鄭 芳，耿興敏，何麗斯，蘇家樂(lè)

(1.南京林業(yè)大學(xué) 風(fēng)景園林學(xué)院，江蘇 南京 210037；2. 江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 休閑農(nóng)業(yè)研究所，江蘇 南京 210014)

已有研究表明，植物受到逆境脅迫[1]、缺乏營(yíng)養(yǎng)[2]以及在衰老進(jìn)程中[3]均會(huì)導(dǎo)致體內(nèi)活性氧的積累，從而對(duì)植物細(xì)胞產(chǎn)生毒害作用。然而，被控制在適當(dāng)水平的活性氧可以發(fā)揮信號(hào)傳導(dǎo)的作用，進(jìn)而調(diào)控植物生長(zhǎng)發(fā)育，有利于植物對(duì)逆境的適應(yīng)[4-5]?；钚匝醯倪^(guò)量積累會(huì)誘導(dǎo)植物產(chǎn)生應(yīng)激反應(yīng)，從而增強(qiáng)抗氧化防御能力來(lái)減輕對(duì)植物的過(guò)氧化損傷。抗氧化防御體系包括酶促和非酶促系統(tǒng)，其中酶促系統(tǒng)包括超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase，SOD)、過(guò)氧化物酶(Peroxidase，POD)、過(guò)氧化氫酶(Catalase，CAT)、抗壞血酸過(guò)氧化物酶(Ascorbate peroxidase，APX)和谷胱甘肽還原酶(Glutathione reductase，GR)等, 非酶抗氧化物主要包括抗壞血酸(Ascorbate，AsA)和谷胱甘肽(Glutathione，GSH)以及黃酮類等物質(zhì)，APX和GR在AsA-GSH循環(huán)中發(fā)揮著重要作用[6-7]。

很多花瓣衰老與活性氧水平的升高密切相關(guān)，而活性氧的產(chǎn)生也伴隨著抗氧化防御能力的增強(qiáng)[8]。活性氧代謝以及抗氧化反應(yīng)在不同的切花中存在不同的變化，切花菊(Chrysanthemumcv. Maghi)衰老過(guò)程中O2.-產(chǎn)生速率和H2O2含量上升，同時(shí)伴隨著膜脂過(guò)氧化加劇[9]。對(duì)郁金香(Tulipa.gesnerianaL. cv. Ile de France)切花的研究發(fā)現(xiàn)H2O2含量呈現(xiàn)雙峰變化，切花衰老與H2O2第二峰值的出現(xiàn)有關(guān)，當(dāng)H2O2含量的第二個(gè)峰值出現(xiàn)時(shí)APX和CAT活性下降，花瓣中DNA降解酶活性上升，導(dǎo)致花瓣衰老[10]。在對(duì)鳶尾(IrisversicolorL.)花衰老的研究中也發(fā)現(xiàn)CAT、APX等抗氧化酶的降低與衰老密切相關(guān)[11]。唐菖蒲花瓣衰老過(guò)程中各個(gè)抗氧化酶的變化呈現(xiàn)不同模式，推測(cè)APX活性下降導(dǎo)致H2O2積累，而積累的H2O2可以發(fā)揮信號(hào)作用，誘導(dǎo)SOD基因表達(dá)以及SOD酶活性提高[12]。這些研究表明，活性氧清除系統(tǒng)在切花開(kāi)放和衰老進(jìn)程中起著重要作用。

切花的瓶插壽命影響著切花的商業(yè)價(jià)值，因此花瓣衰老過(guò)程中的生理代謝、生化反應(yīng)、分子生物學(xué)和花瓣的衰老類型等受到廣泛關(guān)注[13]。杜鵑花屬(RhododendronL.)植物花色艷麗、花型繁多，杜鵑切花具有花期長(zhǎng)、觀賞價(jià)值高等特點(diǎn)。目前關(guān)于杜鵑切花衰老過(guò)程中活性氧清除系統(tǒng)的研究尚未見(jiàn)報(bào)道。本研究以‘紅珊瑚’杜鵑(R.hybridum‘Hong Shanhu’)和錦繡杜鵑(R.pulchrum)兩個(gè)杜鵑品種為試驗(yàn)材料，研究杜鵑切花不同開(kāi)放狀態(tài)下活性氧代謝以及抗氧化清除系統(tǒng)的變化，以期為杜鵑切花的采后保鮮提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料和取樣方法

