邢 新，司元純，陸依凡，許 瑞，陳喬爾，鄒多宏

與其他的成像方式，如CT、X線等相比，磁共振成像(magnetic resonance imaging,MRI)具有非電離、出色的空間及解剖分辨率等優(yōu)勢(shì)[1]。然而MRI卻受到目標(biāo)靈敏度低的限制。那么開發(fā)多種模式的納米探針就成為了解決這一問題的一種策略[2]。目前，癌癥仍然是當(dāng)今死亡率最高的疾病之一[3]。MRI被廣泛地應(yīng)用于腫瘤的診治，目前幾乎一半的MRI需要造影劑的參與[4]，將納米探針與MRI技術(shù)結(jié)合，可以精確地定位腫瘤的部位[5]；釓的復(fù)合物一直以來被廣泛的應(yīng)用于此，然而釓離子具有潛在的毒性。因此，研究者們不斷地去開發(fā)低毒性、高靈敏度的基于其他順磁性金屬的納米探針[6]。該研究合成了一種錳基氧化物納米粒子(manganese oxide nanoparticles，MnO-NPs)，它對(duì)pH響應(yīng)，具有較高比表面積和低生物毒性，可以被開發(fā)成為新一代磁共振納米造影劑。

1 材料與方法

1.1 試劑與材料聚丙烯酸(poly acrylic acid，PAA)、谷胱甘肽(glutathione，GSH)購(gòu)買自北京索萊寶科技有限公司；一水硫酸錳(manganese sulfate monohydrate，MnSO4·H2O)購(gòu)買自上海阿拉丁公司；細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒(cell counting kit-8，CCK-8)購(gòu)買自日本同仁化學(xué)研究所。

1.2 儀器及其使用使用透射電子顯微鏡(JEM-2100F，日本JEOL公司)觀察樣品的形態(tài)；使用粒度分析儀(NanoBrook 90plus Zeta，美國(guó)Brookhaven公司)檢測(cè)樣品的粒徑大??；孔隙率分儀( TristarⅡ，3020M，美國(guó)Micromeritics公司) 測(cè)量樣品的氮吸附-脫附等溫曲線;X射線衍射儀(XRD，TTR-Ⅲ，日本Rigaku公司)分析晶體結(jié)構(gòu)；熱重分析儀(TGA，Q5000IR，美國(guó)TA公司)對(duì)材料進(jìn)行熱重分析；X射線光電子能譜分析儀(XPS，ESCALAB 250，美國(guó)Thermo公司)分析材料元素組成；使用電感耦合等離子發(fā)射光譜(ICP-OES，ICAP7200，美國(guó)Thermo公司)檢測(cè)錳離子的釋放；使用傅里葉變換紅外光譜儀(FTIR，iS10，美國(guó)Nicolet公司)檢測(cè)有機(jī)共價(jià)鍵；使用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀(MQX200，美國(guó)Bio-tek公司)檢測(cè)吸光度。

1.3 材料合成取0.5 g NaOH、0.1 g的GSH、1.0 g的PAA置于100 ml錐形瓶中，向其中加入10 ml無水乙醇和40 ml的超純水，在N2的保護(hù)下60 ℃反應(yīng)20 min；隨后向其中加入1 ml 100 mg/ml的 MnSO4,繼續(xù)反應(yīng)5 h，反應(yīng)結(jié)束后以12 000 r/min的轉(zhuǎn)速離心5 min，收集離心產(chǎn)物，使用超純水洗滌3～5次后獲取氧化錳納米顆粒樣品。

1.4 MnO-NPs的表征取適量MnO-NPs分散于超純水中，使用超聲波震蕩形成懸浮液，將懸液滴于附有支持膜的銅網(wǎng)上，待液體揮發(fā)后將其置于透射電子顯微鏡下以觀察樣品的大小、形態(tài)、表面特性等。采用XRD、XPS、TGA、FTIR分別檢測(cè)該樣品。

