蔡 慧，丁彥芬*，董麗娜，楊甲樂(lè)，趙美婷

(1.南京林業(yè)大學(xué) 風(fēng)景園林學(xué)院，江蘇 南京 210037； 2. 中山陵園管理局，江蘇 南京 210014)

野生花卉指現(xiàn)在仍在原產(chǎn)地處于天然自生狀態(tài)待開(kāi)發(fā)利用的觀賞植物，不僅是地方天然風(fēng)景和植被的重要組成部分，也是培育花卉新品種重要的種質(zhì)資源和原始資料[1]。中國(guó)享有“世界園林之母”和“世界花卉寶庫(kù)”的美稱，野生花卉資源非常豐富[2]。據(jù)統(tǒng)計(jì)，全世界觀賞植物約3萬(wàn)種，我國(guó)原產(chǎn)觀賞植物有1～2萬(wàn)種，較常用的僅約2000種[3]。采用鄉(xiāng)土野生花卉資源進(jìn)行引種栽培，其抗逆性強(qiáng)，節(jié)省后期的維護(hù)管理，可以真正做到節(jié)約園林成本又能增加生物多樣性。然而，目前對(duì)野生地被花卉的生態(tài)性研究及引種馴化方面的研究還相對(duì)較少。

堇菜屬(ViolaL.)植物種質(zhì)資源豐富，約500余種，廣布熱帶、亞熱帶及溫帶，主要分布于北半球的溫帶地區(qū)[4]。堇菜屬植物開(kāi)花早、綠期長(zhǎng)，在我國(guó)分布廣、種類多、對(duì)當(dāng)?shù)丨h(huán)境適應(yīng)性強(qiáng)、多數(shù)為多年生、一次種植可多年觀賞[5]。同時(shí)，本屬大多數(shù)種類在我國(guó)南方地區(qū)3～5月開(kāi)花，花形美觀，是城市園林綠化的重要草種資源，可彌補(bǔ)我國(guó)南方地區(qū)早春露地花卉及其應(yīng)用方面的不足[6]；堇菜屬植物還具有較高的藥用價(jià)值，具有止痛消炎、清熱解毒、抗氧化、抗免疫缺陷等藥理作用[7-8]。然而目前對(duì)該屬的研究較局限，在園林應(yīng)用方面研究較少。堇菜屬植物多數(shù)處于野生狀態(tài)，因其較高的藥用價(jià)值，造成過(guò)度采挖，導(dǎo)致野生堇菜屬植物資源逐漸減少，因此亟需人工馴化栽培。堇菜屬植物以種子繁殖為主，結(jié)實(shí)多，但對(duì)于堇菜屬植物種子生物學(xué)特性及萌發(fā)條件缺乏系統(tǒng)的研究[9]。

本文以具有地域景觀特色的堇菜屬植物——采自南京市紫金山的早開(kāi)堇菜(Violaprionantha)、犁頭草(Violajaponica)、戟葉堇菜(Violabetonicifolia)、長(zhǎng)萼堇菜(Violainconspicua)和紫花堇菜(Violagrypoceras)5種野生堇菜屬植物種子為試驗(yàn)材料，對(duì)其生物學(xué)特性及萌發(fā)條件進(jìn)行研究，通過(guò)體視顯微鏡及電鏡對(duì)種子形態(tài)及種皮微細(xì)胞結(jié)構(gòu)進(jìn)行觀察，測(cè)定種子千粒重、吸水性、種子生活力等指標(biāo)，研究不同處理下5種野生堇菜屬植物種子的萌發(fā)情況，以期為堇菜屬植物遺傳育種及分類提供依據(jù)，促進(jìn)中國(guó)野生堇菜屬植物資源的開(kāi)發(fā)利用，加快其引種馴化進(jìn)程，為中國(guó)野生堇菜屬植物的種質(zhì)資源保護(hù)、種子擴(kuò)繁、園林應(yīng)用等提供理論指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

本試驗(yàn)種子于2019年5月采集于南京市紫金山(118°51′36" E，32°3′9" N)，放置于室內(nèi)通風(fēng)處，使其種子自然彈射出種皮，選擇顆粒飽滿種子為供試種子。

