朱樹良，趙昆昆，高古腔，屈成鑫，馬瑩瑩，任銳，鞏方平，李忠峰，馬興立，張幸果，殷冬梅

（河南農(nóng)業(yè)大學農(nóng)學院，河南 鄭州， 450002）

花生（Arachis hypogaeaL.）是我國重要的油料作物，為人民提供豐富的植物油和蛋白質(zhì)。近年來隨著人民生活水平的不斷提高以及消費的多元化發(fā)展，人民對健康的需求日益提升，花生的保健功能也逐漸成為研究的熱點。花生衣，即花生種皮，所含的單寧酸、白藜蘆醇、原花色素等成分在抗癌癥[1]、軟化血管、抗氧化減緩衰老[2]、防止血小板減少[3]等方面有廣泛的應用，同時也應用在護膚品領(lǐng)域。

花生衣有黑色、紫紅色、粉色、白色等多種顏色，通常情況下深顏色的種衣比淺色種衣具有更高的藥理和營養(yǎng)價值。研究表明花青素是影響花生種皮顏色深淺的主要因素[4]，花青素含量越高，種皮顏色越深，反之則越淺?；ㄇ嗨刈鳛橐环N具有較高營養(yǎng)價值的物質(zhì)廣泛存在于各種植物中，與花生籽仁的營養(yǎng)價值直接相關(guān)。水稻花青素含量與其營養(yǎng)效應呈正相關(guān)，顏色較深的紫色米營養(yǎng)價值最高[5～7]。洪美艷等[8]研究表明，黑籽油菜與黃籽油菜相比普遍具有較高含油量和較高蛋白含量等優(yōu)勢。

花生的種皮顏色是花生重要的外觀和品質(zhì)性狀。Zhao 等[9]確認MYB 和EBG 通過轉(zhuǎn)錄調(diào)控黃酮類合成途徑，使粉紅色色素沉著在花生籽粒表皮層中；Wang 等[10]使用QTL-seq 方法將控制種皮顏色的基因定位在A10 染色體的4.7 Mb 區(qū)域內(nèi)，并最終定位到一個與種皮顏色相關(guān)的基因AhTCI；Wan[11]等研究表明，激素合成和信號傳導以及MBW 復合物（MYB、bHLH 和WDR）調(diào)節(jié)的黃酮合酶和二氫黃酮醇4-還原酶之間的競爭是調(diào)節(jié)白色種皮表型的關(guān)鍵分子控制節(jié)點。

隨著圖像掃描技術(shù)水平的不斷提高和智能云計算技術(shù)的迅速普及，顏色識別被廣泛用于各行各業(yè)之中，在農(nóng)業(yè)領(lǐng)域也已經(jīng)有大量的運用。如對作物病斑分割[12]和識別，草莓、花椒和番茄等作物的采摘作業(yè)[13,14]、無人機水稻識別[15]。農(nóng)業(yè)顏色識別系統(tǒng)中主要采用RGB 顏色空間（Red，Green，Blue color mode）和HSV 顏色空間，其中HSV 的參數(shù)分別為色相（Hue）、飽和度（Saturation）、明度（Value）[16]；RGB的參數(shù)分別為紅色（Red）、綠色（Green）、藍色（Blue）。不同于RGB 的顏色空間，HSV 顏色空間中各個參數(shù)間有較強的獨立性，因此對復雜性高和相似性高的顏色識別更為準確。

目前對花生種皮顏色的鑒定通常是肉眼觀察主觀判定，尤其是對不同種皮顏色群體后代的中間色很難界定。因此需要建立一種簡便、快捷的種皮顏色鑒定和分級標準。本實驗利用阿里云智能云計算中的顏色識別平臺，結(jié)合HSV 顏色空間對花生種皮顏色進行量化，從而快速、準確地對花生群體后代種皮顏色進行分級鑒定，為花生種皮顏色分子遺傳研究奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 花生材料 選取不同種皮顏色的花生品種（圖1）：農(nóng)大黑7572（黑色種皮）、Hua8106（紫色種皮）、ZP06（紫色種皮）、H7500（粉色種皮）、農(nóng)大花103（粉色種皮）、白沙1016（粉色種皮）、農(nóng)大白7626（白色種皮）、開白2號（白色種皮）。