‘紅珊瑚’(R.hybridum‘Hong Shanhu’)和錦繡杜鵑(R.pulchrum)分別取自常州裕華杜鵑種植有限公司和南京林業(yè)大學(xué)校園。選取健壯、無(wú)病蟲(chóng)害、營(yíng)養(yǎng)狀況一致的花枝于花蕾期剪取后用蘸水脫脂棉包裹，并于4小時(shí)之內(nèi)運(yùn)至南京林業(yè)大學(xué)風(fēng)景園林學(xué)院實(shí)驗(yàn)室，放入超純水中進(jìn)行瓶插。在瓶插過(guò)程中，分別在5個(gè)開(kāi)放狀態(tài)取樣。各個(gè)狀態(tài)的取樣至少選取3朵以上的花，將花瓣剪碎混勻，放置-80℃用于后期實(shí)驗(yàn)，每個(gè)指標(biāo)測(cè)定進(jìn)行3次重復(fù)。

圖1 兩種杜鵑花開(kāi)放和衰老過(guò)程中的取樣狀態(tài)

1.2 指標(biāo)測(cè)定

采用硫代巴比妥酸法測(cè)定丙二醛(MDA)含量[14]。超氧陰離子(O2.-)含量測(cè)定采用羥胺氧化法[15]。H2O2測(cè)定采用碘化鉀法測(cè)定[16]。SOD、POD和CAT活性分別采用氮藍(lán)四唑(NBT)法、愈創(chuàng)木酚法和紫外吸收法來(lái)測(cè)定[17]。APX采用紫外吸收法，通過(guò)測(cè)定AsA的減少量來(lái)測(cè)定[18]；GR活性測(cè)定采用紫外吸收法[19]；AsA采用Fe3+還原法[20]測(cè)定；GSH采用酶還原法測(cè)定[21]。

1.3 數(shù)據(jù)分析

試驗(yàn)過(guò)程中的數(shù)據(jù)處理、方差分析等均運(yùn)用 Excel 2007和 SPSS 23.0軟件完成，偏相關(guān)性分析采用SPSS 23.0軟件完成。

2 試驗(yàn)結(jié)果

2.1 活性氧和膜脂過(guò)氧化的變化

由圖2可以看出，在‘紅珊瑚’切花中O2.-產(chǎn)生速率的變化趨勢(shì)為先下降后上升再下降的趨勢(shì)，分別在狀態(tài)Ⅰ和狀態(tài)Ⅳ出現(xiàn)較高值；錦繡杜鵑切花O2.-產(chǎn)生速率在開(kāi)放和衰老過(guò)程中呈波狀變化，狀態(tài)Ⅴ達(dá)到最高值。‘紅珊瑚’切花O2.-產(chǎn)生速率除在狀態(tài)Ⅴ之外總體顯著高于錦繡杜鵑切花。

圖2 兩種杜鵑切花不同開(kāi)放狀態(tài)下O2.-產(chǎn)生速率的變化

由圖3中可以看出，在‘紅珊瑚’切花中H2O2含量變呈先上升后下降再上升的趨勢(shì)，在狀態(tài)Ⅱ和狀態(tài)Ⅲ時(shí)H2O2含量顯著高于其他狀態(tài)。錦繡杜鵑切花H2O2含量變化呈先下降后上升的趨勢(shì)，在狀態(tài)Ⅴ時(shí)有所下降，但與狀態(tài)Ⅳ相比無(wú)顯著性差異(P< 0.05)?！t珊瑚’切花H2O2含量在狀態(tài)Ⅰ和狀態(tài)Ⅳ時(shí)顯著低于錦繡杜鵑，在狀態(tài)Ⅱ、Ⅲ時(shí)顯著高于錦繡杜鵑切花。

圖3 兩種杜鵑切花不同開(kāi)放狀態(tài)下H2O2含量的變化

由圖4可以看出，‘紅珊瑚’切花MDA含量呈先下降后上升的變化趨勢(shì)，在狀態(tài)Ⅰ時(shí)含量較高，從狀態(tài)Ⅱ之后隨著切花的開(kāi)放和衰老MDA含量上升。錦繡杜鵑切花開(kāi)放和衰老過(guò)程中MDA含量變化幅度較小，并且MDA含量顯著低于‘紅珊瑚’切花。

