高樂，李志強(qiáng)，李凱，智海劍*

（1.北京農(nóng)業(yè)職業(yè)學(xué)院園藝系，北京 ， 102442；2.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)國家大豆改良中心/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部大豆生物學(xué)與遺傳育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/作物遺傳與種質(zhì)創(chuàng)新國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 南京， 210095）

大豆[Glycine max(L.)Merr.]是世界上最重要的豆類作物，是人類飲食中優(yōu)質(zhì)植物油和蛋白質(zhì)的主要來源，富含異黃酮、維生素、礦物質(zhì)、磷脂、皂素等活性成分，對(duì)人類健康極為有益[1]。大豆在生長發(fā)育過程中容易受到多種病原物的侵害，包括卵菌、線蟲、真菌、細(xì)菌、病毒等，其中大豆花葉病毒（soybean mosaic virus，SMV）引起的病毒病是大豆上最為流行的病害，嚴(yán)重影響大豆的產(chǎn)量和品質(zhì)[2～5]。

SMV屬于馬鈴薯Y病毒科（Potyviridae），馬鈴薯Y 病毒屬（Potyvirus），基因組為線性單鏈正義[ss(+)]RNA，全長約10 kb，編碼11 種多功能蛋白，從5＇N 端到3＇C端依次為P1、HC-Pro、P3、P3N-PIPO、6K1、CI、6K2、VPg、NIa-Pro、NIb、CP（圖1）[4,6]。根據(jù)病毒分離物在大豆鑒別寄主上的癥狀反應(yīng)和致病性差異，中國、美國、日本分別將SMV 劃分為22 個(gè)株系（SC1～SC22）[7]、7 個(gè) 株 系（G1～G7）[8]、5 個(gè) 株 系（A～E）[9]。SMV 以種子帶毒作為初侵染源，被30 多種蚜蟲非持久性傳播，造成田間病害流行[4,10]。大豆感染SMV 后，會(huì)產(chǎn)生花葉和壞死等癥狀，造成植株光合面積減少和光合能力降低，生長量下降，植株矮化，籽粒出現(xiàn)褐斑，通常造成大豆減產(chǎn)8%～35%，嚴(yán)重時(shí)產(chǎn)量損失在50%以上甚至絕收[2～6,10]。

圖1 大豆花葉病毒（SMV）基因組結(jié)構(gòu)和蛋白切割位點(diǎn)[6]Fig.1 Genome organization and cleavage sites of soybean mosaic virus(SMV)[6]

目前尚無有效的化學(xué)藥劑可以防治大豆花葉病毒病，培育抗病大豆品種是最經(jīng)濟(jì)、安全、有效的途徑[11,12]。然而，傳統(tǒng)的抗病育種周期漫長，育成品種的抗譜較窄且抗性容易因病毒的變異而喪失[13,14]。轉(zhuǎn)基因技術(shù)可以挖掘跨物種基因資源，或通過基因編輯技術(shù)創(chuàng)造出新的基因，從而拓寬遺傳基礎(chǔ)，這些優(yōu)勢使其成為大豆抗病毒研究的有力手段，為大豆抗病育種提供重要的理論依據(jù)。這些技術(shù)的有關(guān)報(bào)道包括：過量表達(dá)SMV 抗病基因，可以誘導(dǎo)大豆產(chǎn)生正向抗性；應(yīng)用RNA 干擾（RNA interference，RNAi）技術(shù)沉默寄主感病因子，可以誘導(dǎo)大豆產(chǎn)生負(fù)向抗性；過量表達(dá)SMV CP 外殼蛋白或是應(yīng)用RNAi 技術(shù)靶向SMV 基因組，可以誘導(dǎo)大豆產(chǎn)生病原物誘導(dǎo)的抗性，等等（表1）。

表1 大豆花葉病毒?。⊿MV）轉(zhuǎn)基因抗性的研究報(bào)道Table 1 Reports of transgenic resistance to soybean mosaic virus disease

