來納州某商品化豬場暴發(fā)PDNS疫情。Palinski等[5]借助新一代測序(NGS)技術，從患病母豬及流產(chǎn)胎兒體內首次鑒定出PCV3。作為新動物病原體，PCV3對豬的致病性、其在PCVAD中的作用以及現(xiàn)有商品化PCV2疫苗對其免疫效果等，均有待進一步研究。

目前已有PCV3在美國、韓國、巴西、意大利、波蘭以及中國的華南、華中和華北多省市流行的報道[5]。養(yǎng)豬業(yè)是廣西的支柱產(chǎn)業(yè)之一，近年來PCV2一直嚴重威脅廣西養(yǎng)豬業(yè)的健康發(fā)展，PCV3的出現(xiàn)使豬圓環(huán)病毒病更加復雜化，且對廣西PCV3的分子流行病學的研究資料尚不多。因此,本試驗對廣西地區(qū)流行的PCV3全基因組進行克隆和遺傳進化分析，旨在了解廣西豬群PCV3的遺傳變異情況，豐富廣西PCV3的分子流行病學資料，從而為有效防控PCV3的發(fā)生與流行提供參考。

1 材料與方法

1.1 毒株來源 10株廣西PCV3陽性樣品(CHGX1776D-2017、CHGX1948-2018、CHGX1963A-2018、CHGX2031-2018、CHGX2051A-2018、CHGX2192A-2018、CHGX2242-2018、CHGX2246-2018、CHGX2248-2018和CHGX2275A-2018)均由本實驗室從發(fā)病豬內臟中鑒定并保存。

1.2 主要試劑 病毒基因組DNA/RNA快速抽提試劑盒為Axygen生物科技有限公司產(chǎn)品；2×F8 Fastlong PCR Master Mix為北京艾德萊生物科技有限公司產(chǎn)品；DL-2 000 DNA Marker為寶生物工程(大連)有限公司產(chǎn)品；其他試劑均為分析純。

1.3 引物的設計與合成 根據(jù)GenBank上登錄的PCV3的全基因組序列，利用MegAlign(DNA-STAR)，Primer Premier 7.0 軟件設計合成覆蓋PCV3全基因組的2對特異性引物PCV3 A-F/ PCV3 A-R和PCV3 B-F/PCV3 B-R。PCV3 A片段上游引物PCV3 A-F：5′-CGGAGGGAAAGCCCGAAAC-3′，PCV3 A片段下游引物PCV3 A-R：5′-CGCCTAAACGAATGGGAAACT-3′，PCR擴增目的片段大小為1 561 bp。PCV3 B片段上游引物PCV3 B-F：5′-TTTCCGCATAAGGGTCGTCTT-3′，PCV3 B片段下游引物PCV3 B-R：5′-CAGGCATCTTCTCCGCAACT-3′，PCR擴增目的片段大小為1 020 bp。引物由寶生物工程(大連)有限公司合成。

1.4 PCV3陽性樣品DNA的提取 按照AxyPrep Body Fluid Viral DNA/RNA Miniprep Kit使用說明書進行DNA提取，所獲得的DNA 用于下一步的PCR反應。

1.5 PCV3 全基因組序列的擴增及測序 PCR反應體系50 μL：滅菌水17 μL，2×F8 Fastlong PCR Master Mix 25 μL，25 μmol/L 上下游引物各1 μL，模板6.0 μL。按照下列條件進行擴增：94 ℃預變性10 min；94 ℃變性10 s，58 ℃復性10 s，72 ℃延伸10 s，40個循環(huán)；最后72 ℃延伸10 min，12 ℃保存。取擴增產(chǎn)物10 μL于10 g/L瓊脂糖凝膠中電泳，并觀察結果。將特異性擴增產(chǎn)物送生工生物工程(上海)股份有限公司進行序列測定。

1.6 序列分析和遺傳進化樹構建分析 將測序結果應用DNASTAR軟件進行全基因組的編輯、拼接，并與GenBank上發(fā)表的國內外PCV3代表株進行比對分析；用MEGA 6.06軟件的鄰位連接法(Neighbor-Joining method)進行遺傳進化分析并繪制遺傳進化樹。

2 結果

2.1 PCV3全基因組的PCR擴增和序列測定 運用PCR方法對10株廣西PCV3陽性樣品進行全基因組的分段擴增，均分別擴增出與預期大小相一致的目的片段，分別約為1 561 bp和1 020 bp，電泳結果見圖1。用DNASTAR軟件對測序序列進行全基因組序列的拼接，結果顯示，10株廣西PCV3全基因組全長均為2 000 bp。

2.2 PCV3全基因組序列測序分析 運用DNA-STAR軟件將拼接好的10株廣西PCV3全基因組序列與GenBank 上已發(fā)表的國內外PCV3全基因組代表株進行比較分析。結果顯示，10株廣西PCV3全基因組序列之間的核苷酸同源性為98.6%～99.8%(其中CHGX2031-2018和CHGX2275A-2018的核苷酸同源性為98.6%，CHGX1963A-2018和CHGX2246-2018的核苷酸同源性為99.8%)。與國內其他毒株的同源性為97.9%～99.8%；與美國毒株的同源性為98.8%～99.4%；與韓國毒株的同源性為98.8%～99.7%；與意大利毒株的同源性為98.9%～99.7%；與巴西毒株的同源性為98.8%～99.3%。

