張馳, 徐盟龍, 袁一心, 王朋濤, 靳曉慧, 魏戰(zhàn)勇,

(1.河南農(nóng)業(yè)大學(xué)牧醫(yī)工程學(xué)院，河南 鄭州 450002;2.河南省動(dòng)物性食品安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河南 鄭州 450002)

豬細(xì)小病毒(Porcine parvovirus, PPV)屬于細(xì)小病毒科，細(xì)小病毒屬，呈圓形或六角形，是一種無(wú)囊膜病毒[1]。CARWRIGHT等[2]在流產(chǎn)仔豬中首次分離到該病毒。目前，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)7種PPV基因型。該病毒在中國(guó)豬群中存在廣泛，通過(guò)對(duì)PPV感染的統(tǒng)計(jì)分析表明，國(guó)內(nèi)不同地區(qū)均有PPV感染且感染率較高，西南、華北和華南地區(qū)的陽(yáng)性率明顯高于其他地區(qū)。PPV主要引起母豬繁殖障礙，引起流產(chǎn)，死胎，木乃伊胎，胎兒畸形和弱胎(SMEDI)[3]。研究發(fā)現(xiàn)，PPV的組織嗜性不斷變化并趨向于廣泛，而且與其他病原體混合感染增多，PPV4和PPV5可以侵染豬的肺臟，PPV6引起胎兒流產(chǎn)，PPV7不僅可以引起腸道病變，還表現(xiàn)出更廣泛的組織嗜性[4]。在PCV2陽(yáng)性豬群和腹瀉豬群中均存在PPV的混合感染[5-6]。PPV基因組為5 000 bp左右，全基因組存在2個(gè)主要開(kāi)放閱讀框，位于3′端的ORF編碼3個(gè)結(jié)構(gòu)蛋白(又稱(chēng)衣殼蛋白)VP1、VP2和 VP3，5′端的ORF編碼3個(gè)非結(jié)構(gòu)蛋白(又稱(chēng)調(diào)節(jié)蛋白)NS1、NS2和 NS3[7]。NS1蛋白是其主要的非結(jié)構(gòu)蛋白，其是一種磷酸化蛋白，具有多功能調(diào)節(jié)作用，主要在病毒的復(fù)制期產(chǎn)生，調(diào)控PPV基因組的復(fù)制。該蛋白存在一系列結(jié)構(gòu)域。其中，2～275aa是DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域，372～527aa是SF3解旋酶結(jié)構(gòu)域，通過(guò)與小鼠細(xì)小病毒NS1蛋白的比較發(fā)現(xiàn)在PPV NS1蛋白N端存在內(nèi)切酶區(qū)域并可能參與NS1蛋白與復(fù)制起點(diǎn)的結(jié)合，C端可能包含一個(gè)反式激活結(jié)構(gòu)域，近年來(lái)的研究表明PPV 和PPV NS1蛋白能誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡或通過(guò)TLRs介導(dǎo)激活宿主細(xì)胞的天然免疫應(yīng)答[8-10]。

蛋白質(zhì)在細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)之間的選擇性轉(zhuǎn)移為基因表達(dá)和進(jìn)行其他細(xì)胞過(guò)程的調(diào)控提供強(qiáng)有力的機(jī)制[11]，蛋白質(zhì)導(dǎo)入真核細(xì)胞的調(diào)控過(guò)程是由蛋白質(zhì)導(dǎo)入受體識(shí)別的特異性核定位信號(hào)(NLSs)介導(dǎo)的[12]。核定位信號(hào)分為經(jīng)典核定位信號(hào)和非經(jīng)典核定位信號(hào)2種類(lèi)型，經(jīng)典核定位信號(hào)是由連續(xù)的富含堿性氨基酸(K/R)的短肽構(gòu)成；非經(jīng)典核定位信號(hào)是由不連續(xù)堿性氨基酸組成的非經(jīng)典N(xiāo)LS，該NLS通過(guò)空間折疊或者經(jīng)過(guò)蛋白質(zhì)修飾形成或暴露并與核定位信號(hào)受體結(jié)合轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞核[13-15]。