1 大豆對(duì)SMV的正向抗性

在寄主體內(nèi)過量表達(dá)內(nèi)源或外源抗病基因，可以誘導(dǎo)寄主產(chǎn)生對(duì)病毒的正向抗性。例如將天然的SMV 抗病基因?qū)氪蠖梗共』蛩幋a的蛋白質(zhì)能夠識(shí)別特定的病原物效應(yīng)子（無毒基因），刺激相關(guān)的激素信號(hào)傳導(dǎo)途徑并激活防御反應(yīng)機(jī)制，從而以“基因?qū)颉钡姆绞降钟《救肭帧iu 和Whitham[15]在本氏煙葉片中瞬時(shí)表達(dá)了一個(gè)含有III型DnaJ 結(jié)構(gòu)域的大豆基因GmHSP40.1，植株發(fā)生過敏性壞死反應(yīng)，說明該基因與抗病相關(guān)；應(yīng)用病毒誘導(dǎo)的基因沉默技術(shù)（virus-induced gene silencing，VIGS）沉默GmHSP40.1增強(qiáng)了大豆對(duì)SMV的敏感性，進(jìn)一步證實(shí)了該基因在大豆抗病中的關(guān)鍵作用[15]。Zhou 等[16]將大豆鉀離子（K+）通道相關(guān)基因GmAKT2導(dǎo)入栽培大豆品種Williams 82 中，轉(zhuǎn)基因大豆植株對(duì)SMV 的抗性得到了顯著提高，說明改變K+轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的表達(dá)水平是提高大豆SMV 抗性的一種新型有效的方法。Zhou 等[17]將鉬輔因子生物合成蛋白相關(guān)基因GmCnx1導(dǎo)入大豆中，促進(jìn)了硝酸還原酶（nitrate reductase，NR）和乙醛氧化酶（aldehyde oxidase，AO）的上調(diào)表達(dá)（分別增加了2.6 倍和3.9 倍），提升了轉(zhuǎn)基因大豆的生理和抗逆作用，從而增強(qiáng)了SMV 抗性。馬露萍[18]將促絲裂原活化蛋白激酶相關(guān)基因GmMAPKKK導(dǎo)入大豆中，提高了大豆對(duì)SMV 的抗性和耐受力，通過檢測發(fā)現(xiàn)相關(guān)防御基因得到了上調(diào)表達(dá)，推測這可能是通過刺激水楊酸（salicylic acid，SA）信號(hào)傳導(dǎo)途徑實(shí)現(xiàn)的。He等[19]分別對(duì)抗、感大豆品種接種SMV，在轉(zhuǎn)錄組水平上比較分析了品種間的基因表達(dá)差異，發(fā)現(xiàn)赤霉素刺激轉(zhuǎn)錄的一個(gè)亞基因組在感病品種中被下調(diào)，而在抗病品種中沒有變化；序列比對(duì)和系統(tǒng)發(fā)育分析表明，其中一個(gè)基因GmSN1與馬鈴薯抗病基因Sna?kin-1密切相關(guān)，并且在大豆中過量表達(dá)GmSN1能夠顯著增強(qiáng)轉(zhuǎn)基因大豆對(duì)SMV 的抗性水平，作者推測GmSN1最有可能通過影響信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和免疫響應(yīng)相關(guān)基因的表達(dá)水平來增強(qiáng)植物的抗病性。Xun等[20]在大豆中過表達(dá)了一個(gè)TIR-NBS-LRR 型抗病基因GmKR3，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因大豆對(duì)多個(gè)SMV株系的抗性均顯著提高；進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)基因大豆中脫落酸（abscisic acid，ABA）分解代謝相關(guān)基因下調(diào)表達(dá)，且ABA 響應(yīng)基因上調(diào)表達(dá)，推測這種增強(qiáng)的SMV 抗性至少部分是通過ABA 信號(hào)途徑實(shí)現(xiàn)的。牛陸等[21]和Yang 等[22]利用核糖核酸酶PAC1 能夠識(shí)別和降解植物RNA 病毒復(fù)制過程中產(chǎn)生的雙鏈RNA（double-stranded RNA，dsRNA）這一特性，將來源于粟酒裂殖酵母菌（Schizosaccharomyces pombe）的PAC1基因?qū)隬illiams 82 中，顯著抑制了大豆體內(nèi)SMV 的積累以及癥狀的發(fā)展，增強(qiáng)了轉(zhuǎn)基因大豆對(duì)多個(gè)SMV 株系的抗性水平。Ishibashi等[23]圖位克隆了SMV 廣譜抗性基因Rsv4，該基因編碼具有dsRNA 降解活性的RNase H 家族蛋白，能夠在病毒復(fù)合物組裝過程中進(jìn)入病毒復(fù)制室降解病毒的dsRNA，并且通過轉(zhuǎn)化感病大豆品種進(jìn)一步明確了該基因的抗病功能。