1.2 種子生物學(xué)特性測(cè)定

1.2.1 種子的形態(tài)特征及千粒重測(cè)定

利用體視顯微鏡分別對(duì)5種植物種子長(zhǎng)、寬進(jìn)行測(cè)量，并通過(guò)掃描電鏡觀察種子形態(tài)特征。采用百粒法，從每種植物的種子樣品中隨機(jī)取出100粒種子，用1/10000分析天平(ME204-02，梅特勒-托利多)稱重，重復(fù)8次，最后換算成千粒重[10]。

1.2.2 種子吸水率的測(cè)定

各種植物的種子材料取完整、劃開(kāi)種皮和去除種皮的種子各30粒，置于10 mL離心管中，加蒸餾水8 mL，每種處理重復(fù)3次。放于恒溫25℃條件下，每隔2 h取出用吸水紙吸干表面水分后稱重，12 h后每12 h取出稱重，直到重量不變?yōu)橹?，最后?jì)算種子吸水率。

種子吸水率(%)=(Wt-W0)/W×100

式中，Wt為吸水一定時(shí)間后種子的重量，W0為種子初始重量。

1.2.3 種子生活力的測(cè)定

于2019年6月和2019年12月，分別測(cè)定種子生活力。使用濃度為0.2%的2，3，5-氯化三苯基四氮唑(TTC溶液)浸泡剛采集的以及經(jīng)過(guò)室溫和低溫(4℃)儲(chǔ)存的5種植物的種子，每個(gè)處理 3 次重復(fù)，50 粒/重復(fù)。根據(jù)胚的染色程度和染色的深淺來(lái)鑒定種子的生活力。

種子生活力(%)=Vt/V0×100%

式中，Vt為染色或大部分染色種子數(shù)，V0為供試種子數(shù)。

1.3 種子發(fā)芽率測(cè)定

種子萌發(fā)試驗(yàn)于2019年6月、2019年12月進(jìn)行，在培養(yǎng)箱(RDN-400D-4，寧波東南儀器有限公司)內(nèi)萌發(fā)。供試種子成熟、飽滿，未受昆蟲(chóng)和病菌侵害，試驗(yàn)前將種子統(tǒng)一預(yù)處理：1%次氯酸鈉浸泡5 min消毒，無(wú)菌水沖洗3次后，75%酒精消毒2次，沖洗干凈[11]。培養(yǎng)箱溫度設(shè)置為25℃，濕度80%，避光處理4 d，發(fā)芽后改為光照培養(yǎng)(2000LX)，每天光照12 h，黑暗12 h，以3 d種子萌發(fā)數(shù)不變?yōu)榘l(fā)芽截止時(shí)間，每天觀察記錄發(fā)芽的種子數(shù)[12-13]。

1.3.1 浸種試驗(yàn)

2019年6月，隨機(jī)選取剛采集的5種植物的種子各300粒，預(yù)處理后，分為兩份，一份直接進(jìn)行萌發(fā)試驗(yàn)，一份25℃水浸種5 h后進(jìn)行試驗(yàn)。

1.3.2 儲(chǔ)存條件試驗(yàn)

2019年12月，分別取室溫和4℃冰箱儲(chǔ)藏6個(gè)月的5種種子各150粒，預(yù)處理后，每組50粒，3次重復(fù)。

1.3.3 赤霉素處理試驗(yàn)

試驗(yàn)于2019年12月進(jìn)行。供試種子為室溫儲(chǔ)存6個(gè)月的5種野生堇菜屬植物種子。取籽粒飽滿、經(jīng)過(guò)預(yù)處理的5種種子在濃度為100、200、300、500、750 mg/L的赤霉素中浸泡種子4、8、12、24 h，分別以清水浸泡為對(duì)照。每組50粒，3次重復(fù)，置于培養(yǎng)箱中進(jìn)行試驗(yàn)。發(fā)芽期間，每天統(tǒng)計(jì)發(fā)芽數(shù)(胚芽突破種皮長(zhǎng)度超過(guò)種子的一半為發(fā)芽)。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用Excel 2003和SPSS 24.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。采用單因素(one-way ANOVA)和Duncan法進(jìn)行方差分析和多重比較(α=0.05)。利用Excel 2003和Origin 2017軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 堇菜屬植物種子生物學(xué)特性

