陳永宏，高 月，陳祿婭

（重慶市北碚區(qū)中醫(yī)院，重慶 400700）

卵巢癌是最常見的婦科惡性腫瘤，由于其侵襲能力強，轉移快，死亡率高，且在我國發(fā)現(xiàn)時間相對較晚，多處于中晚期，手術治療效果較差，有些患者甚至已失去了手術治療的機會［1-2］。華蟾素的主要有效成分包括甾類強心苷和生物堿［3］。研究證明，其對肝癌細胞和喉癌細胞的DNA 合成、RNA 合成有較強的抑制作用［4-5］，且對上述2 種腫瘤細胞的分化和凋亡具有調控作用［6］。但目前，尚未見其對卵巢癌細胞增殖凋亡及侵襲作用的影響研究。本研究中探討了華蟾素對卵巢癌細胞SKOV-3細胞系增殖凋亡和侵襲作用的影響?，F(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 儀器、試藥與細胞

儀器：JK-JH01 型超凈工作臺（安徽杰克歐德實驗室設備有限公司）；RYX-50 型實驗室培養(yǎng)箱（北京鑫潤科諾儀器儀表有限公司）；PH100 型倒置顯微鏡（鳳凰光學股份有限公司）；TMS-2040 型流式細胞分析儀（蘇州陶邁森科學儀器有限公司）；BG-XM496 型酶標儀（廈門西谷生物工程有限公司）；DYCZ-40G 型蛋白電泳系統(tǒng)（北京六一儀器廠）。

試藥：華蟾素（安徽金蟾生化股份有限公司，國藥準字Z34020273，規(guī)格為每支5 mL）；四氮唑（MTT）試劑盒（上海碧云天生物技術有限公司，批號為C0009）；小牛血清（杭州四季青生物工程有限公司）；RPMI1640 培養(yǎng)基（北京亞米生物科技有限公司，批號為C11875500BT）；凋亡細胞檢驗試劑盒（廣州威佳科技有限公司，批號為JXA005）；Bcl-2 蛋白檢驗試劑盒（上海西唐生物科技有限公司，批號為F15155），Bax 蛋白檢驗試劑盒（北京白奧萊博科技有限公司，批號為KFS216-VGC）；E-cadherin（批號為14472S）和基質金屬蛋白酶-7（MMP-7，批號為3801S），均購自北京生物通生物科技有限公司。

細胞：SKOV-3 細胞系（美國Sciencell 研究室）。

1.2 方法

細胞培養(yǎng)：將對數(shù)生長期的SKOV-3 細胞分為對照組（A 組），低、中、高劑量組（B1組，B2組，B3組）。A 組細胞用僅含有10%小牛血清去蛋白的1640 培養(yǎng)基培養(yǎng)；B1組，B2組，B3組分別用含有0.1，1.0，10.0 mg/L 華蟾素的上述培養(yǎng)基培養(yǎng)。于37 ℃及5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

MTT 法檢測：將各組細胞以1×103/L 的濃度在96 孔板中分別培養(yǎng)24，48，72 h，按試劑盒使用說明用100 μL MTT 溶液進行染色，染色3 min，于顯微鏡下使用血細胞計數(shù)板進行計數(shù)。

細胞存活率（%）=（總細胞數(shù)-藍色細胞數(shù)）/細胞總數(shù)×100%

細胞增殖抑制率（%）=（對照組相應細胞存活率-實驗組相應細胞存活率）/對照組相應細胞存活率×100%

流式細胞分析：調整各組細胞濃度為1×105/L，接種在12 孔板后，相應條件下培養(yǎng)24，48，72 h。然后用磷酸鹽緩沖液（PBS）洗滌重懸，調整細胞濃度為2×106/L，加入Annexin V-FITC 抗體和碘化丙啶在室溫避光條件下孵育30 min。使用流式細胞分析儀進行檢測，采用WinMDI 2.9 和FCS Express V3 軟件進行分析。

蛋白質印跡（WB）法檢測蛋白表達量：將各組細胞分別培養(yǎng)相應時間后，提取細胞蛋白組分，檢測蛋白含量，將各組細胞提取的蛋白質進行SDS-PAGE 電泳分離，每孔加入蛋白40 μg。電泳結束后將蛋白質轉移至硝酸纖維素膜，按試劑說明先后用相應一抗、二抗進行孵育顯色，最后顯影。

蛋白相對表達量=蛋白表達量實驗組/蛋白表達量對照組×100%

細胞侵襲力檢測：將各組細胞在相應培養(yǎng)條件下培養(yǎng)24，48，72 h 后，將細胞洗滌后用DMEM 培養(yǎng)基調整細胞濃度為3×105/mL，根據分組加入華蟾素調整藥物質量濃度分別為0，0.1，1.0，10.0 mg/L。細胞懸液準備完畢后，準備Transwell，配置完畢，每個小室內加入各組相應的細胞懸液100 μL，再將小室放置在盛有75 mL含15%胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)基的24 孔板內，37 ℃及5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h，4%甲醛固定小室內細胞20 min，染色計數(shù)，每個膜分別取5 個視野計數(shù)，取平均數(shù)。