一些病毒蛋白是否進(jìn)入細(xì)胞核對(duì)于調(diào)控病毒復(fù)制和產(chǎn)生細(xì)胞毒性起重要作用。細(xì)小病毒科阿留申水貂病毒(ADV)、人細(xì)小病毒(B19)、鼠細(xì)小病毒(MVM)的非結(jié)構(gòu)蛋白NS1作為一種轉(zhuǎn)錄調(diào)控蛋白均主要存在于感染細(xì)胞核內(nèi)并參與病毒的復(fù)制、基因轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)以及核衣殼組裝[16-17]。其中，ADV NS1通過(guò)非經(jīng)典N(xiāo)LS進(jìn)入細(xì)胞核，NS1蛋白上的227和285位的非堿性氨基酸天冬氨酸突變?yōu)楣劝彼岷?，NS1蛋白就不能入核，病毒復(fù)制減弱，一些觀點(diǎn)認(rèn)為酶切后的NS1蛋白暴露出B19 NS1核定位信號(hào)，使NS1蛋白能夠轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞核；B19 NS1通過(guò)經(jīng)典核定位信號(hào)進(jìn)入細(xì)胞核；MVM NS1通過(guò)214～216aa 3個(gè)連續(xù)的賴(lài)氨酸殘基(KKK)介導(dǎo)NS1進(jìn)入細(xì)胞核[18]。本研究中使用2種不同算法的核定位信號(hào)預(yù)測(cè)軟件(Predict NLS、PSORT Ⅱ)預(yù)測(cè)PPV NS1的核定位信號(hào)，使用PSORT Ⅱ預(yù)測(cè)出與MVM NS1相似位置的215～218位存在4個(gè)連續(xù)的堿性氨基酸(KKRK)，但Predict NLS未發(fā)現(xiàn)其存在核定位信號(hào)，而豬細(xì)小病毒非結(jié)構(gòu)蛋白NS1與上述細(xì)小病毒相似作為轉(zhuǎn)錄調(diào)控蛋白同樣存在于感染細(xì)胞核內(nèi)，而介導(dǎo)PPV NS1進(jìn)入細(xì)胞核發(fā)揮其功能的核定位序列目前仍不清楚，為了探討PPV NS1入核機(jī)制和NS1的核定位序列，使用重疊PCR技術(shù)將PPV NS1不同位置發(fā)生氨基酸缺失，運(yùn)用免疫熒光和蛋白免疫印跡確定不同的NS1缺失突變體在細(xì)胞內(nèi)的核定位情況，找到PPV NS1核定位序列存在的位置，為揭示PPV在宿主細(xì)胞內(nèi)復(fù)制、NS1蛋白調(diào)控宿主與病毒自身基因轉(zhuǎn)錄的機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 質(zhì)粒、細(xì)胞、病毒 帶有HA標(biāo)簽蛋白的pCAGGS-HA質(zhì)粒購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司；PK-15細(xì)胞由河南省動(dòng)物性食品安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室傳代保存；豬細(xì)小病毒李氏毒株[19]，由河南省動(dòng)物性食品安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室傳代保存。

1.1.2 主要試劑 PCR高保真聚合酶購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司；限制性?xún)?nèi)切酶，T4連接酶購(gòu)自New England Biolabs公司；胎牛血清、DMEM培養(yǎng)基，opti-MEM減血清培養(yǎng)基均購(gòu)自美國(guó)Gibco公司，Lipofectamine 2 000轉(zhuǎn)染試劑購(gòu)自Invitrogen公司；蛋白裂解試劑和亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)胞漿和胞核蛋白提取試劑盒購(gòu)自武漢BOSTER生物工程有限公司；鼠源HA標(biāo)簽抗體、鼠源β-actin內(nèi)參抗體、兔源核內(nèi)參TBP抗體、HRP標(biāo)記羊抗鼠IgG、HRP標(biāo)記羊抗兔IgG、FITC標(biāo)記猴抗鼠IgG均購(gòu)自南京金斯瑞生物科技有限公司。

1.1.3 主要儀器 低溫高速離心機(jī)5430R購(gòu)自Eppendorf公司；PCR擴(kuò)增儀Veriti購(gòu)自美國(guó)應(yīng)用生物系統(tǒng)公司；電泳儀DYY-6C購(gòu)自北京六一儀器廠(chǎng)；凝膠成像分析系統(tǒng)購(gòu)自美國(guó)ProteinSimple公司；半干轉(zhuǎn)印槽Rrans-BlotSD購(gòu)自美國(guó)BIO-RAD公司；倒置熒光顯微鏡IX73購(gòu)自日本OLYMPUS公司。