2 大豆對(duì)SMV的負(fù)向抗性

沉默寄主內(nèi)源感病因子，可以誘導(dǎo)寄主產(chǎn)生對(duì)病毒的負(fù)向抗性。例如應(yīng)用RNAi 技術(shù)沉默大豆感病因子，感病基因編碼的蛋白質(zhì)在SMV 的侵染循環(huán)中是必不可少的，因此一個(gè)或多個(gè)感病因子的缺失或突變可以阻斷病毒與寄主因子的相互作用，限制病毒的繁殖、復(fù)制和運(yùn)動(dòng)，激活防御反應(yīng)機(jī)制，從而產(chǎn)生負(fù)向抗性，即“感病性喪失”誘發(fā)的抗性。Liu等[24]利用VIGS 技術(shù)沉默大豆內(nèi)源基因GmMPK4，顯著上調(diào)了SA 信號(hào)途徑中參與防御反應(yīng)基因的表達(dá)水平，增加了SA 和H2O2的積累量，從而增強(qiáng)了對(duì)SMV 的抗性；而與生長發(fā)育有關(guān)基因的表達(dá)水平顯著下調(diào)，表明該基因負(fù)向調(diào)控寄主抗病防御反應(yīng)且正向調(diào)控寄主的生長發(fā)育。Liu 等[25]利用VIGS 技術(shù)沉默大豆內(nèi)源基因GmMPK6，導(dǎo)致葉片發(fā)育遲緩和細(xì)胞程序性死亡，這是激活防御反應(yīng)的典型表現(xiàn)，從而增強(qiáng)了寄主對(duì)SMV 的抗性。Gao 等[14]發(fā)現(xiàn)接種SMV 后，感病大豆品種的真核翻譯起始因子GmeIF4E的表達(dá)水平明顯上調(diào)，而抗病品種的GmeIF4E變化不顯著，說明感病品種的GmeIF4E參與了SMV 的侵染過程；進(jìn)一步利用RNAi 技術(shù)創(chuàng)制了沉默GmeIF4E的轉(zhuǎn)基因大豆材料，通過抗病鑒定證實(shí)該轉(zhuǎn)基因材料對(duì)多個(gè)SMV 株系都具有良好的抗性，為培育SMV 廣譜抗病大豆提供了新方法。Luan 等[26]前期利用酵母雙雜交系統(tǒng)篩選到一個(gè)能夠與SMV高度互作的大豆感病因子GmVma12，之后應(yīng)用RNAi技術(shù)將該基因的反向重復(fù)序列（invertedrepeat sequence，IRS）導(dǎo)入到大豆中，抑制了GmV?ma12的表達(dá)水平，從而誘導(dǎo)了大豆對(duì)SMV 的抗性。Zong 等[27]利用二代測序技術(shù)證實(shí)SMV CP 蛋白和大豆的一個(gè)DnaJ 型蛋白存在互作，進(jìn)而利用VIGS 技術(shù)沉默該大豆蛋白的編碼基因GmCPIP，發(fā)現(xiàn)病毒的積累量顯著下降，增強(qiáng)了大豆對(duì)SMV的抗性。