圖1 不同花生種皮顏色總覽Fig.1 Overview of different peanut coat colors

RIL 群體：以紫色種皮花生品種ZP06 作為父本和粉色種皮花生品種H7500 進行雜交，采用單粒傳法經(jīng)過六代自交后獲得的159個RIL家系群體。

1.1.2 花青素提取液 99%甲醇+1%濃鹽酸，甲醇與濃鹽酸體積比為99:1，即配制1 L的提取液需要向990 mL甲醇加入10 mL的濃鹽酸。

1.1.3 主要儀器設備 紫外分光光度計（UV-3200PC）、尼康3100D相機。

1.2 方法

1.2.1 花生種皮拍照和處理 分別隨機挑選5 ?；ㄉN子，在相同的光照條件下用尼康3100D 拍攝3 張圖片，利用Adobe Photoshop 2020 處理圖片，最終保存為PNG 格式。

1.2.2 花生種皮花青素提取 依據(jù)其它植物材料花青素的提取方法[17～21]并結(jié)合花生種皮特性進行改良如下：隨機選取待測花生，將花生種皮取下并稱量100 mg 備用，用液氮將花生種皮研磨成粉末，將10 mL提取液與100 mg種皮粉末混合充分后30℃靜置90 min，12 000 r/min 離心2 min，吸取上清，用紫外分光光度計分別測定溶液在530 nm 和657 nm 下的吸光度值。利用吸光度值計算花青素相對含量（i），計算公式：

公式中FW為種皮稱取的重量（g）；A530為花青素的特異吸收峰值；V為提取液總體積（mL）；n為待測液稀釋倍數(shù)；ε為花青素的摩爾消光系數(shù)（26.9 mL/（mol·cm））；M為花青素的 相 對分子質(zhì)量，449.2；b為比色皿厚度（cm）。

1.2.3 AI 智能種皮顏色識別系統(tǒng)構(gòu)建 將拍攝處理后的圖片上傳至阿里視覺智能開放平臺中的顏色識別目錄下（aliyun. com），色板輸出數(shù)量選取8個，發(fā)起調(diào)用后記錄識別結(jié)果（包括Percentage、Color等參數(shù)），計算花生種皮顏色指數(shù)（p），計算公式：

公式中H、S、V均為HSV 顏色模型中的參數(shù)；p為不同顏色所占百分數(shù)；MAX（H-15,0）為Excel中的函數(shù)，表示H經(jīng)過修正后最小值大于0。

1.2.4 數(shù)據(jù)分析 采用Microsoft Excel 2019 進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析，利用R_4.0.2繪制部分圖表，文中所有數(shù)據(jù)均有三次重復，采用SPSS 22.0 軟件進行統(tǒng)計分析以及顯著性檢驗，Adobe illustrator 和Graph-Pad Prism 8繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同種皮顏色花生花青素含量分析

由表1 可得不同顏色的種皮花青素含量為：黑色種皮＞紫色種皮＞粉色種皮＞白色種皮。農(nóng)大黑7572 花青素含量最高，為5.4545 mg/g，且與其他的花生均存在顯著性差異。白色種皮的花生（開白2號和農(nóng)大白7626）花青素含量最低，分別為0.0145和0.0148 mg/g。紫色種皮花生（Hua8106 和ZP06）的花青素含量比粉色種皮花生高，并且達到顯著性差異。

表1 不同種皮顏色花生花青素含量Table 1 Anthocyanin content of peanut with different seed coat colors/（mg/g）

根據(jù)種皮花青素提取液的顏色（圖2A），可以將花生分為四個組別，即黑（農(nóng)大黑7572）、紫（Hua8106、ZP06）、粉（白 沙1016、農(nóng) 大 花103、H7500）、白（開白2 號和農(nóng)大白7626）。另外，對相鄰界限的材料進行比較（圖2B），發(fā)現(xiàn)農(nóng)大黑7527和Hua8106、ZP06與H7500、白沙1016與開白2號的花青素含量都存在顯著性差異；較為有趣的是粉色的H7500 的花青素含量顯著高于白沙1016 和農(nóng)大花103，白沙1016與農(nóng)大花103沒有顯著性差異。

圖2 不同種皮顏色花生花青素含量分析Fig.2 Analysis of anthocyanin content in peanut with different seed coat

