李曉彤, 王艷春, 高 葉, 張曉蕾, 丁 婭, 金文杰*, 楊功俊*

(1. 中國藥科大學藥學院, 南京 211198; 2. 揚州大學獸醫(yī)學院, 江蘇 揚州 225002)

豬流行性腹瀉是一種以嘔吐、腹瀉和脫水為主要癥狀的常見豬腸道性疾病．豬流行性腹瀉病毒(porcine epidemic diarrhea virus, PEDV)是引起豬病毒性腹瀉的常見病原之一．自2010年以來, 豬流行性腹瀉病的暴發(fā)造成了巨大的經(jīng)濟損失,因此,對PEDV的定期監(jiān)測具有重大意義[1]．目前豬腹瀉病毒的常用檢測方法有酶聯(lián)免疫法(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)[2],逆轉錄聚合酶鏈反應(reverse transcription-polymerase chain reaction, RT-PCR)[3], 逆轉錄環(huán)介導等溫擴增(reverse transcription-loop mediated isothermal amplification, RT-LAMP)[4]和免疫層析法(immunochromatography assay, ICA)[5]等．電化學發(fā)光(electrochemiluminescence, ECL)技術由于快速、靈敏等優(yōu)點在免疫分析中的應用日益廣泛[6]．其中, 無標記電化學發(fā)光免疫傳感器具有操作步驟少, 時間短等優(yōu)點,為蛋白質檢測提供更為簡便的檢測方法[7]．半導體納米材料以其獨特的量子尺寸效應、表面效應和介電性質等優(yōu)點引起了眾多研究者的關注．目前已有許多半導體納米材料如CdS[8], CdSe[9]和Fe2O3[10]等成功合成并應用于ECL免疫傳感器的研究, 其中硫化鎘納米晶體(CdS NCs)是電化學發(fā)光免疫中最常用的納米材料之一[11-12]．本文采用氨水處理CdS納米晶體(CdS-NH3NCs)制備無標記型電化學發(fā)光免疫傳感器,并成功用于實際樣品中PEDV的檢測．

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

電化學實驗在CHI 660E型電化學工作站(上海辰華儀器公司)進行;電化學發(fā)光實驗在MPI-E型電化學發(fā)光分析儀(西安瑞邁分析儀器有限責任公司)進行, 實驗均采用三電極體系:玻碳電極(GCE, 直徑3 mm)及其修飾電極為工作電極,鉑絲電極為對電極,飽和甘汞電極(SCE)為參比電極．透射電子顯微鏡Tecnai 12 G2F30 S-Twin(FEI公司, 美國)對CdS-NH3進行表征和元素分析．

PEDV抗原和PEDV-2C11抗體由揚州大學獸醫(yī)學院提供; 五水氯化鎘、硫化鈉(上海阿拉丁有限公司); 氨水(南京化學試劑股份有限公司)．其他試劑均為分析純,所有溶液均由二次蒸餾水配制．

1.2 硫化鎘的制備

硫化鎘納米晶體按照文獻[13]報道的方法進行制備．步驟如下: 將0.11 g五水氯化鎘溶于60 mL 70 ℃二次蒸餾水中攪拌30 min, 然后加入0.59 g硫化鈉, 得到淡黃色溶液．在回流條件下繼續(xù)攪拌3 h, 冷卻至室溫．將所得產(chǎn)物用二次蒸餾水和乙醇交替洗滌3次, 離心收集得到CdS NCs并分散于10 mL的二次蒸餾水中備用．

1.3 硫化鎘-氨水復合材料的制備

硫化鎘-氨水復合物按照文獻[14]報道的方法進行制備．步驟如下: 將1 mL 25%氨水與10 mL新制CdS NCs溶液混合并稀釋至30 mL, 在70 ℃下回流并劇烈攪拌3 h后, 成功制得CdS-NH3NCs．

1.4 修飾電極的制備

實驗前, 用0.05 μm的Al2O3懸浮液將玻碳電極拋光成鏡面, 并用硝酸(φ=50%)溶液、無水乙醇、超純水依次超聲清洗．將10 μL CdS-NH3溶液滴涂于電極表面, 并在空氣中自然晾干(記為CdS-NH3/GCE)．然后將CdS-NH3/GCE置于φ=1%戊二醛(GA)溶液中浸泡20 min, 用0.1 mol·L-1PBS(pH=7.0)洗去未結合的戊二醛(記為GA/CdS-NH3/GCE)．隨后, 將10 μL一定濃度的PEDV-2C11抗體溶液滴于電極表面并置于4 ℃下孵育12 h(記為PEDV-2C11/GA/CdS-NH3/GCE)．用0.1 mol·L-1PBS(pH=7.0)洗去未結合的抗體分子, 并用10 g·L-1牛血清白蛋白溶液(BSA)封閉電極表面的非特異性吸附位點(記為BSA/PEDV-2C11/GA/CdS-NH3/GCE)．電化學發(fā)光免疫傳感器制備過程見圖1．

