俞益桂，薛海霞，韓俊輝，尹艷艷

帕金森病(parkinson's disease，PD)是世界第二大神經(jīng)退行性疾病，臨床癥狀主要包括靜態(tài)震顫、運動遲緩和僵硬肌肉，其病理學(xué)特征為黑質(zhì)(substantia nigra, SN)多巴胺(dopamine，DA)能神經(jīng)元的凋亡和喪失[1-2]。研究[3]表明在PD疾病中，長期或嚴(yán)重的氧化應(yīng)激可以誘導(dǎo)DA能神經(jīng)元受到損傷甚至凋亡。相關(guān)研究[4]發(fā)現(xiàn)在細(xì)胞凋亡中活性氧(reactive oxygen species,ROS)-NO通路起到了至關(guān)重要作用，說明凋亡的啟動與ROS是密不可分的。含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(cysteinyl aspartate specific proteinase, Caspase)家族的激活一般被認(rèn)為是細(xì)胞凋亡的重要一環(huán)，Caspase-9被凋亡相關(guān)因子誘導(dǎo)形成凋亡小體，而凋亡小體隨即激活凋亡執(zhí)行者Caspase-3，而Caspase-3在很多凋亡信號的傳導(dǎo)過程中發(fā)揮重要作用[5]。雞豆黃素A(biochanin A，Bioch A)是從鷹嘴豆等豆科植物中提取分離的異黃酮類有機化合物，是一種天然的植物雌激素，該課題組前期實驗表明Bioch A對DA能神經(jīng)元發(fā)揮保護(hù)作用與其對小膠質(zhì)細(xì)胞活化，炎癥相關(guān)因子分泌和氧化應(yīng)激等的抑制有關(guān)[6-7]。然而，Bioch A能否直接保護(hù)神經(jīng)元尚待進(jìn)一步研究。該文通過1-甲基-4-苯基吡啶離子 (1-methyl-4-phenylpyridinium, MPP+)損傷PC12細(xì)胞來建立體外模型，研究Bioch A能否通過抗氧化作用而發(fā)揮神經(jīng)元保護(hù)作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1細(xì)胞株 從中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院協(xié)和醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)細(xì)胞中心細(xì)胞室獲得大鼠腎上腺髓質(zhì)嗜鉻瘤細(xì)胞(pheochromocytoma cell, PC12)株。

1.1.2藥品與試劑 FBS和高糖DMEM完全培養(yǎng)基購自美國Gibco公司；MTT、Bioch A、PI、雌二醇(Estrodiol)和DMSO購自美國Sigma-Aldrich公司；青-鏈霉素混合溶液、胰蛋白酶(Trypsin)、ROS檢測試劑盒(DCFH-DA熒光探針法)、RIPA裂解液(弱)、BCA蛋白濃度測定試劑盒購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；PVDF膜購自美國Milliproe公司；超高敏的化學(xué)發(fā)光底物(Super Signal West Femto Kit)購自美國Thermo公司；HRP標(biāo)記山羊抗兔IgG(1 ∶10 000)和HRP標(biāo)記山羊抗鼠IgG(1 ∶10 000)、PBS和鼠抗β-actin抗體(1 ∶1 000)購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；Annexin V-FITC/PI細(xì)胞凋亡檢測試劑盒購自上海市貝博公司；一抗兔抗Caspase-3(1 ∶1 000)和兔抗Caspase-9(1 ∶1 000)均購自美國Bioworld公司。

1.1.3主要儀器 倒置顯微鏡CHL2FM3型購自日本OLYMPUS公司；全波長酶標(biāo)儀SpectraMax190型購自美國Molecular Device公司；恒溫培養(yǎng)箱HealForce100型購自香港力康生物科技控股有限公司；bioshine ChemiQ4600 mini化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)購自上海市歐翔科學(xué)儀器有限公司；自動細(xì)胞計數(shù)分析儀IC 1000-Countstar購自睿鈺(上海)生物科技有限公司；流式細(xì)胞儀BD FACSVerse購自美國Becton Dickinson公司；TGL-16H型高速離心機購自黑馬(珠海)醫(yī)學(xué)儀器有限公司。