1.5 弛豫效能檢測(cè)取0.5 g瓊脂糖粉末置于100 ml錐形瓶中，磁力攪拌下加熱到100 ℃，澄清透明后，降溫到80 ℃待用。取等量且適量納米材料，分別置于pH為7.4、5.5、4.5的PBS緩沖液中，37 ℃下震蕩24 h，分別用相應(yīng)的PBS緩沖液稀釋到相等的合適濃度，分別取100、50、25、12.5、6.25、0 μl溶液置于200 μl離心管中，分別加入100、150、175、187.5、193.75、200 μl瓊脂糖凝膠。用移液槍吹打混勻后，置于4 ℃冰箱冷藏凝固，使用7.0 T磁共振掃描儀，檢測(cè)不同離心管的T1弛豫時(shí)間。使用ICP-OES測(cè)定Mn2+濃度。通過縱向馳豫值的倒數(shù)/Mn2+濃度的線性擬合，來計(jì)算縱向弛豫率。

1.6 Mn2+釋放研究取9只50 ml離心管，分編號(hào)為1～9，每組3只離心管，分成3組，分別加入39.5 ml pH為7.4、5.5和4.5的PBS緩沖液。取0.5 ml濃度為10 mg/ml納米材料分別分散于離心管中，置于37 ℃恒溫震蕩箱中，在5、15、30、60、90、180、360、720、1 440 min時(shí)各取1 ml液體分別置于9個(gè)2 ml離心管中，轉(zhuǎn)速為15 000 r/min，離心5 min，吸取0.5 ml上清液于5 ml離心管中，加入1.5 ml超純水和1 ml濃硝酸，震蕩搖勻后，靜置6 h，過0.45 μm的濾膜，濾液注入2 ml離心管中，靜置12 h后，使用ICP-OES檢測(cè)Mn2+的含量。

1.7 氧化錳的生物相容性研究將人牙齦成纖維細(xì)胞(human gingival fibroblasts，HGF)按照1×104個(gè)/孔接種于96孔板中，使用含有10%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基培養(yǎng)。接種24 h后，使用PBS緩沖液洗滌細(xì)胞2遍，向其中加入不同濃度的MnO-NPs，共培養(yǎng)24、48 h之后使用CCK-8試劑盒檢測(cè)。

2 結(jié)果

2.1 MnO-NPs結(jié)構(gòu)的表征透射電子顯微鏡觀察可見制得的氧化錳呈片形花瓣?duì)睿叨容^為均一，合成的產(chǎn)物具有晶體結(jié)構(gòu)，直徑約為5 nm；粒徑分布比較窄，其直徑約為100 nm(圖1A)，其表面可見有一定數(shù)量的孔道(圖1C、D)。 該氧化錳顆粒的比表面積達(dá)到了231.01 cm3/g(圖2A)，在孔直徑為1.6和12 nm時(shí)孔容積最大(圖2B)。粒度分析儀結(jié)果顯示，該納米顆粒具有較窄的粒徑，其水合粒徑約為400 nm(圖3A)。X射線衍射儀結(jié)果顯示所獲取的納米顆粒與Mn3O4的PDF卡片吻合，由此可知所獲取的氧化錳為Mn3O4(圖3B)。傅里葉變換紅外光譜儀結(jié)果顯示該納米粒子在波數(shù)為521.6和629.2 cm-1處具有明顯的吸收峰，這是分屬八面體Mn-O伸縮振動(dòng)和四面體Mn-O伸縮振動(dòng)(圖3C)。熱重分析從室溫(20 ℃)開始,以20 ℃/min的速度升溫,直至820 ℃,其結(jié)果顯示合成的氧化錳重量在20～150 ℃之間損失了3.33%,這部分主要是由于水分子的損失,在150～400 ℃之間損失了6.38%,這部分是由于有機(jī)物GSH以及PAA的損失。400 ℃ 以后重量趨于平穩(wěn)，說明此時(shí)有機(jī)物已被完全去除(圖3D)。

X射線光電子能譜分析儀的結(jié)果如圖4所示，采用C1s結(jié)合能作為內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)，結(jié)果顯示該納米粒子中含有錳和氧元素。

