吳允正，韓春生，戴益民，2，王林康，王婧祺，張錦華，2*

（1.江西農(nóng)業(yè)大學 動物科學技術學院，江西 南昌 330045；2.江西省畜禽疫病診斷與防控重點實驗室，江西 南昌 330045）

【研究意義】產(chǎn)氣莢膜梭菌（Clostridium perfringens，Cp）是一種革蘭氏陽性產(chǎn)芽胞的厭氧性梭菌，廣泛存在于自然界的土壤、水源及人和動物腸道中[1]。該菌可引起人類及動物多種疾病，從壞死性腸炎到危及生命的氣性壞疽。Cp的毒力與其產(chǎn)生的毒素有關，根據(jù)產(chǎn)生的致死性毒素α，β，ε和ι，通常將Cp分為A、B、C、D、E 五型[2]。A-E 型菌株均可產(chǎn)生α 毒素，而β 毒素存在于B 型和C 型中，ε 毒素由B 型和D 型產(chǎn)生，ι 毒素僅由E 型產(chǎn)生[3]。其他毒素基因，如腸毒素，與特定菌株無關，但與整體毒力有關，且在不同的菌株之間表現(xiàn)不同[4]。近來有學者提出新的分型方案，即增加了F型（α、cpe）和G 型（α、NetB）[5]。A 型Cp（CpA）能引起多種腸道腹瀉性疾?。喝说氖澄镏卸竞蛡魅拘愿篂a，羊、牛、馬、豬、犬等動物的腸毒血癥，禽壞死性腸炎[6]?！厩叭搜芯窟M展】Cp也同樣存在于健康動物的腸道,其中CpA 是分布最廣泛的型[7]。α 毒素為其主要致病因子，α 毒素的本質(zhì)為磷脂酶C，它具有細胞毒性、溶血活性、致死性、皮膚壞死性、血小板聚集和增加血管滲透性等多種特性[8-9]。CpA 除產(chǎn)生對畜禽及人有致病性的α 毒素外，有些菌株還產(chǎn)生β2毒素和腸毒素。β2毒素由cpb2基因編碼，是Cp產(chǎn)生的另一種致死性毒素[10]。Waters等[11]對豬胃腸道所分離的Cp菌株攜帶cpb2基因的分析結果表明，β2毒素與豬腹瀉和腸黏膜出血顯著相關。cpb2基因分為典型和非典型2種，與最初鑒定的豬源cpb2高度同源（一般96%以上）的基因定義為典型cpb2基因，而一些同源性較低的cpb2基因（一般為60%～70%）為非典型cpb2基因[12]。豬源CpA通常攜帶的是典型的cpb2 基因，有研究表明，攜帶典型cpb2 基因的CpA 菌株與豬、馬、牛、狗等多種動物的腸道疾病密切相關[13]?！颈狙芯壳腥朦c】韓春生等[14]通過利用熒光定量PCR 技術，測定了江西地區(qū)仔豬糞便總DNA 中的CpA菌數(shù)，比較健康與腹瀉仔豬腸道內(nèi)Cp菌數(shù)的差異，從而推斷是否由攜帶毒素基因的改變或菌數(shù)差異導致疾病發(fā)生。在前期的研究發(fā)現(xiàn)，江西地區(qū)豬源CpAcpb2 基因攜帶率較其它地區(qū)所報道高，達到99.5%[15]，因而，對該地區(qū)其它動物源CpA 進行相關的研究。【擬解決的關鍵問題】本試驗在豬源CpA 研究的基礎上，通過選擇性培養(yǎng)方法分離和多重PCR 鑒定獲得本地區(qū)其它動物源CpA，分別對不同動物源CpA 菌株的培養(yǎng)形態(tài)和cpb2基因攜帶、溶血特性情況進行分析比較，以期為研究CpA 在動物體內(nèi)致病機制差異及CpA菌株地區(qū)特異性提供參考。