圖1 CdS-NH3的合成過程及免疫傳感器的制備Fig.1 The synthesis procedure of the CdS-NH3 and the schematic illustration of the electrochemiluminescent immunosensor

1.5 豬腹瀉病毒的電化學發(fā)光測定方法

將制得的免疫傳感器先與不同濃度PEDV室溫下孵育一定時間, 然后用0.1 mol·L-1PBS(pH=7.0)充分清洗以除去非特異性吸附的PEDV．將傳感器置于含0.12 mol·L-1Na2S2O8的0.1 mol·L-1PBS(pH=7.4)溶液中進行電化學發(fā)光檢測．

1.6 實際樣品制備

加標樣品按照文獻[15]報道的方法進行制備．稱取3份0.5 g豬糞樣品分別置于離心管中并加入4 mL 0.1 mol·L-1PBS(pH=7.4)．然后,以已知的PEDV濃度水平加入PEDV樣品, 使其濃度分別為1.65,1.65×102, 1.65×104TCID50·mL-1．將所得混合物旋渦10 min,然后以10 000 r·min-1離心15 min, 靜置15 min后收集上層清液, 4 ℃下保存?zhèn)溆茫?/p>

2 結果與討論

2.1 CdS-NH3納米復合材料的表征

圖2 CdS-NH3的HRTEM圖(A,B,C)及EDX圖譜(D) Fig.2 HRTEM image (A, B and C) and EDX spectrum (D) of CdS-NH3

圖3 CdS-NH3的紫外-可見吸收光譜和熒光光譜(λex=380 nm)Fig.3 UV-vis absorption spectra and PL spectra of CdS-NH3

采用高分辨透射電鏡(HRTEM)對制備的CdS-NH3NCs的形貌進行了表征,結果如圖2(A～C)所示．由電鏡圖可見,制備得到了粒徑約為5～10 nm球形結構的CdS-NH3NCs．圖2(D)是CdS-NH3NCs的元素分析結果．結果表明該材料中含有Cd、S、N、C和O等幾種元素．

圖3為CdS-NH3的紫外可見吸收光譜和熒光光譜．紫外可見吸收光譜在480 nm處吸收峰較寬, 說明樣品中納米粒子的粒徑不是很均勻．在380 nm激發(fā)波長下, 熒光光譜在544 nm處出現(xiàn)一個較大的峰, 表明合成的納米顆粒結晶度好,表面缺陷少[11]．

2.2 修飾電極的電化學表征

電化學阻抗譜可用于表征免疫傳感器的制備過程．圖4(A)給出了不同電極在含0.1 mol·L-1KCl的5.0 mmol·L-1[Fe(CN)6]3-/4-溶液中的阻抗圖譜．與裸電極相比(曲線a), CdS-NH3/GCE的電化學反應阻抗(Ret)明顯增加(曲線b), 這是由于CdS-NH3納米粒子阻礙了電子向電極表面的轉移．PEDV-2C11抗體和BSA分別固定在修飾電極表面后,Ret進一步增加(曲線c,d), 其原因是抗體和BSA作為非導電生物分子進一步阻礙了電子轉移．最后, PEDV與電極表面的PEDV-2C11發(fā)生免疫反應后,Ret明顯增加(曲線e)．圖4(B)顯示了不同修飾電極的發(fā)光強度. 結果表明, CdS-NH3的ECL發(fā)光強度也隨著層層修飾后發(fā)光強度逐漸降低．綜上所述, 采用CdS-NH3NCs和固定方法可成功制備電化學發(fā)光免疫傳感器．

a. GCE; b. CdS-NH3/GCE; c. PEDV-2C11/GA/CdS-NH3/GCE; d. BSA/PEDV-2C11/GA/CdS-NH3/GCE; e. PEDV/BSA/PEDV-2C11/GA/CdS-NH3/GCE圖4 (A)不同修飾電極的阻抗交流圖譜; (B) 不同修飾電極的發(fā)光圖譜Fig.4 (A) Nyquist plot of the A.C. impendence of immune process; (B) ECL intensity of immune process at different modified electrodes

2.3 條件優(yōu)化

圖5(A)為不同濃度Na2S2O8對CdS-NH3/GCE的發(fā)光強度的影響．結果顯示, 當Na2S2O8的濃度達到0.10 mol·L-1時, ECL強度基本穩(wěn)定, 故本文選擇Na2S2O8濃度為0.12 mol·L-1．