2.2 不同品種花生種皮顏色智能識別結(jié)果分析

根據(jù)阿里視覺智能開放平臺的識別結(jié)果繪制的色彩結(jié)構(gòu)圖與肉眼觀察到的對應樣品拍照的種皮顏色相同。由圖3 可知，農(nóng)大黑7572 種皮顏色指數(shù)最高為0.703，其顏色主要為十六進制顏色中的“#462F29（black）”、“#3C2A26（deep brown）”、“#4F362F（maroon）”。農(nóng)大白7626 種皮顏色指數(shù)最低為0.147，顏色主要為“#CEC8B5（lovry）”、“#D8D3C1（pale godenrod）”、“#C6BEA9（tan）”。根據(jù)種皮顏色結(jié)構(gòu)和直方圖（圖3），將8個花生品種分為四個組別，即黑（農(nóng)大黑7572）、紫（Hua 8106、ZP06）、粉（白沙1016、農(nóng)大花103、H7500）、白（農(nóng)大白7626、開白2號）。根據(jù)四個階梯分布情況，將種皮顏色指數(shù)分為四個組別范圍，即黑色（≧0.6000±0.0238）、紫色（0.6000±0.0238～0.4000±0.0238）、粉 色（0.4000±0.0238～0.2000±0.0238） 、白 色（ ≦ 0.2000±0.0238）。

圖3 花生種皮顏色指數(shù)分析Fig.3 Analysis of peanut seed coat color index

2.3 花青素相對含量與種皮顏色指數(shù)的相關(guān)性分析

為明確花生種皮顏色指數(shù)（p）和花青素相對含量（i）的關(guān)系，對兩組數(shù)據(jù)進行了對比。將花生種皮顏色指數(shù)設為橫坐標，花生種皮花青素相對含量設為縱坐標繪制散點圖并計算擬合曲線。結(jié)果顯示，p 與i 呈現(xiàn)出正相關(guān)趨勢，同時觀察到開白2 號與農(nóng)大白7626 的散點位置幾乎重合，白沙1016 與農(nóng)大花103 的散點位置幾乎重合，表明花青素含量和種皮顏色指數(shù)兩組種皮顏色高度重合。H7500散點位置位于ZP06 與農(nóng)大花103 之間，再次印證了H7500的種皮顏色是粉色種皮中顏色較深的（圖4A）。

利用R 語言中的ComplexHeatmap 包對不同花生種皮顏色進行聚類分析。無論是花青素相對含量還是種皮顏色指數(shù)的聚類分析結(jié)果均分為四個組別（圖4B）。在花生種皮顏色指數(shù)聚類分析中農(nóng)大黑7572 為深灰（＞grey 75%），Hua8106 和ZP06 為中灰（grey 75%～grey 50%），H7500、農(nóng)大花103 和白沙1016 為灰（grey 50%～grey 25%），開白2 號和農(nóng)大白為淺灰（＜grey 25%），這與花青素含量聚類分析結(jié)果相同。

圖4 花生種皮花青素相對含量與種皮顏色指數(shù)的相關(guān)性分析Fig.4 Correlation analysis between anthocyanin content and seed coat color index of peanut

2.4 AI智能種皮顏色識別系統(tǒng)鑒定RIL群體

利用AI 智能種皮顏色識別系統(tǒng)對RIL 群體的種皮顏色進行鑒定（圖5）。為模擬種皮鑒定應用場景，將159個家系（編號：RIL600-759）圖片分為四個組別，即深紫（組1）、紫（組2）、深粉（組3）、粉（組4）。RIL 群體的父本為紫色種皮花生ZP06，母本為粉色種皮花生H7500，因此159 個家系種皮顏色范圍均在紫色和粉色區(qū)間內(nèi)，即0.6±0.0238～0.2±0.0238。從四個組別中選取了14 個家系，即組1：638、698、712，組2：624、635、749、752，組3：611、631、722、646，組4：629、670、623。對這14個家系的種皮顏色指數(shù)進行聚類分析，結(jié)果分為五組，第1組638、698、712，第2 組635、749、752，第3 組631、646、722，第4 組611、624、629，第5 組623、670。根據(jù)分組結(jié)果可知，種皮顏色指數(shù)鑒定結(jié)果中極端的種皮顏色與肉眼分類結(jié)果重合，而位于種皮顏色過渡區(qū)域的樣品鑒定差別很大，種皮顏色指數(shù)在種皮顏色過渡區(qū)域的鑒定更加準確客觀。