2.1.1 種子外形及千粒重

利用體視顯微鏡對(duì)5種野生堇菜屬植物種子分別進(jìn)行拍照觀察，測(cè)量其長(zhǎng)、寬(表1)。其中早開(kāi)堇菜、犁頭草種子較大，兩種種子顏色均為深褐色；另外三種植物種子相對(duì)較小，戟葉堇菜、長(zhǎng)萼堇菜種子顏色均為深紅棕色，紫花堇菜種子顏色為深棕色。在電鏡掃描下，5種堇菜屬植物種子均為網(wǎng)狀紋飾，但網(wǎng)紋排列、規(guī)則度明顯不同，網(wǎng)眼大小各異(圖1)。以百粒法對(duì)5種野生堇菜屬植物千粒重進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果表明犁頭草種子千粒重>早開(kāi)堇菜>紫花堇菜>戟葉堇菜>長(zhǎng)萼堇菜，其中早開(kāi)堇菜和犁頭草差異不顯著，與紫花堇菜、戟葉堇菜、長(zhǎng)萼堇菜種子千粒重差異顯著(P<0.05)。

圖1 5種野生堇菜屬植物種子種皮微結(jié)構(gòu)

2.1.2 種子吸水率

從吸水曲線看，5種野生堇菜屬植物種子的吸水率隨時(shí)間增加均表現(xiàn)為上升趨勢(shì)，2 h內(nèi)為快速吸水期，2～12 h為緩慢吸水期，12 h基本達(dá)到飽和后吸水率趨于平穩(wěn)(圖2)。除紫花堇菜，三種處理均無(wú)顯著差異外，另外4種野生堇菜屬植物種子未處理及劃破種皮處理的吸水率無(wú)顯著差異(P<0.05)，吸水前2 h劃破種皮處理的種子表現(xiàn)為更高的吸水率，在吸水后期完整種子的吸水率略高于破皮種子，但去除種皮處理的吸水率低于前兩個(gè)處理。說(shuō)明種皮對(duì)5種野生堇菜屬植物種子的吸水不起限制作用，相對(duì)種皮而言種子的胚乳組織更致密，沒(méi)有種皮的吸水以及持水特性。就吸水率而言，早開(kāi)堇菜>犁頭草>戟葉堇菜=長(zhǎng)萼堇菜>紫花堇菜，三種處理下紫花堇菜種子吸水率均表現(xiàn)為最低。

圖2 5種野生堇菜屬植物種子吸水曲線

2.1.3 種子生活力

5種野生堇菜屬植物種子屬于有胚乳種子，經(jīng)染色，生活力最高的胚乳部分也被染成鮮紅色；次之，僅胚染為鮮紅；無(wú)生活力的種子胚沒(méi)有染色成功或染色面積少于1/2。根據(jù)5種野生堇菜屬植物種子生活力測(cè)定結(jié)果顯示，早開(kāi)堇菜種子生活力最高，不僅胚染為鮮紅，而且多數(shù)胚乳也染為紅色；戟葉堇菜次之，少數(shù)胚乳染為紅色；其次為犁頭草、長(zhǎng)萼堇菜，多為胚染色；紫花堇菜種子生活力最低，表現(xiàn)為染色面積小、顏色淺等現(xiàn)象。同種野生堇菜屬植物種子經(jīng)過(guò)6個(gè)月儲(chǔ)藏后，生活力有所降低，除戟葉堇菜常溫儲(chǔ)存下生活力顯著降低外，其他堇菜屬植物種子在兩種儲(chǔ)存條件下種子生活力差異不顯著(P<0.05)；同種處理下，犁頭草、長(zhǎng)萼堇菜種子生活力差異不顯著，其他幾種種子生活力差異顯著(圖3)。5種野生堇菜屬植物在染色6 h時(shí)被染種子數(shù)最多，6 h后出現(xiàn)褪色。