圖4 兩種杜鵑切花不同開(kāi)放狀態(tài)下MDA含量的變化

2.2 抗氧化酶和抗氧化物質(zhì)的變化

由圖5可以看出，‘紅珊瑚’切花SOD活性在前3個(gè)狀態(tài)稍有下降，在狀態(tài)Ⅳ時(shí)升高并且維持到狀態(tài)Ⅴ。錦繡杜鵑切花SOD活性呈先下降后上升再下降的趨勢(shì)，與‘紅珊瑚’切花變化趨勢(shì)不相同。并且在錦繡杜鵑切花中SOD活性顯著高于‘紅珊瑚’切花。

圖5 兩種杜鵑切花不同開(kāi)放狀態(tài)下SOD活性的變化

如圖6所示，‘紅珊瑚’切花POD活性呈波狀變化，錦繡杜鵑切花POD活性在狀態(tài)Ⅱ時(shí)下降，之后無(wú)顯著變化?！t珊瑚’切花POD活性在狀態(tài)Ⅰ和狀態(tài)Ⅳ時(shí)顯著低于錦繡杜鵑切花，其他狀態(tài)下POD活性無(wú)差異。

圖6 兩種杜鵑切花不同開(kāi)放狀態(tài)下POD活性的變化

由圖7可以看出，‘紅珊瑚’切花CAT活性呈先上升后下降的趨勢(shì)，在狀態(tài)Ⅱ和狀態(tài)Ⅲ時(shí)達(dá)到最高值，之后下降。錦繡杜鵑切花CAT活性也基本呈先上升后下降的趨勢(shì)，雖然在狀態(tài)Ⅱ時(shí)有所下降，但不顯著?！t珊瑚’切花除在狀態(tài)Ⅱ時(shí)CAT活性與錦繡杜鵑差異不顯著之外，其他狀態(tài)CAT活性均顯著低于錦繡杜鵑。

圖7 兩種杜鵑切花不同開(kāi)放狀態(tài)下CAT活性的變化

如圖8所示，APX活性變化在‘紅珊瑚’切花中總體呈上升趨勢(shì)，但在狀態(tài)Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ時(shí)變化不顯著。錦繡杜鵑切花APX活性呈先上升后下降再上升的趨勢(shì)，在狀態(tài)Ⅱ時(shí)上升到最高值，狀態(tài)Ⅳ時(shí)下降到最低。

圖8 兩種杜鵑切花不同開(kāi)放狀態(tài)下APX活性的變化

如圖9所示，‘紅珊瑚’切花GR活性呈先上升后下降再上升的變化趨勢(shì)，在狀態(tài)Ⅲ和狀態(tài)Ⅴ時(shí)達(dá)到最高值。錦繡杜鵑切花GR活性變化與‘紅珊瑚’切花不同，呈先下降后上升再下降的趨勢(shì)，在狀態(tài)Ⅰ和狀態(tài)Ⅲ活性最高。

圖9 兩種杜鵑切花不同開(kāi)放狀態(tài)下GR活性的變化

如圖10所示，‘紅珊瑚’切花AsA含量變化呈現(xiàn)先下降后上升的趨勢(shì)，在狀態(tài)Ⅱ時(shí)降到最低值，錦繡杜鵑切花AsA含量變化趨勢(shì)與‘紅珊瑚’切花相似，在狀態(tài)Ⅲ時(shí)將到最低值，‘紅珊瑚’切花AsA 含量顯著高于錦繡杜鵑。

圖10 兩種杜鵑切花不同開(kāi)放狀態(tài)下AsA含量的變化

如圖11所示，‘紅珊瑚’和錦繡杜鵑切花GSH含量變化均呈先下降后上升的趨勢(shì)，在狀態(tài)Ⅲ時(shí)下降到最低值?！t珊瑚’切花GSH含量整體高于錦繡杜鵑切花。