2.3 PCV3全基因組遺傳進化分析 運用MEGA 6.06軟件對基于PCV3全基因組序列進行遺傳進化樹的構建分析，結果表明，本試驗所測得的7個廣西PCV3毒株 CHGX2031-2018、CHGX2242-2018、CHGX2248-2018、CHGX1776D-2017、CHGX1948-2018、CHGX2051A-2018和CHGX2192A-2018與國內毒株CN/Chongqing、CN/Guangdong、CN/Shangdong、CN/Fujian、CN/Henan、CN/Anhui和CN/Jiangxi等以及美國、巴西、韓國和意大利的毒株同在PCV3a亞群；本試驗得到的其他3個廣西PCV3毒株(CHGX1963A-2018、CHGX2246-2018和CHGX2275A-2018)與CN/Guangdong-HZ4、SG1、GDQG1和CN/GXHJ1、GXHJ2、GXLC1、GXLJ1等部分來自廣東和廣西的毒株處在PCV3b亞群(見圖2)。

2.4 PCV3Cap基因序列分析 測序結果分析顯示，10株廣西PCV3Cap基因的大小均為645 bp，編碼214 aa?；蛐蛄斜葘Ψ治鼋Y果顯示，10株廣西PCV3Cap基因之間的核苷酸序列同源性在97.5%～99.8%，編碼的氨基酸序列同源性為96.7%～100%；10株廣西PCV3Cap基因與國內參考株的核苷酸序列同源性在97.2%～99.7%，編碼的氨基酸序列同源性為96.7%～100%；與美國PCV3的核苷酸序列同源性在97.8%～99.5%，編碼的氨基酸序列同源性為97.2%～100%；與韓國PCV3的核苷酸序列同源性在98.0%～99.7%，編碼的氨基酸序列同源性為97.2%～100%；與意大利PCV3的核苷酸序列同源性在97.8%～99.7%，編碼的氨基酸序列同源性為97.2%～100%；與巴西PCV3的核苷酸序列同源性在97.8%～99.4%，編碼的氨基酸序列同源性為97.7%～100%。PCV3Cap基因比較保守，10株廣西PCV3Cap基因與參考株相比，僅存在散在的突變位點。采用MEGA 6.06軟件對PCV3Cap基因序列編碼的214個氨基酸序列與其他參考株基因序列編碼的氨基酸序列進行比對分析并構建系統(tǒng)進化樹，結果顯示，10株廣西PCV3處于3a和3b兩個亞群，只有毒株CHGX2246-2018為PCV3a亞群而基于全基因組序列構建的遺傳進化樹時為PCV3b亞群，利用Simplot 3.5.1軟件對CHGX2246-2018進行重組分析，其與PCV3b亞群的廣西分離株PCV3/CN/GXLJ2/2017 同源性最高，未發(fā)現(xiàn)與其他PCV3a的毒株有重組的現(xiàn)象。其他9株廣西PCV3毒株與基于全基因組序列構建的遺傳進化樹結果基本相同(圖2和圖3)。結果表明，廣西流行的PCV3至少存在2個亞群，而不同亞群PCV3毒株的致病性是否有差異還有待進一步的研究。

3 討論

自2016年美國學者Palinski等[5]借助新一代測序(NGS)技術，從患病母豬及流產(chǎn)胎兒體內首次鑒定出PCV3后，包括美國、韓國、巴西、意大利和中國在內的多個國家和地區(qū)報道了豬群感染PCV3。2017年以來，我國華中、華南和華北的多個省市地區(qū)報道檢測出PCV3。有學者報道，廣西地區(qū)豬群也普遍存在PCV3的感染，Wen S等[6]報道廣西豬群PCV3樣品陽性率為37.96%。本實驗室也采用PCR的方法檢測廣西地區(qū)豬群PCV3的感染情況，廣西地區(qū)14個地市中有10個地市豬群存在PCV3感染，表明廣西受檢豬場豬群PCV3感染較普遍(具體數(shù)據(jù)略)。

本試驗設計了2對PCV3特異性引物，以實驗室鑒定并保存的PCV3陽性DNA為模版，分2段擴增 PCV3全基因組，通過拼接得到了10條PCV3的全基因組序列。將得到的10條廣西PCV3全基因組序列與國內外PCV3代表毒株進行同源性比對，全基因組核苷酸同源性在97.9%～99.8%，說明當前全世界流行的PCV3相對比較保守，并沒有出現(xiàn)大的變異。利用得到的10株廣西PCV3全基因和Cap基因分別構建遺傳進化樹，兩者結果基本一致，均表明本試驗得到的10株PCV3處于PCV3a和PCV3b兩個亞群，與劉相聰?shù)萚7]的研究結果一致。毒株CHGX2246-2018利用Cap基因序列構建遺傳進化樹時屬于PCV3a亞群，而基于全基因組序列構建的遺傳進化樹時為PCV3b亞群，為了了解CHGX2246-2018是否是PCV3a和PCV3b兩個亞群的重組毒株，利用Simplot 3.5.1軟件對CHGX2246-2018進行重組分析，其與PCV3b亞群的廣西分離株PCV3/CN/GXLJ2/2017 同源性最高，未發(fā)現(xiàn)與其他PCV3a的毒株有重組的現(xiàn)象，具體原因有待進一步研究分析。

圖2 基于PCV3全基因組序列遺傳進化樹Fig.2 Genetic evolution tree based on complete genome of PCV3 strain▲:本試驗所測得的廣西PCV3毒株▲:The Guangxi PCV3 strains measured by this research

圖3 基于PCV3 Cap基因的遺傳進化樹Fig.3 Genetic evolution tree based on Cap gene of PCV3 strains▲:本試驗所測得的廣西PCV3毒株▲:The Guangxi PCV3 strains measured by this research

本試驗結果表明，廣西地區(qū)豬群中流行的PCV3至少存在2個亞群(PCV3a亞群和PCV3b亞群)共同流行，不同亞群的PCV3毒株的致病性差異還有待進一步的研究。