1.2 方法

1.2.1 豬細(xì)小病毒非結(jié)構(gòu)蛋白NS1核定位信號(hào)分析 將PPV NS1氨基酸序列提交至Predict NLS(https://rostlab.org/owiki/index. php/PredictNLS)和PSORT Ⅱ(https://psort.hgc.jp/form.html)預(yù)測(cè)網(wǎng)站，并分析預(yù)測(cè)結(jié)果。

1.2.2 豬細(xì)小病毒非結(jié)構(gòu)蛋白NS1 CDS區(qū)基因和NS165-133aaDel、NS1207-267aaDel的擴(kuò)增 根據(jù)GenBank上傳的豬細(xì)小病毒非結(jié)構(gòu)蛋白NS1的序列使用primer5.0軟件分別設(shè)計(jì)NS1 CDS區(qū)引物和NS165-133aaDel、NS1207-267aaDel重疊PCR引物，NS1 CDS區(qū)引物序列為：F1；R1；NS165-133aaDel重疊PCR引物為：F1；F2；R1；R2；NS1207-267aaDel重疊PCR引物為：F1；F3；R3；R1，見(jiàn)表1。以河南省動(dòng)物性食品安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存的豬細(xì)小病毒提取DNA為模板，使用高保真酶擴(kuò)增NS1 CDS區(qū)基因序列，PCR擴(kuò)增程序?yàn)椋?8 ℃，5 min：98 ℃，20 s；55 ℃，45 s；68 ℃，2 min 10 s，35個(gè)循環(huán)，68 ℃，10 min；4 ℃保存。PCR擴(kuò)增NS1 CDS區(qū)；使用重疊延伸PCR分別擴(kuò)增NS165-133aaDel和NS1207-267aaDel序列：(1)分別使用引物F1、R2和F2、R1擴(kuò)增豬細(xì)小病毒非結(jié)構(gòu)蛋白L1、L2片段，使用引物F1、R3和F3、R1擴(kuò)增豬細(xì)小病毒非結(jié)構(gòu)蛋白L3、L4片段；(2)以L(fǎng)1、L2和L3、L4膠回收產(chǎn)物為模板使用引物F1、R1擴(kuò)增出NS165-133aaDel(L5)和NS1207-267aaDel(L6)序列，擴(kuò)增程序與上述程序相同。

1.2.3 pCAGGS-HA-NS1和pCAGGS-HA-NS165-133aaDel、pCAGGS-HA-NS1207-267aaDel重組質(zhì)粒的構(gòu)建 使用限制性?xún)?nèi)切酶ECoRI、XhoI酶切pCAGGS-HA載體、NS1、NS165-133aaDel和NS1207-267aaDelPCR回收產(chǎn)物37 ℃，3.5 h，1%瓊脂糖凝膠電泳后，膠回收雙酶切后的PCR產(chǎn)物及載體，使用T4連接酶16 ℃連接過(guò)夜后轉(zhuǎn)化入DH-5α感受態(tài)細(xì)胞，挑取單個(gè)菌落，使用pCAGGS-HA通用引物進(jìn)行菌液PCR擴(kuò)增，篩選出陽(yáng)性菌落并擴(kuò)大培養(yǎng)，送測(cè)序公司進(jìn)行測(cè)序，將測(cè)序正確的菌液提取質(zhì)粒使用限制性?xún)?nèi)切酶ECoRI、XhoI進(jìn)行雙酶切驗(yàn)證。