1 材料與方法

1.1 樣品來源與菌株

豬源CpA 菌株為本實驗室分離保存，并進行了全基因測序的JXJA17 菌株（攜帶cpb2 基因，Genbank登錄號：CP028149.1）；羊源樣品采集于南昌市某養(yǎng)殖戶健康波爾羊新鮮糞便樣；雞源樣品采集于南昌市某養(yǎng)殖戶健康肉雞的新鮮糞便樣；牛源樣品采集于南昌市某農(nóng)戶飼養(yǎng)的健康青年牛的新鮮糞便樣；犬源樣品采集于南昌市某養(yǎng)殖基地健康犬的新鮮糞便樣；魚源樣品采集于南昌市某水產(chǎn)養(yǎng)殖戶飼養(yǎng)健康魚的新鮮糞便樣。多重PCR參考菌株購自中國獸醫(yī)藥品鑒察所，A型產(chǎn)氣莢膜梭菌（CVCC2020）、B型產(chǎn)氣莢膜梭菌（CVCC55）、C型產(chǎn)氣莢膜梭菌（CVCC2041）、D型產(chǎn)氣莢膜梭菌（CVCC82）。

1.2 主要試劑

胰胨-亞硫酸鹽-環(huán)絲氨酸瓊脂培養(yǎng)基（TSC）、液體硫乙醇酸鹽培養(yǎng)基（FTG）、D-環(huán)絲氨酸、含鐵牛奶培養(yǎng)基均購自青島海博生物技術有限公司，DNA 聚合酶、dNTP Mixture、DL2000 DNA marker、PMD18-T、SolutionI 購自TaKaRa 公司，TOP10 感受態(tài)細胞購自北京天根生化科技有限公司，細菌基因組DNA 提取試劑盒、膠回收純化試劑盒均購自上海生工生物工程股份有限公司。

1.3 方法

1.3.1 細菌的分離純化及生化鑒定 參照豬源CpA 分離的方法，分別取少量牛、羊、雞、犬、魚糞便樣品于2 mL的EP管（含1 mL生理鹽水）中，混勻，瞬離10 s后，取100μL上清至4%D-環(huán)絲氨酸FTG中，45 ℃恒溫培養(yǎng)10 h后接種于TSC固體培養(yǎng)基中，挑取灰白色、扁平圓形菌落進行革蘭氏染色，鏡檢觀察形態(tài)。參照《常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊》[16]和《伯杰細菌鑒定手冊》[17]的方法，利用生化微量反應管對分離菌株進行生化鑒定，將分離菌株分別接種于相應的微量生化鑒定管中，置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱，24 h 后觀察記錄結果；并將分離菌株接種于含鐵牛乳培養(yǎng)基中，10 h后觀察反應結果。

1.3.2 分離菌株的16S rDNA 鑒定 按照磁珠法細菌基因組DNA 標準抽提步驟，提取分離菌株及標準菌株的DNA。參照文獻[18]，采用細菌16S rDNA 通用引物（由上海生工生物工程技術服務有限公司合成）進行PCR 擴增后，1%瓊脂糖凝膠電泳30 min，并回收目的條帶，連接至PMD18-T，轉化后，挑取陽性克隆由上海生物工程股份有限公司測序。PCR 體系：采用25 μL 反應體系，混合引物2 μL（上、下游引物各1 μL），蒸餾水8 μL，DNA 模板2.5 μL，Mix DNA 聚合酶12.5 μL；PCR 程序：95 ℃預變性5 min，94 ℃變性1 min，58 ℃退火1 min，72 ℃延伸2 min，進行38個循環(huán)，最后72 ℃延伸10 min。

1.3.3 分離菌株多重PCR 毒素基因分型及β2 毒素基因檢測 參照文獻[19-20]，采用多重PCR 的方法對分離到的Cp 菌進行毒素分型，多重PCR 體系為25 μL 反應體系：10×PCR buffer 2.5 μL，1.25 μmol/L dNTP 1 μL，混合引物2 μL（α、β、ε、ι 4 對毒素基因特異性引物各0.5 μL，引物序列見表1），蒸餾水16.75 μL，DNA 模板2.5 μL，Taq DNA 聚合酶0.25 μL；反應條件：95 ℃預變性5 min，94 ℃變性1 min，55 ℃退火1 min，72 ℃延伸2 min，進行38 個循環(huán)，最后72 ℃延伸10 min。取PCR 擴增產(chǎn)物10 μL，于15 g/L 瓊脂糖凝膠中電泳。取PCR 擴增產(chǎn)物10 μL，于瓊脂糖凝膠中電泳并參照DL2000 DNA Marker觀察并分析結果。然后采用β2 毒素基因引物（表1）對分離到的6 株CpA 進行β2 毒素基因檢測，PCR產(chǎn)物經(jīng)15 g/L 瓊脂糖凝膠電泳分析結果。