1.3 統(tǒng)計學處理

2 結果

2.1 對SKOV-3 細胞增殖作用的影響

各組細胞在相應條件下分別培養(yǎng)24，48，72 h 后，在相同培養(yǎng)時間內，4 組細胞間增殖抑制率存在顯著差異，A 組細胞增殖抑制率顯著低于B1組，B2組，B3組，隨著藥物質量濃度的升高，B1組，B2組，B3組的增殖抑制率也顯著升高，且組間存在顯著差異（P＜0.05）；使用相同藥物質量濃度干預的條件下，隨著培養(yǎng)時間的延長，細胞增殖抑制率顯著升高。詳見圖1 A。

圖1 各組細胞不同處理時間下增殖抑制率、凋亡率和穿膜細胞數(shù)比較

2.2 對SKOV-3 細胞凋亡作用的影響

SKOV-3 細胞經不同質量濃度的華蟾素干預后，4 組細胞凋亡率存在顯著差異。其中，B1組凋亡率顯著高于A 組，B2組高于B1組，B3組高于B2組；隨著培養(yǎng)時間的延長，組內細胞凋亡率也顯著升高。詳見圖1 B。

2.3 對SKOV-3 細胞侵襲性的影響

相同培養(yǎng)時間內，隨著華蟾素質量濃度的升高，穿膜細胞數(shù)顯著減低，A 組顯著多于B1組，B1組顯著多于B2組，B2組顯著多于B3組；在相同藥物質量濃度條件下，隨著培養(yǎng)時間的延長，B1組，B2組，B3組穿膜細胞數(shù)顯著減少，而A 組穿膜細胞數(shù)隨著培養(yǎng)的時間延長未見明顯變化。詳見圖1 C。

2.4 對SKOV-3 細胞凋亡及侵襲相關蛋白表達的影響

在相同培養(yǎng)時間下，隨著華蟾素質量濃度的升高，SKOV-3 細胞Bax 蛋白和E-cadherin 蛋白表達量顯著升高，A 組顯著低于B1組，B1組顯著低于B2組，B2組顯著低于B3組；而Bcl-2 蛋白和MMP-7 蛋白表達量顯著降低，A 組顯著高于B1組，B1組顯著高于B2組，B2組顯著高于B3組。隨著培養(yǎng)時間的延長，A 組細胞4 種蛋白表達量均未出現(xiàn)明顯變化，B1組，B2組，B3組細胞Bax 蛋白和E-cadherin 蛋白表達量顯著升高，Bcl-2蛋白和MMP-7 蛋白表達量顯著降低。詳見圖2。

圖2 各組細胞不同處理時間下各蛋白表達情況

3 討論

華蟾素是從蟾蜍皮膚及腮腺提取的脂溶性成分，主要成分包括生物堿和強心甾，其中吲哚生物堿為抗腫瘤主要成分［7］，可用于肝癌、鼻咽癌及食管癌的治療［8-10］。華蟾素對腫瘤細胞具有調整細胞周期進程、阻礙細胞增殖、誘導腫瘤細胞凋亡的作用［11-13］。

本研究結果發(fā)現(xiàn)，華蟾素有抑制腫瘤細胞增殖的作用，且隨著其質量濃度的升高和培養(yǎng)時間的延長，其增殖抑制作用更顯著?？梢?，華蟾素對卵巢癌細胞增殖有抑制作用，且存在質量濃度和時間依賴性。華蟾素處理細胞后，細胞凋亡率顯著升高，且隨著藥物質量濃度的升高、作用時間的延長而顯著增高，提示華蟾素促進卵巢癌細胞凋亡的作用呈質量濃度和時間依賴性。

本研究結果顯示，華蟾素有抑制腫瘤細胞Bcl-2蛋白表達和促進Bax 蛋白表達的作用，且存在時間和質量濃度依賴性，這與文獻［14-15］的報道一致。提示華蟾素抑制卵巢癌細胞增殖、促進其凋亡的作用與調控Bcl-2 家族蛋白相關。

本研究結果顯示，華蟾素可有效抑制腫瘤細胞侵襲性，且呈質量濃度和時間依賴性。E-cadherin 蛋白是介導細胞間黏附的一種蛋白受體，其表達下降是很多腫瘤細胞侵襲性升高的重要分子機制［16］。MMP-7 蛋白對于細胞外基質的重要成分如Ⅳ型膠原蛋白、彈力素、層粘連蛋白等均有較強的分解作用，MMP-7 高表達對于多種腫瘤細胞突破血管壁或淋巴管壁進行遠處播散有重要作用［17-18］。提示華蟾素可有效抑制MMP-7 表達升高、E-cadherin 蛋白表達，從而降低卵巢癌細胞的侵襲性，且呈質量濃度和時間依賴性。

綜上所述，華蟾素對卵巢癌SKOV-3 細胞系有抑制細胞增殖，促進細胞凋亡，與其下調Bcl-2 蛋白表達、上調Bax 蛋白表達相關；同時，還具有抑制SKOV-3細胞系侵襲性的作用，與其下調細胞MMP-7 蛋白表達、上調E-cadherin 蛋白表達相關。且均呈質量濃度和時間依賴性。