1.2.4 重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染PK-15細(xì)胞和Western-blot檢測(cè) 使用含10%胎牛血清的培養(yǎng)基培養(yǎng)PK-15細(xì)胞，細(xì)胞長(zhǎng)滿(mǎn)后使用0.25 %胰酶消化，用顯微鏡觀察待細(xì)胞消化為單個(gè)細(xì)胞時(shí)，將胰酶棄去，加入含10 %胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，使用細(xì)胞吹管將細(xì)胞進(jìn)一步吹散后鋪于六孔板中，使細(xì)胞在18～24 h后長(zhǎng)至80 %時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)染；配制轉(zhuǎn)染液A：50 μL 無(wú)血清的opti-MEM加入1 μg重組質(zhì)粒輕柔混勻，靜置5 min；轉(zhuǎn)染液B：50 μL 無(wú)血清的opti-MEM加入5 μL Lipofectamine 2 000輕柔混勻，靜置5 min，將A液緩慢加入B液中輕柔混勻，靜置25 min。六孔板中的PK-15細(xì)胞用高壓過(guò)的D-Hank’s洗3次后更換為無(wú)血清的opti-MEM培養(yǎng)基，將靜置后的A、B轉(zhuǎn)染混合液加入細(xì)胞孔中，轉(zhuǎn)染6 h后細(xì)胞培養(yǎng)液更換為含2 %胎牛血清的培養(yǎng)基。轉(zhuǎn)染36 h后收取細(xì)胞，4 ℃ 1 000 r·min-1離心10 min，棄上清液，細(xì)胞沉淀使用含1 % PMSF的RIPA細(xì)胞裂解液冰上裂解細(xì)胞，作用30 min，4℃ 13 000 r·min-1離心10 min，取上清液即為細(xì)胞總蛋白。抽取10 μL細(xì)胞總蛋白加入2 μL 6×SDS Protein Buffer，100 ℃變性蛋白5 min，進(jìn)行SDS-PAGE(5%)電泳后轉(zhuǎn)到聚偏二氟乙烯膜(PVDF)，5 %脫脂奶封閉1 h，鼠源抗HA標(biāo)簽抗體4 ℃孵育過(guò)夜，TBST洗5次，每次10 min，1∶5 000稀釋的HRP標(biāo)記羊抗鼠IgG 37 ℃孵育1 h，TBST洗5次，每次10 min，使用ECL發(fā)光顯色液顯色。

1.2.5 間接免疫熒光檢測(cè)目的蛋白細(xì)胞定位 PK-15細(xì)胞轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒pCAGGS-HA-NS1、pCAGGS-HA-NS165-133aaDel、pCAGGS-HA-NS1207-267aaDel36 h后，使用無(wú)水乙醇固定細(xì)胞，過(guò)夜，PBS洗3次，5% BSA 37 ℃封閉2 h，PBS洗3次，鼠源HA標(biāo)簽抗體4 ℃孵育過(guò)夜，PBST洗5次，每次10 min，1∶100 FITC標(biāo)記的猴抗鼠IgG 37 ℃孵育1 h，PBST洗5次，DAPI 37 ℃染核10 min，PBST洗5次，加入抗熒光衰減封片劑，倒置熒光顯微鏡下觀察。

1.2.6 Western-blot檢測(cè)檢測(cè)目的蛋白細(xì)胞定位

PK-15細(xì)胞轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒pCAGGS-HA-NS1或pCAGGS-HA-NS165-133aaDel、pCAGGS-HA-NS1207-267aaDel36 h后收取細(xì)胞，4 ℃ 1 000 r·min-1離心10 min，棄上清液。細(xì)胞沉淀使用亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)胞漿和胞核蛋白提取試劑盒分別提取胞漿和胞核蛋白，抽取10 μL細(xì)胞總蛋白加入2 μL 6×SDS Protein Buffer，100 ℃變性蛋白5 min，進(jìn)行SDS-PAGE(5%)電泳后轉(zhuǎn)到聚偏二氟乙烯膜(PVDF)，5 %脫脂奶封閉1 h，鼠源HA標(biāo)簽抗體4 ℃孵育過(guò)夜，TBST洗5次，每次10 min，1∶5 000稀釋的HRP標(biāo)記羊抗鼠IgG 37 ℃孵育1 h，TBST洗5次，每次10 min，使用ECL發(fā)光顯色液顯色。

表1 PCR和重疊PCR引物Table 1 Primers for PCR and overlapping PCR

2 結(jié)果與分析

2.1 生物信息學(xué)分析結(jié)果

PPV NS1經(jīng)Predict NLS預(yù)測(cè)網(wǎng)站分析，未發(fā)現(xiàn)核定位信號(hào)NLS，但PSORT Ⅱ預(yù)測(cè)出NS1 215-218aa(KKRK)為其核定位信號(hào)，PredictNLS預(yù)測(cè)網(wǎng)站比PSORT Ⅱ預(yù)測(cè)結(jié)果更嚴(yán)格，PSORT Ⅱ預(yù)測(cè)出的NLS可能是由于已經(jīng)確定的與PPV NS1同源性較高的MVM NS1(二者同源性為70%左右)在相似位置存在NLS。