圖11 兩種杜鵑切花不同開(kāi)放狀態(tài)下GSH含量的變化

2.3 相關(guān)性分析

從表1中可以看出在‘紅珊瑚’切花中，開(kāi)放狀態(tài)與SOD、APX和Gr呈正相關(guān)，并且達(dá)到極顯著水平(P< 0.01)；O2.-與H2O2和APX呈負(fù)相關(guān)，分別達(dá)到顯著(P< 0.05)和極顯著水平(P< 0.01)，O2.-與MDA呈正相關(guān)，并且達(dá)到顯著水平；MDA與CAT和AsA分別呈負(fù)相關(guān)和正相關(guān)，并且均達(dá)到極顯著水平(P< 0.01)；SOD與CAT和AsA分別呈負(fù)相關(guān)和正相關(guān)，并且均達(dá)到極顯著水平(P< 0.01)；CAT與AsA呈負(fù)相關(guān)且達(dá)到極顯著水平(P< 0.01)；APX與Gr呈正相關(guān)，并且達(dá)到極顯著水平(P< 0.01)。從表2中可以看出在錦繡杜鵑切花中，開(kāi)放狀態(tài)除與AsA呈正相關(guān)且達(dá)到極顯著水平(P< 0.01)之外，與其他指標(biāo)均呈負(fù)相關(guān)，并達(dá)到顯著或極顯著水平；H2O2與SOD和POD呈正相關(guān)，并達(dá)到極顯著水平；MDA與APX呈正相關(guān)，并且達(dá)到極顯著水平(P< 0.01)；SOD與POD、CAT和Gr呈正相關(guān)，與AsA呈負(fù)相關(guān)，均達(dá)到顯著水平(P< 0.05)；CAT與APX、Gr和AsA均呈正相關(guān)，與APX達(dá)到顯著相關(guān)水平(P< 0.05)，與Gr和AsA達(dá)到極顯著相關(guān)水平(P< 0.01)；APX與Gr和AsA分別呈正相關(guān)和負(fù)相關(guān)，并且均達(dá)到顯著水平(P< 0.05)；Gr與AsA呈負(fù)相關(guān)且達(dá)到極顯著水平(P< 0.01)。

3 討論

衰老、營(yíng)養(yǎng)缺乏和機(jī)械損傷[3，2，22]均會(huì)導(dǎo)致活性氧的產(chǎn)生，兩種杜鵑花切花在狀態(tài)Ⅰ時(shí)O2.-具有較高水平，可能是因?yàn)椴汕袀谒a(chǎn)生的應(yīng)激反應(yīng)，劉亞杰[23]在對(duì)香雪蘭的研究中也有類似報(bào)道。紅珊瑚切花在衰老時(shí)O2.-產(chǎn)生速率出現(xiàn)下降的情況，與牡丹‘趙粉’相似[24]，錦繡杜鵑切花O2.-產(chǎn)生速率變化與鄭翠萍等[25]對(duì)香石竹切花的研究相似，在衰老之前變化起伏，衰老時(shí)上升。‘紅珊瑚’切花H2O2含量在花朵開(kāi)放時(shí)達(dá)到較高值，這與香雪蘭[23]和桂花[30]等大多數(shù)切花并不相同。錦繡杜鵑切花H2O2含量變化出現(xiàn)兩個(gè)峰值，這與郁金香[10]和牡丹切花[26]類似，H2O2含量的第二峰值出現(xiàn)可能與其作為信號(hào)分子誘發(fā)的衰老有關(guān)[12]。兩種杜鵑花離體狀態(tài)下活性氧的變化不相同，說(shuō)明杜鵑切花活性氧的代謝存在種間差異，這在牡丹切花中也有類似報(bào)道[26]。

MDA是反應(yīng)膜脂過(guò)氧化的重要指標(biāo)[27]，‘紅珊瑚’切花MDA含量顯著高于錦繡杜鵑切花，這與‘紅珊瑚’切花O2.-水平較高有關(guān)，O2.-作為一種自由基在細(xì)胞內(nèi)積累時(shí)會(huì)導(dǎo)致膜脂過(guò)氧化、膜結(jié)構(gòu)的損壞及MDA含量的增加[28]。本研究中‘紅珊瑚’切花MDA含量在狀態(tài)Ⅰ時(shí)較高，隨后又下降，這可能是切花采后水分脅迫導(dǎo)致的MDA含量升高[29]。大多數(shù)切花衰老過(guò)程中MDA含量成倍增加，切花的衰老與MDA的上升聯(lián)系緊密[30，23]，而在本研究中兩種杜鵑切花衰老時(shí)MDA含量未出現(xiàn)大幅度的上升，說(shuō)明此時(shí)花瓣膜結(jié)構(gòu)相對(duì)穩(wěn)定，并未產(chǎn)生嚴(yán)重的膜結(jié)構(gòu)損傷。從相關(guān)性分析中也可以看出兩種杜鵑切花從開(kāi)放到衰老過(guò)程中的不同狀態(tài)與MDA和O2.-的相關(guān)性未達(dá)到顯著水平，這進(jìn)一步說(shuō)明了杜鵑切花的衰老與活性氧和膜脂過(guò)氧化關(guān)聯(lián)不緊密。