1.2 方法

1.2.1PC12細(xì)胞的培養(yǎng) 將購回的PC12細(xì)胞，接種在含有10% FBS和1% 青-鏈霉素混合溶液雙抗的DMEM高糖培養(yǎng)基中于恒溫培養(yǎng)箱(5% CO2，37 ℃)進(jìn)行培養(yǎng)。細(xì)胞每隔1 d更換1次培養(yǎng)液，2～3 d傳代1次。當(dāng)細(xì)胞生長至對數(shù)生長期時，用胰酶消化細(xì)胞并進(jìn)行傳代。

1.2.2MPP+和Bioch A劑量的篩選 為了檢測MPP+和Bioch A的濃度對PC12細(xì)胞活力的影響。實驗將PC12細(xì)胞分為7組。分別為MPP+(0、0.125、0.25、0.5、1、2、4 μmol/L)與Bioch A(0、0.625、1.25、2.5、5、10、20 μmol/L)組，每組加相對應(yīng)的藥物孵育36 h。36 h后，每組加MTT 20 μl(5 mg/ml)，培育4 h。4 h后，棄去孔中培養(yǎng)液。每孔再加DMSO 200 μl，振蕩10 min以便結(jié)晶物完全溶解。用酶標(biāo)儀在490 nm波長處測量各孔的吸光度值。

1.2.3實驗分組 本實驗PC12細(xì)胞被分為6組。Control組：未加任何藥物孵育36 h；MPP+組：加入1 μmol/L的MPP+孵育36 h；MPP++Bioch A(1.25、2.5、5 μmol/L)組：選用Bioch A(1.25、2.5、5 μmol/L)預(yù)處理細(xì)胞2 h后再加入1 μmol/L的MPP+共同孵育36 h；E2組：E2(0.1 μmol/L)預(yù)處理細(xì)胞2 h后再加入1 μmol/L的MPP+共同孵育36 h。

1.2.4ROS檢測 使用DCFH-DA探針法檢測Bioch A對MPP+刺激的PC12細(xì)胞的ROS表達(dá)的影響。加藥處理2 h后，Control組除外，剩余各組加入MPP+(1 μmol/L)培養(yǎng)36 h。36 h后進(jìn)行 DCFH-DA孵育，孵育完成后，在顯微鏡下觀察并拍照，利用Image-Pro Plus 6.0軟件分析各組平均熒光強度。

1.2.5流式細(xì)胞儀測定細(xì)胞凋亡 用Annexin V-FITC/PI 凋亡檢測試劑盒雙染細(xì)胞來檢測Bioch A對MPP+刺激的PC12細(xì)胞凋亡的影響。使用胰蛋白酶消化細(xì)胞，1 000 r/min，離心5 min，棄上清液， PBS洗2次。加Binding Buffer 400 μl反復(fù)吹打使細(xì)胞混和均勻，細(xì)胞濃度高于1×105個/ml為宜，然后繼續(xù)加入 Annexin V-FITC 5 μl，搖勻，在避光條件下2～8 ℃放置15 min，后加入 PI 10 μl，搖勻，在避光2～8 ℃下靜置5 min，最后用流式細(xì)胞儀和顯微鏡檢測。

1.2.6Western blot 在培養(yǎng)好的細(xì)胞中加入含有蛋白酶抑制劑的細(xì)胞裂解液提取蛋白。BCA試劑盒定量后各組取適量樣品按樣品和蛋白上樣緩沖液4 ∶1比例進(jìn)行變性。將變性后蛋白加入進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳，轉(zhuǎn)膜，后用脫脂奶粉和TBST溶液配制成濃度為5%的封閉液室溫下封閉1 h，封閉好的膜用TBST洗3次，后將膜置于相應(yīng)的一抗中4 ℃過夜。次日，TBST洗3次后，室溫孵二抗1 h，然后再用 TBST洗3次，再按1 ∶1比例配制ECL發(fā)光液，將膜放在顯影儀中曝光，保存。用Image J軟件對蛋白條帶的灰度值進(jìn)行分析。