圖5 (A) 介質濃度, (B) CdS-NH3滴涂量, (C) 抗體濃度, (D) pH值, (E) 孵育時間對免疫傳感器發(fā)光強度的影響Fig.5 The effect of (A) medium concentration, (B) dropping amount of CdS-NH3, (C) concentration of antibody, (D) pH and (E) incubation time on the ECL intensity of the developed immunosensor

圖5(B)是CdS-NH3滴涂量對電化學發(fā)光強度的影響．當?shù)瓮康腃dS-NH3溶液體積超過8 μL時, ECL強度基本穩(wěn)定, 故選擇CdS-NH3的滴涂量為10 μL．

圖5(C)是抗體濃度對電化學發(fā)光強度的影響．由圖5(C)可以看出,當抗體濃度到達0.10 g·L-1時, ECL降低的強度基本保持不變, 這是由于免疫傳感器表面上用于抗原反應的活性位點的限制使其基本飽和, 故選擇抗體的濃度為0.20 g·L-1．

圖5(D)給出了在825 TCID50·mL-1的PEDV濃度下, ECL免疫傳感器浸入含0.12 mol·L-1Na2S2O8不同pH值的PBS溶液中電化學發(fā)光強度的變化．當pH為7.4時發(fā)光強度變化達到最大, 因此選擇介質的pH 值為7.4．

為了選擇最佳的免疫反應時間, 將修飾電極孵育于825 TCID50·mL-1PEDV中, 觀察ECL強度變化, 結果如圖5(E)所示．由圖5(E)可以看出, 當孵育時間達到100 min時, ECL強度的降低基本保持不變, 因此選擇120 min作為免疫反應的最佳孵育時間．

2.4 線性范圍和檢測限

在最佳檢測條件下記錄了不同PEDV濃度下的ECL響應(見圖6(A))．電化學發(fā)光強度的變化與PEDV濃度在1.65～1.65×105TCID50·mL-1范圍內(nèi)呈線性關系(見圖6(B)), 線性回歸方程為ΔI=1 070.2lg(c/(TCID50·mL-1))-51.39, 其中ΔI為空白溶液的ECL強度(I0)與特定濃度PEDV下ECL強度(I1)的差值, 檢測限(LOD)為1.65 TCID50·mL-1．與先前文獻報道的分析方法相比[13],該方法具有更低的檢測限．

曲線a～i cPEDV/(TCID50·mL-1): 1.65, 3.30, 16.5, 33.0, 1.65×102, 8.25×102, 1.65×103, 1.65×104,1.65×105圖6 (A) 不同濃度的PEDV的電化學發(fā)光強度曲線; (B) 發(fā)光強度與濃度的線性關系Fig.6 (A) Electrochemiluminescence intensity of the immunosensor incubated with different concentrations of PEDV,(B) calibration curve

2.5 電極的重復性、穩(wěn)定性和選擇性研究

圖7 在1.65×103 TCID50·mL-1濃度下連續(xù)掃描的電化學發(fā)光強度Fig.7 Continuous cyclic potential scans of the proposed immunosensor at cPEDV=1.65×103 TCID50·mL-1

圖7給出了在最佳實驗條件下含1.65×103TCID50·mL-1和0.1 mol·L-1Na2S2O8的0.1 mol·L-1PBS(pH=7.4)中連續(xù)掃描15個循環(huán)的發(fā)光響應,可見免疫傳感器的發(fā)光強度基本穩(wěn)定．發(fā)光強度的相對標準偏差(RSD)為5.2%;采用相同的方法制備5支免疫傳感器,其發(fā)光強度的RSD為5.2%,表明該傳感器具有良好的重復性和重現(xiàn)性．將免疫傳感器在4 ℃下放置2周后, 發(fā)光強度為初始值的91%, 說明該傳感器具有良好的穩(wěn)定性．

為了評價ECL免疫傳感器的特異性,將其與一些可能的干擾蛋白(如沙門氏菌,空腸彎曲桿菌和大腸桿菌)共同孵育,檢測其發(fā)光強度,并與僅含PEDV的發(fā)光強度進行比較,得到干擾蛋白引起的發(fā)光強度變化小于5%, 說明該免疫傳感器具有良好的選擇性．

3 實際樣品測定

表1 樣品中PEDV回收率的測定

按照1.6的方法對樣品進行前處理后, 在最佳實驗條件下,對樣品溶液重復進行6次測定,結果如表1所示．從表1可以看出,該方法的回收率在93.33%至101.21%之間,相對標準偏差(RSD)小于2.0%, 表明該方法具有良好的準確性,有望應用于實際樣品中PEDV的檢測．