表1 ‘紅珊瑚’切花各指標(biāo)之間相關(guān)性分析

表2 錦繡杜鵑切花各指標(biāo)之間相關(guān)性分析

活性氧清除酶在花瓣衰老過(guò)程中具有重要作用。在‘紅珊瑚’切花衰老時(shí)SOD活性上升，有效清除了O2.-，這與劍蘭切花衰老過(guò)程中SOD活性的變化相似[12]。錦繡杜鵑切花在狀態(tài)Ⅰ時(shí)SOD活性較高，這可能與此時(shí)花瓣具有較高O2.-水平有關(guān)。之后SOD活性的變化趨勢(shì)又與大多數(shù)切花相似，隨著花瓣開(kāi)放活性增加，隨后衰老時(shí)下降[11] [26]。CAT活性在兩種杜鵑切花中均呈先上升后下降的變化，切花衰老與CAT活性下降密切相關(guān)[11] [31]。而POD活性在兩種杜鵑切花中均呈起伏變化，在衰老過(guò)程中活性差異也不顯著，說(shuō)明POD在杜鵑切花開(kāi)放和衰老過(guò)程中并未發(fā)揮重要作用。在杜鵑切花中SOD和CAT在衰老過(guò)程中發(fā)揮的作用要高于POD。此外，從兩種切花CAT和SOD活性可以看出錦繡杜鵑切花抗氧化能力要強(qiáng)于‘紅珊瑚’切花。

AsA-GSH循環(huán)在清除活性氧中發(fā)揮重要作用[32]，本研究中兩種杜鵑切花開(kāi)放和衰老過(guò)程中AsA含量變化均呈先下降后上升的趨勢(shì)，與周媛[30]對(duì)桂花的研究結(jié)果相似。AsA和GSH除了與GR和APX共同發(fā)揮清除活性氧的作用之外，還能單獨(dú)發(fā)揮清除活性氧的作用[33]。本研究中AsA和GSH含量變化隨杜鵑切花衰老而上升，說(shuō)明衰老時(shí)這兩種物質(zhì)發(fā)揮了作用?！t珊瑚’切花APX在衰老時(shí)仍具有較高活性，可能與AsA的保護(hù)作用有關(guān)[34]。在衰老過(guò)程中錦繡杜鵑GR和APX活性下降而‘紅珊瑚’切花中這兩種酶仍有上升趨勢(shì)，說(shuō)明‘紅珊瑚’切花此時(shí)的抗氧化能力要強(qiáng)于錦繡杜鵑。從AsA-GSH循環(huán)中可以看出‘紅珊瑚’切花抗氧化能力要強(qiáng)于錦繡杜鵑切花。

相關(guān)性分析結(jié)果表明，在‘紅珊瑚’和錦繡杜鵑切花中SOD和CAT呈正相關(guān)，說(shuō)明這兩種酶在兩種杜鵑切花中發(fā)揮的作用相一致。而POD在錦繡杜鵑切花中也表現(xiàn)出與CAT具有相關(guān)性，說(shuō)明抗氧化酶在兩種切花中的作用具有差異性?！t珊瑚’切花中抗氧化酶SOD和CAT與AsA均呈負(fù)相關(guān)，而錦繡杜鵑切花中SOD和CAT活性與AsA-GSH循環(huán)中的相關(guān)指標(biāo)表現(xiàn)出正相關(guān)，說(shuō)明兩種杜鵑切花中抗氧化酶促系統(tǒng)和非酶系統(tǒng)具有不同的協(xié)調(diào)作用機(jī)制。