2 結(jié)果

2.1 MPP+和Bioch A劑量的篩選采用MTT法檢測細(xì)胞活力為后續(xù)實驗篩出合適的MPP+和Bioch A劑量。從表1結(jié)果可以看出，MPP+劑量和細(xì)胞活力呈負(fù)相關(guān)，劑量增加活力下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05或P<0.01)。大多情況下，在MPP+刺激細(xì)胞凋亡模型中，細(xì)胞活力選擇在50%～60%比較適宜，因此選取MPP+(1 μmol/L)來刺激PC12細(xì)胞凋亡。 從表2結(jié)果可以看出，PC12細(xì)胞中加入Bioch A(0.625、1.25、2.5、5、10、20 μmol/L)36 h 后，Bioch A(0.625、1.25、2.5、5 μmol/L)組與Control組比較，細(xì)胞活力無明顯變化，因此選取3個濃度梯度的Bioch A(1.25、2.5、5 μmol/L)進(jìn)行后續(xù)實驗。

表1 MPP+對PC12細(xì)胞活力的影響

表2 Bioch A對PC12細(xì)胞活力的影響

2.2 Bioch A對MPP+誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞ROS表達(dá)的影響使用DCFH-DA熒光探針，來檢測MPP+刺激的PC12細(xì)胞ROS的熒光強度，用統(tǒng)計學(xué)手段分析各組ROS的表達(dá)情況。從圖1所示結(jié)果可以看出，MPP+模型組相較于Control組，ROS熒光強度增加；Bioch A(2.5、5 μmol/L)組以及 E2 組與 MPP+

圖1 Bioch A對MPP+誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞ROS表達(dá)的影響

組比較，ROS表達(dá)量均有所減少，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。以上結(jié)果表明，Bioch A可以對MPP+刺激的PC12細(xì)胞內(nèi)ROS的表達(dá)增加有一定的抑制作用。

2.3 Bioch A對MPP+誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞凋亡的影響采用Annexin V-FITC/PI 雙染法和流式細(xì)胞儀來檢測Bioch A對MPP+誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞凋亡的影響。從如圖2所示結(jié)果可以看出，MPP+處理36 h后，MPP+組相較Control組，細(xì)胞凋亡率達(dá)到(44.43±4.95)%(P<0.01)；Bioch A(2.5、5 μmol/L)預(yù)處理組與MPP+組比較，細(xì)胞凋亡百分率降至(31.57±2.25)%和(27.53±1.75)%(P<0.05，P<0.01)；E2預(yù)處理組與MPP+組比較，細(xì)胞凋亡百分率降至(19.63±1.95)%(P<0.01)。

2.4 Bioch A對MPP+誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞cleaved Caspase-3和cleaved Caspase-9蛋白表達(dá)的影響采用Western blot法來檢測MPP+誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞中cleaved Caspase-3和cleaved Caspase-9蛋白的表達(dá)情況，結(jié)果如圖3所示，MPP+組相較于Control組， cleaved Caspase-3和cleaved Caspase-9蛋白的表達(dá)增多，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)；Bioch A(2.5、5 μmol/L)組以及E2組與MPP+組比較，cleaved Caspase-3和cleaved Caspase-9蛋白水平均有所降低(P<0.01，P<0.05)。結(jié)果表明，Bioch A對MPP+誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞的cleaved Caspase-3和cleaved Caspase-9蛋白水平增加有一定的抑制作用。