2.2 目的基因的擴(kuò)增結(jié)果

分別使用引物F1、R2；F2、R1；F1、R3；F3、R1以PPV DNA為模板使用PCR高保真酶擴(kuò)增目的基因，經(jīng)1%凝膠電泳檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)擴(kuò)增出220 bp(L1)、1 594 bp(L2)、644 bp(L3)、1 192 bp(L4)片段(圖1)，均與預(yù)期結(jié)果相符。分別回收目的片段并使用引物F1、R1分別以L(fǎng)1、L2；L3、L4、PPV DNA為模板，使用PCR高保真聚合酶擴(kuò)增出目的片段NS1、L5、L6，經(jīng)1%凝膠電泳檢測(cè)，擴(kuò)增片段大小為1 986 bp(NS1)、1 779 bp(L5)、1 803 bp(L6)(圖2)，與預(yù)期相符。

Marker:DNA分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn);

Marker:DNA分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn);N:陰性對(duì)照;1:NS1;2:L5;3:L6

2.3 重組質(zhì)粒的構(gòu)建和鑒定

經(jīng)菌液PCR鑒定正確的含重組質(zhì)粒的菌液送測(cè)序公司測(cè)序，NS1測(cè)序序列與GenBank上傳的豬細(xì)小病毒非結(jié)構(gòu)蛋白NS1一致，NS165-133aaDel和NS1207-267aaDel均在目的位置發(fā)生缺失，其余位置未發(fā)生缺失或突變，提取質(zhì)粒，經(jīng)雙酶切鑒定正確(圖3)。

2.4 真核表達(dá)目的蛋白的鑒定

提取轉(zhuǎn)染36 h后的細(xì)胞總蛋白，經(jīng)HA標(biāo)簽抗體檢測(cè)(圖4)，分別在目的位置顯示出條帶，證明NS1、NS165-133aaDel、NS1207-267aaDel均成功表達(dá)。

2.5 目的蛋白的細(xì)胞定位鑒定

通過(guò)免疫熒光和Western-blot鑒定目的蛋白在細(xì)胞內(nèi)的核定位情況。免疫熒光結(jié)果顯示：NS1蛋白和NS1207-267aaDel蛋白定位于細(xì)胞核中，而NS165-133aaDel蛋白定位于細(xì)胞質(zhì)中(圖5)。Western-blot分別檢測(cè)細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)內(nèi)目的蛋白的存在情況，結(jié)果同樣顯示NS1蛋白和NS1207-267aaDel蛋白定位于細(xì)胞核中，而NS165-133aaDel蛋白定位于細(xì)胞質(zhì)中(圖6、圖7)。

Marker:DNA分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn);1:pCAGGS-HA;2:pCAGGS-HA-NS1;3:pCAGGS-HA-NS165-133aaDel;4:pCAGGS-HA-NS1207-267aaDel

Marker:蛋白分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn);1:pCAGGS-HA;2:pCAGGS-HA-NS1;3:pCAGGS-HA-NS165-133aaDel;4:pCAGGS-HA-NS1207-267aaDel

圖5 免疫熒光鑒定目的蛋白細(xì)胞內(nèi)核定位(×400)Fig.5 Identification of target protein in nuclear localization by IFA(×400)