圖5 AI智能種皮顏色識別模型鑒定花生RIL群體Fig.5 AI intelligent seed coat color recognition system identifies peanut RIL population

3 討論與結(jié)論

3.1 種皮顏色指數(shù)科學性驗證

將p與i數(shù)據(jù)進行對比和相關(guān)性分析，結(jié)果表明兩組數(shù)據(jù)呈線性正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)為0.9325，同時折線圖走勢以及聚類分析結(jié)果高度相似，這說明根據(jù)花生種皮顏色指數(shù)可以準確地反映花生種皮中花青素含量。改良minmax-trim 方法[22]對種皮顏色指數(shù)數(shù)值標準化，結(jié)果相較于花青素含量的數(shù)值標準來說，種皮顏色指數(shù)有準確的上界和下屆（0～1），范圍界限間的差值均勻且顯著。對花生種皮HSV顏色空間進行了標準化運算，經(jīng)過大量計算最終確定了S值和V 值比例為1：200，發(fā)現(xiàn)V 值是影響花生種皮顏色深淺的主要因素。同時參照前人對HSV顏色空間中的誤差處理[23]，認定S 值為次要因素，因此需要考慮S 值對種皮顏色指數(shù)產(chǎn)生的誤差影響，通過計算得出修正值為0.0238。

傳統(tǒng)分類時的顏色邊界十分模糊，中間顏色鑒別困難。為建立顏色識別系統(tǒng)下的種皮顏色分類機制，種皮顏色分類時，選取具有代表性的黑色、紫色、粉色和白色的花生作為實驗材料，結(jié)合花青素含量數(shù)據(jù)和種皮顏色指數(shù)直方圖，將樣品分為黑色（≧0.6000±0.0238）、紫色（0.6000±0.0238～0.4000±0.0238）、粉色（0.4000±0.0238～0.2000±0.0238）和白色（≦0.2000±0.0238）四類。這一分組結(jié)論與p和i 的相關(guān)性分析中散點坐標位置的分布重合。在實踐過程中種皮顏色指數(shù)的上界很難達到1，因此將上界調(diào)整為0.8。

3.2 AI智能種皮顏色識別系統(tǒng)特點及應用

花生種皮顏色的鑒定標準并不統(tǒng)一，運用不同鑒定標準得出的結(jié)論也不盡相同，開發(fā)一種兼容性強、數(shù)值準確的鑒定模型十分重要[24]。目前主流的種皮顏色鑒定方法有兩種，一種是對種皮花青素含量標準化，如HPLC 法檢測花青素、直提花青素法等，這類方法得到的數(shù)據(jù)精密度高[25]，但操作復雜、價格昂貴，且測量時間過長。Wan 等[26]研究發(fā)現(xiàn)黑色素含量上升能夠造成花生種皮色素沉著，因此除花青素外的其他色素物質(zhì)也能夠影響種皮顏色深淺，該方法對種皮顏色的鑒定可能存在誤判。另一種方法是對花生掃描或拍攝圖片進行色彩分析，這類方法快速、操作簡單、經(jīng)濟[27]。差異主要存在于對顏色空間的運用，如RGB 三原色模型、HSV 顏色空間、CMYK顏色空間等，其中不同的顏色空間的適用范圍不同。根據(jù)不同需求選取不同特點的顏色空間，如在種皮顏色鑒定過程中，對深淺這一縱深的準確描述十分重要，HSV 顏色空間中各個參數(shù)間相對獨立，V 對花生種皮顏色深淺描述準確，但RGB顏色空間中對深淺的范圍邊界模糊，無法對像素點直接量化[28]。因此HSV 顏色空間更適合作為種皮顏色鑒定的量化指標。

本實驗中，采用不同種皮顏色的花生制定種皮顏色判斷標準，其中包含了典型黑色種皮花生農(nóng)大黑7527，白色種皮花生農(nóng)大白7626 等，對比了經(jīng)典花青素含量測定和AI智能種皮顏色識別兩種方法，驗證了AI智能識別花生種皮顏色方法的可行性，以及劃分了四個種皮顏色范圍，并利用該方法鑒定了RIL 群體種皮顏色，建立了花生種皮顏色指數(shù)標準模型，為今后花生種皮顏色的遺傳研究提供參考。