圖1 氧化錳納米顆粒在不同倍數(shù)下的透射電鏡圖 A：×8 000；B：×40 000；C：×160 000；D：×160 000

2.2 不同pH下氧化錳納米顆粒的弛豫率在場(chǎng)強(qiáng)為7.0 T的磁共振掃描器中，測(cè)得在pH為7.4時(shí)，其縱向弛豫率為2.3 mmol-1·s-1，當(dāng)pH為5.5時(shí)，其縱向弛豫率為6.3 mmol-1·s-1，而當(dāng)pH為4.5時(shí)，則達(dá)到了13.0 mmol-1·s-1。氧化錳納米顆粒的縱向弛豫率與pH有著明顯的關(guān)聯(lián)，即pH越低，其縱向弛豫率越高(圖5A)。

2.3 Mn2+釋放研究在pH為7.4的PBS溶液中，Mn2+幾乎不泄露，此時(shí)的氧化錳納米顆粒是相對(duì)穩(wěn)定的，當(dāng)pH偏向酸性，在pH為5.5和4.5時(shí)，Mn2+釋放速度加快，但是其24 h釋放量也不足0.5%，說明該材料非常穩(wěn)定(圖5B)。

圖2 孔隙率分析儀檢測(cè) A：MnO-NPs的比表面積；B：MnO-NPs的孔直徑分布

圖3 MnO-NPs的表征

2.4 氧化錳納米顆粒的細(xì)胞生物相容性研究為了驗(yàn)證所合成的氧化錳納米顆粒是否具有細(xì)胞毒性，采用了CCK-8來對(duì)其進(jìn)行檢測(cè)。使用不同濃度的氧化錳納米顆粒與HGF共同培養(yǎng)24、48 h，與對(duì)照組(氧化錳濃度為0 μg/ml)進(jìn)行比較，所得結(jié)果進(jìn)行單因素方差分析。結(jié)果可見，共同培養(yǎng)24 h情況下，與對(duì)照組相進(jìn)行單因素比較，所有組別存活率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=0.924，P>0.05)；在共同培養(yǎng)48 h后，與對(duì)照組進(jìn)行單因素比較，當(dāng)濃度為16 μg/ml時(shí)，其存活率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.038)，但此時(shí)細(xì)胞存活率高于對(duì)照組細(xì)胞存活率，與對(duì)照組比較，其他濃度組結(jié)果差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(F=2.496,P>0.05)；見表1、圖6。

3 討論

分子成像領(lǐng)域最熱點(diǎn)的話題就是要求非電離、非侵入性以及能夠?qū)崟r(shí)監(jiān)測(cè)細(xì)胞中所發(fā)生的分子事件[7]。而MRI則恰好具備有這些優(yōu)點(diǎn)，因而它在臨床中擁有著非常廣泛的應(yīng)用[8]。而MRI之所以可以成功，很大程度上是由于造影劑的使用，造影劑通過加速組織環(huán)境中質(zhì)子的弛豫率從而增強(qiáng)MRI圖像中的信號(hào)[9]。

圖4 氧化錳顆粒的XPS結(jié)果

圖5 MnO-NPs的造影效能和穩(wěn)定性檢測(cè)