3 病原物誘導(dǎo)的SMV抗性

將病原物自身的基因序列導(dǎo)入寄主，能夠誘導(dǎo)寄主產(chǎn)生對(duì)該病原物的抗性，即病原物誘導(dǎo)的抗性。例如在大豆體內(nèi)過量表達(dá)SMV CP 外殼蛋白或是應(yīng)用RNAi 技術(shù)靶向SMV 基因組，均可以誘導(dǎo)大豆產(chǎn)生SMV 抗性。Wang 等[28]通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將SMV 外殼蛋白CP基因和3＇-UTR 轉(zhuǎn)入大豆中，在獲得的轉(zhuǎn)基因材料中鑒定到兩個(gè)SMV 高抗家系，這是誘導(dǎo)大豆產(chǎn)生病原物誘導(dǎo)抗性的首個(gè)報(bào)道；該研究團(tuán)隊(duì)在后續(xù)的試驗(yàn)中進(jìn)一步評(píng)估了轉(zhuǎn)基因大豆品系的田間表現(xiàn)，分析了SMV 的時(shí)空動(dòng)態(tài)變化，結(jié)果證明病原物誘導(dǎo)的抗性可以有效減少轉(zhuǎn)基因大豆中病原體的傳播[29]。Furutani 等[30,31]通過基因槍轟擊法將SMV 減毒分離株的CP基因?qū)氪蠖蛊贩NJack 的體細(xì)胞胚中，獲得了三個(gè)對(duì)SMV 具有高強(qiáng)度抗性的家系，并最終證實(shí)雖然采用過表達(dá)SMVCP基因的手段，但誘發(fā)了RNAi 介導(dǎo)的抗性。Zhang等[32]利用單個(gè)轉(zhuǎn)基因元件同時(shí)表達(dá)幾個(gè)短的IRS，每個(gè)IRS 都包含一種病毒的高度保守序列，最終以這種策略獲得的轉(zhuǎn)基因植株對(duì)包括SMV 在內(nèi)的三種病毒均表現(xiàn)出強(qiáng)大的系統(tǒng)抗性。章潔瓊等[33]利用RNAi 技術(shù)靶向SMVCP基因，獲得了單拷貝插入、外源基因能夠穩(wěn)定遺傳的轉(zhuǎn)基因植株，抗病鑒定實(shí)驗(yàn)證明該轉(zhuǎn)基因材料對(duì)SMV具有良好的抗性。Kim等[34,35]利用RNAi 技術(shù)分別靶向SMVCP和HC-Pro基因，獲得的轉(zhuǎn)基因植株表現(xiàn)出良好的SMV 抗性，并且在抗性植株中消除了種皮斑駁的現(xiàn)象。Gao等[13]利用RNAi 技術(shù)，將含有SMVHC-Pro基因片段的IRS 導(dǎo)入到多個(gè)栽培大豆品種中，獲得了大量的轉(zhuǎn)基因材料，并且誘發(fā)了高強(qiáng)度、穩(wěn)定遺傳的SMV抗性。楊向東等[36]利用RNAi 技術(shù)靶向與SMV 運(yùn)動(dòng)和寄主范圍有關(guān)的P3基因，獲得了單拷貝整合形式的轉(zhuǎn)基因大豆植株，顯著提高了轉(zhuǎn)基因材料對(duì)SMV的抗性水平，并且抗性可以穩(wěn)定遺傳。Yang 等[37,38]從SMV SC3 株系中分別克隆了P3和NIb的基因片段，利用RNAi 技術(shù)獲得的轉(zhuǎn)基因大豆家系在連續(xù)三年的田間試驗(yàn)條件下對(duì)多個(gè)SMV 株系表現(xiàn)出穩(wěn)定、高強(qiáng)度的抗性。