圖3 5種野生堇菜屬植物種子生活力

2.2 堇菜屬植物種子萌發(fā)特性

2.2.1 浸種對(duì)種子萌發(fā)的影響

結(jié)果表明，浸種處理的種子發(fā)芽率低于不做處理的種子，浸泡處理的種子發(fā)芽較早，但后期霉變嚴(yán)重，影響種子正常發(fā)芽。同種植物在不同處理下，早開(kāi)堇菜、紫花堇菜差異不顯著，犁頭草、戟葉堇菜、長(zhǎng)萼堇菜種子發(fā)芽率差異顯著(P<0.05)；同種處理下，5種野生堇菜屬植物種子發(fā)芽率差異顯著(P<0.05)，早開(kāi)堇菜>戟葉堇菜>犁頭草>長(zhǎng)萼堇菜>紫花堇菜(圖4)。

圖4 浸種處理對(duì)5種野生堇菜屬植物種子發(fā)芽率的影響

2.2.2 儲(chǔ)存條件對(duì)種子萌發(fā)的影響

除早開(kāi)堇菜發(fā)芽率較高不受儲(chǔ)存條件影響外，另外4種植物表現(xiàn)為低溫儲(chǔ)存種子發(fā)芽率高于室溫儲(chǔ)存，不同處理下，早開(kāi)堇菜、紫花堇菜發(fā)芽率差異不顯著，犁頭草、戟葉堇菜、長(zhǎng)萼堇菜種子發(fā)芽率差異顯著(P<0.05)；室溫儲(chǔ)藏下長(zhǎng)萼堇菜、紫花堇菜發(fā)芽率差異不顯著，其余三種種子發(fā)芽率差異顯著，低溫儲(chǔ)藏下，5種堇菜屬植物種子發(fā)芽率差異顯著(圖5)。與6月份發(fā)芽試驗(yàn)相比，除早開(kāi)堇菜外，種子發(fā)芽率隨儲(chǔ)存時(shí)間增加有所降低。

圖5 不同儲(chǔ)存條件對(duì)5種野生堇菜屬植物種子發(fā)芽率的影響

2.2.3 赤霉素處理對(duì)種子萌發(fā)的影響

結(jié)果表明：除紫花堇菜外，赤霉素處理可提高其他4種堇菜屬種子發(fā)芽率。

使用不同濃度GA3、不同時(shí)間浸泡處理的早開(kāi)堇菜，與對(duì)照相比發(fā)芽率增加，差異顯著。相同浸泡時(shí)間下，750 mg/L GA3處理下早開(kāi)堇菜發(fā)芽率最高，其次為500 mg/L GA3處理，差異不顯著，750 mg/L GA3處理8 h發(fā)芽率最高；經(jīng)過(guò)赤霉素處理的早開(kāi)堇菜6天內(nèi)可完成發(fā)芽，發(fā)芽高峰期出現(xiàn)在第3天，且發(fā)芽率高達(dá)96%。

使用不同濃度GA3、不同時(shí)間浸泡處理的犁頭草，與對(duì)照相比發(fā)芽率增加，差異顯著。相同浸泡時(shí)間下，犁頭草在500 mg/L GA3處理時(shí)發(fā)芽率最高，其次為300 mg/L GA3處理，種子發(fā)芽率差異顯著，其中500 mg/L GA3浸泡8 h發(fā)芽率最高；經(jīng)過(guò)300、500 mg/L GA3處理的犁頭草15 d內(nèi)可完成發(fā)芽，發(fā)芽高峰期出現(xiàn)在第9 d，且發(fā)芽率高達(dá)44%。

戟葉堇菜在不同GA3濃度、不同時(shí)間浸泡處理下，與對(duì)照相比發(fā)芽率增加，差異顯著。相同浸泡時(shí)間下戟葉堇菜在500 mg/L GA3處理下發(fā)芽率較高，其次為750 mg/L，差異顯著，其中500 mg/L GA3處理8 h發(fā)芽率最高；經(jīng)過(guò)300、500、750 mg/L GA3赤霉素處理的戟葉堇菜10 d內(nèi)可完成發(fā)芽，發(fā)芽高峰期出現(xiàn)在第6天，且發(fā)芽率高達(dá)60%。