表1 PCR擴增引物序列Tab.1 PCR amplified primer sequence

1.3.4 多種動物源CpA 同源性分析 多種動物源CpA 菌株各挑選1株，共6株，將測得的16S rDNA 序列用DNAStar 分析軟件進行數(shù)據(jù)處理，運用NCBI（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov）中Blast工具軟件在GenBank中搜索同源DNA 序列并進行比較分析，利用MEGA X 軟件中的鄰位加入法（neighbor-joining，NJ）構建系統(tǒng)發(fā)育樹，根據(jù)同源性大小和系統(tǒng)發(fā)育關系，確定待測菌株的種類歸屬。

1.3.5 多種動物源CpA 菌株溶血試驗 挑取6 株不同動物源CpA 進行溶血試驗，采用點種法，即分別吸取過夜培養(yǎng)的菌液2.5μL 點種至血平板，放置45 ℃恒溫箱培養(yǎng)，每2 h 觀察記錄各菌株溶血現(xiàn)象及在血平板上的溶血圈直徑，直至溶血圈直徑達到最大。

2 結果與分析

2.1 菌株的分離純化及16S rDNA分子鑒定結果

收集到的牛、羊、雞、犬、魚糞便樣品，在TSC平板上培養(yǎng)均可形成扁平灰白色、周圍伴有淺白色濁環(huán)的圓形菌落（圖1A），細菌純化后經(jīng)革蘭氏染色鏡檢，可見菌體粗短、兩端鈍圓的革蘭氏陽性直桿菌，無鞭毛（圖1B）。所分離到的不同動物源的分離株均能發(fā)酵葡萄糖、麥芽糖、乳糖和蔗糖，產(chǎn)酸產(chǎn)氣，不發(fā)酵甘露醇、液化明膠，產(chǎn)生硫化氫，吲哚陰性；分離菌株在含鐵牛乳中呈暴烈發(fā)酵（圖1C），除菌落特征和菌體形態(tài)與豬源CpA略有差別外，均符合Cp的生物特征。

圖1 Cp在TSC培養(yǎng)的菌落形態(tài)（A）、革蘭氏染色（×1 000）（B）與“爆裂發(fā)酵”現(xiàn)象（C）Fig.1 Results of individual morphological characteristics medium of Clostridium perfringensin TSC（A），Gram-stained（×1 000）（B）and the phenomenon of“burst fermentation”（C）

分別挑選來源于不同動物源分離菌株（將羊源、雞源、豬源、牛源、魚源、犬源分離菌株分別命名為C1、C2、C3、C4、C5、C6）提取DNA，利用16S rDNA 引物經(jīng)PCR 擴增后均獲得預期大小的片段，約為1 500 bp。通過對各分離菌株的16S rDNA 序列的BLAST 在線比對，各菌株與Clostridium perfringens（Gen Bank 登錄號為CP028149.1、CP010993.1、FJ215334.1等）同源性達98%～99%，進而確定各分離菌株為Cp。

2.2 分離菌株多重PCR毒素分型及CpA同源性分析

通過與參考標準菌株比較，多重PCR 毒素基因分型結果顯示：各動物源均分離到了CpA（圖2）。用MEGAX軟件構建的CpA種內(nèi)系統(tǒng)發(fā)育樹（圖3）顯示，豬源CpA、羊源CpA、狗源CpA、牛源CpA、雞源CpA的序列聚集在同一個分支上；而魚源CpA序列處于另一分支上，與其他動物源CpA親源關系較遠。

圖2 多重PCR分型結果Fig.2 Results of multiple PCR typing

圖3 基于16S rDNA序列建立的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.3 Phylogenetic tree of the isolated strains based on 16S rDNA gene nucleotide sequences

2.3 多種動物源CpA的β2毒素基因檢測結果

將本試驗分離到的羊源、雞源、牛源、魚源、犬源CpA分別暫命名為CpA-S、CpA-Ch、CpA-C、CpA-F、CpA-D，豬源JXJA17 菌株命名為CpA-P。除CpA-D 外，其中5 株CpA 攜帶β2 毒素基因；攜帶β2 毒素基因的CpA 菌株中，豬源（CpA-P）、牛源（CpA-C）、魚源（CpA-F）的CpA 攜帶典型的β2 毒素基因，分離自羊源（CpA-S）、雞源（CpA-Ch）的CpA攜帶非典型的β2毒素基因（圖4）。