3 結(jié)論與討論

PPV能通過(guò)胎盤(pán)屏障，主要感染胎盤(pán)和胎兒中快速分裂的細(xì)胞導(dǎo)致妊娠母豬子宮內(nèi)膜炎、上皮細(xì)胞死亡和胎兒感染，尤其是內(nèi)皮組織損傷引起母豬繁殖障礙，造成流產(chǎn)、死胎、木乃伊胎、胎兒畸形和弱胎，對(duì)養(yǎng)豬業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。PPV引起的細(xì)胞死亡和組織損傷被認(rèn)為是母豬繁殖障礙的重要致病因素。人工感染PPV能顯著降低豬黃體的血清孕酮濃度，并誘導(dǎo)黃體和豬類(lèi)固醇黃體細(xì)胞(SLCs)產(chǎn)生細(xì)胞病變效應(yīng)(CPE)或細(xì)胞凋亡，體外感染試驗(yàn)表明PPV也能通過(guò)線(xiàn)粒體凋亡途徑誘導(dǎo)豬SLCs原代細(xì)胞、豬傳代細(xì)胞系ST細(xì)胞發(fā)生凋亡[10,20]。LIU等[21]的研究發(fā)現(xiàn)，PPV能夠感染并引起豬外周血單核巨噬細(xì)胞(PBMC)發(fā)生細(xì)胞凋亡。作為病毒調(diào)控蛋白的非結(jié)構(gòu)蛋白NS1被認(rèn)為是引起細(xì)胞凋亡的主要病毒蛋白。ZHANG等[22]的研究表明，PPV NS1能誘導(dǎo)內(nèi)源性ROS/線(xiàn)粒體介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。作者前期的試驗(yàn)表明，PPV通過(guò)與PK-15細(xì)胞Tolls樣受體2、7、9結(jié)合，激活NF-кB信號(hào)途徑[8-9]，PPV NS1通過(guò)TLR2引起MyD88介導(dǎo)的NF-κB信號(hào)通路的激活調(diào)控宿主細(xì)胞的天然免疫反應(yīng)。因此，NS1蛋白同樣是引起宿主細(xì)胞炎性應(yīng)答的主要蛋白，但NS1激活NF-кB信號(hào)通路導(dǎo)致細(xì)胞炎性反應(yīng)和引起細(xì)胞凋亡的功能域尚需進(jìn)一步研究。

Marker:蛋白分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn);1:pCAGGS-HA;2:pCAGGS-HA-NS1;3:pCAGGS-HA-NS165-133aaDel;4:pCAGGS-HA-NS1207-267aaDel

Marker:蛋白分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn);1:pCAGGS-HA;2:pCAGGS-HA-NS1;3:pCAGGS-HA-NS165-133aaDel;4:pCAGGS-HA-NS1207-267aaDel

很多調(diào)控病毒復(fù)制的病毒蛋白是否能進(jìn)入細(xì)胞核是發(fā)揮其調(diào)控病毒復(fù)制或核衣殼組裝作用的關(guān)鍵。段志強(qiáng)等[23]的研究發(fā)現(xiàn)，將雞新城疫病毒M蛋白核定位信號(hào)突變后的拯救病毒M蛋白核定位功能喪失，病毒粒子的毒力、在雞胚的感染能力及在形成細(xì)胞空斑能力均顯著降低。徐文章[24]的研究發(fā)現(xiàn)，H1N1亞型流感病毒NP蛋白NLS3上的373位蘇氨酸突變?yōu)楸彼岷鬁p弱了NP蛋白的入核功能，并且對(duì)轉(zhuǎn)染細(xì)胞內(nèi)病毒復(fù)制所需聚合酶的活性產(chǎn)生抑制。WANG等[25]的試驗(yàn)表明，將PRRSV的N蛋白、NLS1、NLS1,2上的賴(lài)氨酸突變?yōu)榫彼岷?，NLS1、NLS1，2突變毒株的核定位僅僅從核仁定位改變?yōu)楹速|(zhì)定位，突變體拯救病毒的體外增殖能力顯著低于親本病毒，這些突變體毒株同樣減弱了對(duì)IFN-β和IRFs啟動(dòng)子的抑制能力。其次，副黏病毒 M 蛋白、人畜共患病尼帕病毒 M 蛋白入核均對(duì)病毒的復(fù)制存在正向調(diào)控作用[26-28]。另外，有研究認(rèn)為，VSV 的 M 蛋白會(huì)通過(guò)進(jìn)入細(xì)胞核抑制宿主細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄與翻譯[29-31]，即通過(guò)抑制宿主細(xì)胞抗病毒基因表達(dá)，從而為病毒的增殖提供有利的細(xì)胞內(nèi)環(huán)境。但是也有研究發(fā)現(xiàn)并不是所有的病毒蛋白入核都能增強(qiáng)其對(duì)病毒復(fù)制的調(diào)控。劉忠鈺等[32]將登革病毒C蛋白核定位序列突變?yōu)榉呛硕ㄎ恍蛄泻蠓炊鴮?duì)病毒RNA的復(fù)制起到促進(jìn)作用。A型流感病毒 H5N1 NS1 蛋白是否存在細(xì)胞核定位對(duì)病毒的復(fù)制和致病性無(wú)明顯影響，但該病毒蛋白的核定位對(duì)于細(xì)胞調(diào)控抗病毒應(yīng)答的能力極其重要。