4 大豆對(duì)其他病毒的轉(zhuǎn)基因抗性

除了SMV 以外，菜豆莢斑駁病毒（bean pod mottle virus，BPMV）、苜?；ㄈ~病毒（alfalfa mosaic virus，AMV）、菜豆普通花葉病毒（bean common mosaic virus，BCMV）、西瓜花葉病毒（watermelon mosaic virus，WMV）也能夠經(jīng)常在大豆田中檢測到，當(dāng)這些病毒復(fù)合侵染寄主并進(jìn)行協(xié)同作用時(shí)，會(huì)進(jìn)一步加劇大豆產(chǎn)量的損失[13,14,22,32,37,38,41]。此外，SMV 與其他Potyvirus成員之間存在著頻繁的種間遺傳物質(zhì)交換：Chen 等[42]從天南星科（Araceae）植物半夏（Pinel?lia ternata）中分離出一種類似于SMV 病毒的分離物，測序結(jié)果顯示它是由SMV 和芋花葉病毒（dasheen mosaic virus，DsMV）重組產(chǎn)生的，這是SMV 自然侵染天南星科植物的首次報(bào)道；近年來發(fā)現(xiàn)一種新型SMV 重組株系，廣泛流行于中國大豆種植區(qū)，它是由SMV 和BCMV 或類似于BCMV 的病毒重組產(chǎn)生的[43～46]；Jiang等[47]報(bào)道了一個(gè)由SMV和WMV重組產(chǎn)生的SMV 分離物，能夠在大豆和本氏煙中引發(fā)不同類型的癥狀。上述報(bào)道說明大豆田間的病毒病害具有復(fù)雜性和潛在的不確定性，對(duì)大豆的生產(chǎn)實(shí)踐提出了嚴(yán)峻的考驗(yàn)，因此在防治SMV 的同時(shí)，也要警惕其他病毒的協(xié)同危害。

近年來，研究人員利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)成功培育出兼抗多種病毒的轉(zhuǎn)基因大豆品系：Zhang等[32]分別克隆了AMV、BPMV、SMV 高度保守的短序列（小于150 bp），并且串聯(lián)組裝成單個(gè)轉(zhuǎn)基因元件，最終獲得的轉(zhuǎn)基因大豆能夠同時(shí)抵御這三種病毒的侵染，展現(xiàn)出強(qiáng)大的系統(tǒng)抗性；Yang等[37,38]和Gao等[14]分別利用RNAi技術(shù)靶向沉默SMVNIb/P3基因和大豆翻譯起始因子GmeIF4E基因，成功誘導(dǎo)轉(zhuǎn)基因大豆產(chǎn)生對(duì)SMV、BCMV、WMV 的高強(qiáng)度抗性；Xun 等[20]和Yang 等[22]分別過表達(dá)大豆內(nèi)源抗病基因GmKR3和粟酒裂殖酵母菌PAC1基因，均發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因大豆植株對(duì)SMV、BCMV、WMV、BPMV具有良好的抗性。

5 展望

傳統(tǒng)的大豆育種技術(shù)在SMV 抗病育種中仍占據(jù)主要地位，但其育種周期漫長且依賴于優(yōu)良的抗源，然而SMV 存在復(fù)雜的株系分化，大豆抗源對(duì)SMV 的抗性又具有株系?；裕虼藗鹘y(tǒng)方法很難在短期內(nèi)培育出對(duì)SMV 具有廣譜抗性的大豆新品種。此外，SMV 具有較強(qiáng)的變異性，育成大豆品種容易因SMV 株系的突變而喪失抗性，由于常年推廣種植抗病大豆品種，對(duì)SMV 產(chǎn)生了強(qiáng)大的定向選擇壓，導(dǎo)致“抗性-打破”型SMV 株系頻繁出現(xiàn)，最終造成品種的抗性喪失[6,39,40]。