圖4 β2毒素基因檢測結果Fig.4 β2 toxin gene detection

圖5 各CpA分離株溶血現(xiàn)象Fig.5 Results of hemolysis of the isolates

2.4 多種動物源CpA溶血試驗結果

6株CpA在血平板上培養(yǎng)4 h后，CpA-S（羊源）開始出現(xiàn)明顯的溶血現(xiàn)象（圖5A）；培養(yǎng)5 h后，CpA-C（牛源）、CpA-Ch（雞源）、CpA-F（魚源）、CpA-D（犬源）在血平板上出現(xiàn)溶血現(xiàn)象（圖5B），CpA-P 在血平板培養(yǎng)6 h后，開始出現(xiàn)溶血現(xiàn)象（圖5C）。6株CpA 在血平板上培養(yǎng)24 h后，溶血圈直徑均達最大，繼續(xù)培養(yǎng)無變化，CpA-S 達30 mm，CpA-Ch、CpA-C、CpA-F 溶血圈直平均徑均為20 mm，CpA-D 溶血圈平均直徑為16 mm，CpA-P溶血圈平均直徑為14 mm（圖5D）。

3 討論

CpA 是畜禽腸毒血癥、壞死性腸炎的主要病原菌之一，對我國養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展帶來了一定的危害[21]。本研究團隊[15]前期研究也發(fā)現(xiàn)CpA 在仔豬腸炎致病過程中起著一定的作用，而CpA 又正常存在于健康動物的腸道，且江西地區(qū)健康和腸炎的仔豬腸道CpA 分離率和β2 毒素基因攜帶率均較高，其他動物未有報道。本試驗參照豬源CpA研究方法，應用了選擇培養(yǎng)、革蘭氏染色鏡檢、“爆裂發(fā)酵試驗”、16S rRNA基因測序和多重PCR 等方法，從其它5 種健康動物糞便樣品中均分離到了CpA，說明CpA 廣泛存在于健康動物的腸道中，其對動物健康和公共衛(wèi)生的影響值得進一步關注。

CpA 在不同的動物體內(nèi)產(chǎn)毒不同，致病強度也不同。CpA 對宿主健康的影響除與α 毒素相關外，β2毒素也起著非常重要的作用。本試驗對江西南昌周邊地區(qū)不同動物源6 株CpA 進行了cpb2 基因的檢測，有5 株含有cpb2 基因，高于álvarez 等[22]報道的cpb2 基因檢出率，在一定程度上說明該地區(qū)其它動物源cpb2攜帶率也和豬源cpb2一樣較高。Tolooe等[23]檢測健康雞源CpA攜帶cpb2基因的比例為97.7%，NE雞源的CpA 菌株攜帶cpb2 基因的比例為94.4%；Chon 等[24]在腹瀉犬源CpA 中檢測出的cpb2 基因攜帶率（83.9%）明顯高于健康犬源CpA 的cpb2 基因攜帶率（61.9%），本試驗在健康犬源CpA 中未檢測出cpb2 基因；在牛源CpA 中檢測到典型cpb2基因，相比于德艷艷等[13]報道的攜帶非典型cpb2基因的牛源CpA 有所不同。本試驗未對其它動物源CpA 和cpb2 攜帶率進行統(tǒng)計，但從隨機取樣的CpA 分離和cpb2 的檢測結果從一定程度上說明本地區(qū)其它動物源攜帶率也較高，由于樣本數(shù)量較少，尚有待進一步研究確定。

CpA 的致病性與其產(chǎn)生的毒素和溶血素有直接關系，本試驗分離到的羊源CpA 在血平板出現(xiàn)溶血現(xiàn)象最快，溶血情況最為明顯，是否與羊在感染Cp 后，相比于其他動物，是最容易導致疾病產(chǎn)生的動物之一有關，需要進一步研究。在羊群養(yǎng)殖過程中，應該多加注意防范產(chǎn)氣莢膜梭菌病的發(fā)生與傳播。6 種動物源CpA中，豬源CpA在血平板出現(xiàn)溶血現(xiàn)象最慢，溶血圈直徑最小，這可能與豬源CpA對豬的致病性相對較弱有一定的關系，不同動物源CpA 的毒性存在著一定的差異。CpA 普遍存在環(huán)境與動物的腸道中，細菌間基因水平轉移、毒素基因富集等現(xiàn)象[25]，警示動物源CpA 也是一種不可忽視的潛在病原菌，特別是在抗生素后時代，飼料中禁抗后，養(yǎng)殖業(yè)尤其需要重視CpA可能帶來的危害。