100 mg/L GA3浸泡處理長(zhǎng)萼堇菜種子4 h、12 h、24 h與對(duì)照相比差異不顯著，其余處理與對(duì)照相比發(fā)芽率差異顯著。相同浸泡時(shí)間下500 mg/L GA3處理長(zhǎng)萼堇菜發(fā)芽率較高，其次為300 mg/L，差異顯著，在500 mg/L GA3處理8 h下發(fā)芽率最高；經(jīng)過(guò)300、500 mg/L GA3處理的長(zhǎng)萼堇菜12 d內(nèi)可完成發(fā)芽，發(fā)芽高峰期出現(xiàn)在第8 d，發(fā)芽率最高達(dá)36%(圖6)。紫花堇菜經(jīng)過(guò)100～750 mg/L的赤霉素處理并不能發(fā)芽，有待進(jìn)一步研究。

圖6 赤霉素處理對(duì)4種野生堇菜屬植物種子發(fā)芽率的影響

3 討論與結(jié)論

5種野生堇菜屬植物種子均為卵圓形，基部平鈍，頂端為萌發(fā)口尖突成喙?fàn)睢Ｍㄟ^(guò)掃描電鏡對(duì)5種堇菜屬植物種子的表皮微結(jié)構(gòu)進(jìn)行觀察比較發(fā)現(xiàn)，5種植物種子均為網(wǎng)狀紋飾，早開(kāi)堇菜、犁頭草、長(zhǎng)萼堇菜紋飾排列較為整齊，網(wǎng)眼形狀各異；戟葉堇菜、紫花堇菜呈不規(guī)則的網(wǎng)狀紋飾，戟葉堇菜網(wǎng)脊突出，起伏較大，紫花堇菜網(wǎng)眼呈較規(guī)則的六邊形。李連方等[14]對(duì)華北地區(qū)22種堇菜屬植物種子進(jìn)行掃描電鏡觀察，其中包括美麗堇菜亞屬(Subgen.Melanium)、二裂花柱亞屬(Subgen.Dischidium)及堇菜亞屬(Subgen.Viola)，堇菜亞屬種皮紋飾出現(xiàn)多元性分化，表現(xiàn)為更高的進(jìn)化水平，研究結(jié)果與本文研究的5種野生堇菜亞屬植物種子電鏡掃描結(jié)果相同。不同種間堇菜屬植物種子表面微觀結(jié)構(gòu)差異可作為不同種間堇菜屬植物種子差異鑒定的依據(jù)之一。在直觀的分類學(xué)上，種子表面微觀結(jié)構(gòu)特征具有重要價(jià)值[15]。

充足的水分是堇菜屬植物種子萌發(fā)的必要條件之一。種子吸水使種皮軟化，增強(qiáng)其透氣性，種胚內(nèi)酶活性隨之增強(qiáng)，其代謝活動(dòng)更為活躍；反之，由于種子缺水，會(huì)導(dǎo)致種胚因缺乏營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)致使發(fā)芽率降低[16]。常彥莉等[17]以貝母(FritillariaL.)種子為試驗(yàn)材料，對(duì)其進(jìn)行吸水試驗(yàn)，結(jié)果將種子吸水過(guò)程分為急劇吸水階段、穩(wěn)定吸水階段和飽和吸水三個(gè)階段。潘春柳等[18]研究發(fā)現(xiàn)完整絞股藍(lán)種子和破皮絞股藍(lán)種子吸水率相差不大，說(shuō)明種子休眠不是來(lái)源于種皮障礙，非物理休眠。本研究表明，5種野生堇菜屬植物種子前2 h為快速吸水期，與董慧等[19]研究結(jié)果一致；完整種子和破皮種子吸水率無(wú)顯著差異；去除種皮的堇菜屬植物種子因致密的胚乳以及沒(méi)有種皮吸水性和持水性而表現(xiàn)為較低的吸水率；紫花堇菜種子吸水率明顯低于其他4種植物種子，可能是由于致密的胚乳結(jié)構(gòu)抑制其萌發(fā)[20]。