轉(zhuǎn)基因技術(shù)可以打破物種間的屏障，挖掘跨物種基因資源或通過基因編輯技術(shù)創(chuàng)造出新的基因，在較短時(shí)期內(nèi)完成抗病基因的定向改造、重組、轉(zhuǎn)移，從而拓寬遺傳基礎(chǔ)并為大豆抗病育種提供重要的理論依據(jù)，縮短優(yōu)良抗病品種的選育進(jìn)程，為培育廣譜、持久抗性的轉(zhuǎn)基因大豆新品種提供了新的方法策略。近年來，大豆對(duì)SMV 轉(zhuǎn)基因抗性的研究取得了重要進(jìn)展（表1），涵蓋正向抗性、負(fù)向抗性、病原物誘導(dǎo)的抗性，為轉(zhuǎn)基因大豆抗病育種提供了堅(jiān)實(shí)的理論基礎(chǔ)。然而，盡管已經(jīng)挖掘出了一定數(shù)量的SMV 抗病基因，也獲得了一些轉(zhuǎn)基因大豆抗病材料，但這些抗病基因和轉(zhuǎn)基因材料均未應(yīng)用于生產(chǎn)實(shí)踐，因此轉(zhuǎn)基因大豆抗病育種還沒有取得實(shí)質(zhì)的發(fā)展，商業(yè)化種植道路還十分遙遠(yuǎn)。造成上述原因的根源在于轉(zhuǎn)基因技術(shù)的商業(yè)化發(fā)展受限于不同國家的管控政策以及大眾對(duì)該項(xiàng)技術(shù)的接受程度。因此，需要在傳統(tǒng)轉(zhuǎn)基因的基礎(chǔ)上引入新的技術(shù)手段，以期改變轉(zhuǎn)基因技術(shù)商業(yè)化發(fā)展難的問題。

近年來興起的CRISPR/Cas 基因組編輯技術(shù)是一種高效、精準(zhǔn)、特異的基因組靶向修飾技術(shù)，相比于傳統(tǒng)的轉(zhuǎn)基因方法，該技術(shù)能夠利用序列特異性核酸酶實(shí)現(xiàn)DNA 特定位點(diǎn)的插入、缺失、突變或替換以及RNA 特定位點(diǎn)的靶向切割，該項(xiàng)技術(shù)已成為科研領(lǐng)域的熱門，為基因功能的研究和作物農(nóng)藝性狀的定向精準(zhǔn)改良提供了新的手段，將作物育種帶入了5G 時(shí)代[48]，同時(shí)也為改良植物的抗病性、加速抗病育種提供了新的思路[49]。目前已開發(fā)出不同類型的Cas 蛋白變體，其中SpCas9（Streptococcus pyo?genes）能夠靶向雙鏈DNA 結(jié)構(gòu)[50]，F(xiàn)nCas9（Francisel?la novicida）[51]、LshCas13a（Leptotrichia shahii）[52]、Cas-Rx（Ruminococcus flavefaciens）[53]能夠靶向單鏈RNA結(jié)構(gòu)，這分別為防治植物DNA 病毒和RNA 病毒開辟了新的途徑[49,54～56]。迄今為止，CRISPR/Cas 系統(tǒng)已被成功應(yīng)用于不同種類的植物抗病毒研究中，包括本氏煙（Nicotiana benthamiana）[57～67]、擬南芥（Ara?bidopsis thaliana）[59,62,64,68-71]、番 茄（Solanum lycopersi?cum）[63]、大麥（Hordeum vulgare）[72]、黃瓜（Cucumis sa?tivus）[73]、木 薯（Manihot esculenta Crantz）[74]、水 稻（Oryza sativa）[67]、馬鈴薯（Solanum tuberosum）[75]、大豆（Glycine max）[76]。綜上表明，CRISPR/Cas 技術(shù)與傳統(tǒng)的轉(zhuǎn)基因技術(shù)相輔相成，在植物抗病毒研究領(lǐng)域蘊(yùn)藏著巨大潛力[77]，為加速改良大豆的抗病性提供了全新的育種策略，對(duì)開展大豆基因編輯抗病育種具有深遠(yuǎn)意義。