3 討論

中樞退行性疾病與神經(jīng)元功能的喪失有一定關(guān)聯(lián)，PD患者的黑質(zhì)致密部80%的DA能神經(jīng)元喪失了正常的功能。近年來，外源性的神經(jīng)毒素誘導(dǎo)形成的PD細(xì)胞模型已成為PD發(fā)病機制重要的研究手段[8]。來源于大鼠腎上腺髓質(zhì)嗜鉻細(xì)胞瘤的PC12細(xì)胞株，具有神經(jīng)細(xì)胞的特性, 且可穩(wěn)定傳代。MPP+是一種神經(jīng)毒素, 能夠引起神經(jīng)細(xì)胞的氧化應(yīng)激，因此可作為誘導(dǎo)劑為PD的發(fā)病機制研究制備細(xì)胞模型[9]。MPP+可以直接被DA轉(zhuǎn)運蛋白有選擇性的轉(zhuǎn)運至DA能神經(jīng)元，使神經(jīng)元線粒體功能出現(xiàn)障礙，進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞凋亡的出現(xiàn)[10]。本實驗采用MPP+刺激PC12細(xì)胞凋亡建立體外PD模型，觀察 Bioch A 對MPP+刺激的PC12細(xì)胞凋亡的作用。不同濃度MPP+處理細(xì)胞，結(jié)果顯示1 μmol/L MPP+處理細(xì)胞能引起大約50%細(xì)胞凋亡,因此本實驗選用1 μmol/L MPP+用于后續(xù)造模。

圖2 細(xì)胞流式檢測Bioch A對MPP+誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞凋亡的影響

圖3 Western Blot檢測cleaved Caspase-3和cleaved Caspase-9蛋白的表達(dá)

氧化應(yīng)激與許多人類變性疾病有關(guān), 如癌癥、動脈粥樣硬化以及神經(jīng)退行性病變等,近年的研究[11]表明氧化應(yīng)激與PD的發(fā)生發(fā)展密不可分。ROS增加是氧化應(yīng)激的主要標(biāo)志，在正常的機體或細(xì)胞內(nèi)，ROS 總是與內(nèi)在的抗氧化系統(tǒng)處于動態(tài)平衡中。當(dāng)受到外界刺激時，平衡被破壞，從而產(chǎn)生氧化應(yīng)激[12]。在本實驗中，Bioch A預(yù)處理能夠有效抑制MPP+組中的ROS的升高。此結(jié)果提示Bioch A可以減輕PC12細(xì)胞中MPP+誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激。此外，由于ROS作為凋亡啟動的一個重要條件，所以Bioch A也可能調(diào)節(jié)了細(xì)胞的凋亡過程。

Caspase家族的活化被認(rèn)為是凋亡的直接效應(yīng)物，因為其在凋亡進(jìn)程中起到了不可忽視的作用。ROS等因素刺激線粒體，致使線粒體損傷和膜電位的下降，細(xì)胞色素C從受損的線粒體中釋放，細(xì)胞色素C和Caspase-9酶原共同作用形成凋亡復(fù)合體，其釋放并使Caspase-9活化，隨即活化的Caspase-9進(jìn)一步刺激Caspase-3，降解底物導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[13]。Caspase-3是細(xì)胞凋亡的常見途徑和執(zhí)行者，其活化表明細(xì)胞凋亡進(jìn)入了難以逆轉(zhuǎn)的階段，它的表達(dá)很大程度上能反映出細(xì)胞凋亡情況[14-15]。一般情況下，Caspase-3在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)處于無活性狀態(tài)，但當(dāng)其被外界刺激所影響時便可觸發(fā)自我凋亡程序, 通過關(guān)鍵蛋白酶的激活而加快細(xì)胞凋亡的進(jìn)程。根據(jù)Western blot結(jié)果可以看出，Bioch A預(yù)處理能夠抑制MPP+刺激的PC12細(xì)胞Caspase-3和Caspase-9的活化。表明Bioch A對PC12細(xì)胞的凋亡起到一定程度的抑制作用。