表1 HGF與MnO-NPs共培養(yǎng)24 h和48 h細(xì)胞存活率

圖6 HGF與MnO-NPs共培養(yǎng)24 h和48 h細(xì)胞存活率

錳基化合物應(yīng)用于造影劑已有了非常多的研究，例如二乙烯三胺五乙酸錳，錳的氧化物，Mn(Ⅱ)/Mn(Ⅲ)的雜化結(jié)構(gòu)等[6,10-11]。通常情況下可以將錳基造影劑分為兩大類，即錳的氧化物以及Mn2+螯合物，但是由于Mn2+螯合物血液循環(huán)時(shí)間短并且容易在腦部堆積從而產(chǎn)生毒性，因此研究者們更多的將精力放在了錳氧化物上[12]。本研究所合成的納米粒子結(jié)合XPS和XRD的結(jié)果可證實(shí)為Mn3O4，其中錳的價(jià)態(tài)分別為二價(jià)和三價(jià)。低價(jià)態(tài)的錳離子相比較于Mn4+來說具有更高的造影效能，尤其是Mn2+。這是由于Mn2+的3D軌道上排列有5個(gè)未成對(duì)的電子,這可以產(chǎn)生較大的磁矩，并引起附近原子核的磁弛豫[13]，因此成分為Mn3O4的MnO-NPs理論上就擁有更高的造影效能。PAA具有非常良好的生物相容性以及親水性[14]；可以將它用作為pH響應(yīng)聚合物來修飾納米顆粒。腫瘤微環(huán)境具有微酸的特點(diǎn)，本研究使用了pH響應(yīng)聚合物PAA作為MnO-NPs的修飾劑，因此該納米粒子可能會(huì)具有pH敏感性，從而可以對(duì)腫瘤微環(huán)境響應(yīng)，為了驗(yàn)證其是否具有這一性能，在不同的pH條件下測(cè)定了它的弛豫效能。當(dāng)pH為4.5時(shí)，該納米顆粒弛豫效能最高，其弛豫率達(dá)到了13.0 mmol-1·s-1，顯著地高于pH為5.5及7.4時(shí)的弛豫率，并且酸性條件下可見Mn2+釋放速率更快，因此MnO-NPs可以對(duì)pH響應(yīng)。而另一方面，腫瘤的微環(huán)境除了微酸以外，還有著高濃度的GSH，有研究表明，高含量的GSH可以破壞Mn-O鍵，并且弱酸的環(huán)境可以促進(jìn)Mn2+的釋放[15]，從而該納米造影劑有望在腫瘤部位具有更高的造影效能。當(dāng)納米造影劑注射入血管內(nèi)之后其穩(wěn)定性和生物毒性就成為了一個(gè)不可忽視的問題。與HGF共培養(yǎng)后，MnO-NPs并未對(duì)HGF產(chǎn)生明顯的生物毒性；同時(shí)這一氧化錳納米顆粒即便在pH達(dá)到4.5時(shí)，其24 h Mn2+釋放量也不足0.5%，這說明該材料穩(wěn)定性和安全性較好，具有應(yīng)用于人體的潛能。結(jié)合以上幾點(diǎn)，本研究所合成的這一新型氧化錳納米材料，有望作為一種酸敏造影劑應(yīng)用于腫瘤的MRI檢測(cè)中。

具有靶向腫瘤藥物輸送功能的納米平臺(tái)可以增強(qiáng)抗癌藥的特異性，并且改善腫瘤部位的藥物濃度。本研究中，盡管未將這一新型氧化錳納米顆粒與抗癌藥負(fù)載，但是通過透射電子顯微鏡觀察可以發(fā)現(xiàn)其表面具有一定的孔道，同時(shí)孔隙率分析儀的結(jié)果也印證了孔道的存在，并且其水合粒徑約為200 nm，比較適合作為納米給藥平臺(tái)，將來也可以將其改良后與抗癌藥負(fù)載應(yīng)用于此，從而成為一種具有診斷及給藥作用的全新納米探針。

在這項(xiàng)研究中，首先提出了一種新型花瓣?duì)钛趸i納米顆粒。通過透射電子顯微鏡直徑約為100 nm，隨后的X射線衍射儀檢測(cè)確定了所合成的材料為Mn3O4；弛豫效能檢測(cè)以及錳離子釋放研究表明了它具有酸敏造影劑應(yīng)用的潛能；生物相容性檢測(cè)則說明了它幾乎無生物毒性，可以安全地應(yīng)用于人體。本研究表明該氧化錳納米粒子結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，生物相容性佳，對(duì)pH敏感，酸性條件下?lián)碛兄^高的弛豫效能。因而這一納米顆粒將可能作為一種新的納米造影劑應(yīng)用于臨床，改良后甚至可以成為一個(gè)診療一體化的納米平臺(tái)從而擁有著更加廣泛的應(yīng)用前景。