種子生活力測(cè)定結(jié)果表明，染色濃度為0.2%時(shí)，置于30℃培養(yǎng)箱中染色6 h效果最好，可以很好地檢測(cè)堇菜屬植物種子生活力水平，評(píng)估種子潛在發(fā)芽能力。低溫儲(chǔ)藏下不同種子生活力有不同程度的降低，除戟葉堇菜外，差異均不顯著，與張玲衛(wèi)等[21]研究結(jié)果一致。不同處理下，從種子生活力看，早開(kāi)堇菜>戟葉堇菜>犁頭草=長(zhǎng)萼堇菜>紫花堇菜。種子生活力測(cè)定方法受染色溫度、染色時(shí)間、染色濃度等多方面因素影響，對(duì)堇菜屬植物種子生活力最適測(cè)定方法還需進(jìn)一步研究。

對(duì)5種野生堇菜屬植物種子萌發(fā)特性的研究結(jié)果表明，浸種處理的種子發(fā)芽較早，但浸種處理下種子萌發(fā)率較未處理種子低，原因可能是堇菜屬植物種子吸水性強(qiáng)，長(zhǎng)時(shí)間浸泡使胚得不到有效呼吸，種子失活，后期霉變嚴(yán)重，影響種子正常發(fā)芽，因此播種時(shí)忌雨季及澆水過(guò)量；除早開(kāi)堇菜外，低溫儲(chǔ)存的種子發(fā)芽率高于常溫儲(chǔ)存處理，與劉建成等[22]以川東獐牙菜種子為試驗(yàn)材料，提出低溫下貯藏可延長(zhǎng)種子壽命結(jié)果一致；經(jīng)過(guò)6個(gè)月儲(chǔ)存，種子發(fā)芽率有所降低，該結(jié)果與盧軍[23]、趙陸滟[24]等的研究結(jié)果一致，但幾種堇菜屬植物種子生活力并沒(méi)有顯著下降，說(shuō)明堇菜植物種子較耐儲(chǔ)存。幾種堇菜屬植物種子生活力均高于發(fā)芽率，其中，早開(kāi)堇菜種子生活力平均值達(dá)96%，較發(fā)芽率平均值高出16%；犁頭草種子生活力平均值達(dá)42%，較發(fā)芽率平均值高出33%；戟葉堇菜種子生活力平均值達(dá)64%，較發(fā)芽率平均值高出36%；長(zhǎng)萼堇菜種子生活力平均值達(dá)41%，較發(fā)芽率平均值高出46%；紫花堇菜種子生活力平均值達(dá)12%，較發(fā)芽率平均值高出83%，可能原因?yàn)榉N子在發(fā)育過(guò)程中形成胚，胚具活性卻未發(fā)育成熟而不具備發(fā)芽能力[25]。

GA3屬于促進(jìn)植物生長(zhǎng)的一種植物激素，是通過(guò)促進(jìn)植物細(xì)胞的分裂來(lái)調(diào)控促進(jìn)物與抑制物之間的平衡來(lái)提高種子發(fā)芽力。試驗(yàn)結(jié)果表明，赤霉素濃度、處理時(shí)間均對(duì)堇菜屬植物種子發(fā)芽率有影響，早開(kāi)堇菜種子發(fā)芽時(shí)間最早，戟葉堇菜次之，其次為長(zhǎng)萼堇菜、犁頭草，紫花堇菜發(fā)芽最慢或不發(fā)芽；除紫花堇菜外，赤霉素處理可提高4種堇菜屬植物種子發(fā)芽率、縮短種子發(fā)芽時(shí)間，綜合經(jīng)濟(jì)成本及發(fā)芽水平，其余4種野生堇菜屬植物種子在赤霉素濃度為500 mg/L下浸泡8 h效果最佳，該結(jié)果與盧精林等[26]的研究結(jié)果一致。野生紫花堇菜種子生活力低，6個(gè)月儲(chǔ)存后發(fā)芽率為0，有效種實(shí)少且不耐儲(chǔ)藏，推測(cè)由于紫花堇菜為5種野生堇菜屬植物中唯一具地上莖的植物，種實(shí)采集位置可能會(huì)影響種子發(fā)芽率[27]，因此對(duì)其種子萌發(fā)試驗(yàn)有待進(jìn)一步研究。