在細(xì)小病毒家族中已經(jīng)證實(shí)ADV、B19、MVM的非結(jié)構(gòu)蛋白NS1蛋白均可進(jìn)入細(xì)胞核參與病毒的復(fù)制、核衣殼組裝，介導(dǎo)這些蛋白進(jìn)入細(xì)胞核的核定位信號(hào)也已經(jīng)探明，但豬細(xì)小病毒NS1的入核定位信號(hào)仍不清楚。ADV、B19、MVM、PPV的非結(jié)構(gòu)蛋白NS1均能引起細(xì)胞凋亡，并且ADV NS1的NLS突變喪失入核功能后，病毒的復(fù)制減弱[33-35]，這些細(xì)胞凋亡及調(diào)控病毒的復(fù)制過(guò)程是否和NS1蛋白入核密切相關(guān)尚需研究。本研究通過(guò)比對(duì)PPV NS1和MVM NS1氨基酸同源性后發(fā)現(xiàn)二者氨基酸同源性為70%左右。有研究發(fā)現(xiàn)MVM NS1上214～216aa3個(gè)連續(xù)的賴(lài)氨酸殘基(KKK)介導(dǎo)NS1進(jìn)入細(xì)胞核[18]，與MVM NS1 相似的是PPV NS1 215～218aa同樣存在4個(gè)連續(xù)堿性氨基酸(KKRK)，為了驗(yàn)證介導(dǎo)PPV NS1進(jìn)入細(xì)胞核的NLS是否在該區(qū)域，通過(guò)重疊PCR技術(shù)擴(kuò)增并構(gòu)建了一系列NS1缺失突變體，構(gòu)建的缺失載體NS165-133aaDel、NS1207-267aaDel均成功在PK-15細(xì)胞內(nèi)表達(dá)，通過(guò)免疫熒光和Western-blot發(fā)現(xiàn)缺失包括215～218aa在內(nèi)的NS1207-267aaDel細(xì)胞定位與NS1定位一致，均存在于細(xì)胞核中；而缺失了65～133aa的NS165-133aaDel細(xì)胞定位由細(xì)胞核改變?yōu)榧?xì)胞質(zhì)，說(shuō)明PPV NS1的NLS與MVM NS1不同，其與MVM NS1相似的215～218aa 4個(gè)堿性氨基酸并不像MVM NS1一樣介導(dǎo)NS1蛋白入核，PPV NS1的NLS存在于65～133aa之間，這有可能是PPV NS1與MVM NS1蛋白之間的差異氨基酸引起空間構(gòu)象的不同導(dǎo)致的，而且結(jié)合PPV NS1的NLS預(yù)測(cè)結(jié)果提示介導(dǎo)PPV NS1入核的NLS屬于非經(jīng)典核定位信號(hào)。本研究為進(jìn)一步闡明PPV病毒復(fù)制機(jī)制和NS1調(diào)控細(xì)胞基因轉(zhuǎn)錄機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。

目前，需要構(gòu)建豬細(xì)小病毒反向遺傳系統(tǒng)來(lái)研究PPV NS1缺失65～133aa內(nèi)的NLS后是否對(duì)細(xì)小病毒的復(fù)制、引起的細(xì)胞凋亡或天然免疫反應(yīng)的激活產(chǎn)生影響，長(zhǎng)期以來(lái)，由于細(xì)小病毒基因結(jié)構(gòu)的特殊性，即基因組兩端存在較長(zhǎng)的發(fā)卡結(jié)構(gòu)對(duì)于細(xì)小病毒的反向遺傳系統(tǒng)的建立造成了極大困難。但是，ZHANG等[36]成功構(gòu)建了豬細(xì)小病毒的感染性克隆，為研究豬細(xì)小病毒的感染機(jī)制提供了新平臺(tái)。