高丹娜， 吳淑華， 涂麗琴， 干射香， 程兆榜， 姚秋菊， 魏利輝， 周益軍，朱月林， 季英華

(1.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院，江蘇 南京 210095； 2.江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所，江蘇 南京 210014； 3.河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院園藝研究所,河南 鄭州 450000)

大蒜(Allimu.sativumL.)是一種重要的特色蔬菜，在中國已有兩千多年的栽培歷史[1]。由于大蒜適應(yīng)性廣，經(jīng)濟(jì)價(jià)值高，種植廣泛，目前中國大蒜種植總面積達(dá)8.1×105hm2，已成為世界上最大的大蒜生產(chǎn)和消費(fèi)國[2-3]。隨著大蒜種植規(guī)模的擴(kuò)大，大蒜上病毒病的危害也不斷出現(xiàn)，成為影響產(chǎn)業(yè)健康發(fā)展的重要因素。大蒜上病毒病的發(fā)生常會(huì)造成植株葉片出現(xiàn)花葉、褪綠、植株扭曲等癥狀，嚴(yán)重時(shí)會(huì)導(dǎo)致蒜頭瓣少或不分瓣，產(chǎn)量下降，品質(zhì)變劣[4]。由于生產(chǎn)上大蒜主要通過鱗莖以無性繁殖方式進(jìn)行擴(kuò)繁，病毒會(huì)通過蒜頭(蒜種)直接傳播至下一茬，因此病毒病對于大蒜的危害往往是相對長期的，且具有累加效應(yīng)，這種累加效應(yīng)不僅影響在大蒜的產(chǎn)量和品質(zhì)上，也會(huì)影響蒜種質(zhì)量，造成蒜種的退化，加劇對大蒜的危害，困擾大蒜產(chǎn)業(yè)發(fā)展。目前有報(bào)道可以侵染危害大蒜的植物病毒有多種，主要分布在3個(gè)屬：馬鈴薯Y病毒屬(Potyvirus)、麝香石竹潛隱病毒屬(Carlavirus)和蔥屬X病毒屬(Allexivirus)，其他如番茄斑萎病毒屬、斐濟(jì)病毒屬等也有部分成員可以侵染危害大蒜[5]。

韭蔥黃條病毒(Leek yellow stripe virus，LYSV)是一種蚜傳植物病毒[6]，其侵染危害對象包括大蒜、韭蔥等多種蔥屬(Allium)植物[7]，導(dǎo)致寄主植物葉片出現(xiàn)黃色條紋，鱗莖質(zhì)量顯著減小，影響作物產(chǎn)量，有報(bào)道顯示其侵染危害大蒜造成減產(chǎn)可高達(dá)54%[8-9]。LYSV最早于1978年由Bos等發(fā)現(xiàn)并命名[10]，之后該病毒不斷擴(kuò)散蔓延，在墨西哥[11]、土耳其[12]、厄瓜多爾[13]、印度[14]、塞爾維亞[15]、克羅地亞[16]、美國[17-19]、日本[20]、捷克[21]、阿根廷[22]、法國[8]等多個(gè)國家和地區(qū)發(fā)生危害，成為一種在世界范圍發(fā)生危害的主要病毒。中國早在2001年就有LYSV的發(fā)生危害報(bào)道，目前LYSV在浙江[23]、廈門[24]、黑龍江[25]、湖南[26]等地都有發(fā)生危害的報(bào)道，威脅當(dāng)?shù)刈魑锇踩a(chǎn)。

LYSV是一種正義單鏈 RNA 病毒，分類上屬于馬鈴薯Y病毒屬，病毒粒子為線狀，無包膜，長度為815～820 nm，基因組全長10 142 bp，5′端具有病毒基因組結(jié)合蛋白VPg，3′端具有Poly(A)，含1個(gè)開放閱讀框(ORF)，翻譯產(chǎn)生1個(gè)多聚蛋白質(zhì)，多聚蛋白質(zhì)再通過酶解形成包括外殼蛋白(CP)在內(nèi)的10個(gè)有功能的成熟蛋白[23]，其中 CP 是病毒的重要結(jié)構(gòu)蛋白，也是該屬病毒種間分類的重要參考指標(biāo)[27-28]。

河南是中國大蒜第二大產(chǎn)區(qū)，常年栽培面積達(dá)1.3×105hm2[2]，近年來當(dāng)?shù)卮笏馍喜《静〕识喟l(fā)態(tài)勢，2019年本研究在對河南大蒜上病毒病進(jìn)行調(diào)查時(shí)，對當(dāng)?shù)卮笏獠《静悠愤M(jìn)行了田間采集，經(jīng)過室內(nèi)分子檢測及序列分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)當(dāng)?shù)卮笏馍洗嬖贚YSV的感染。

1 材料與方法

1.1 供試病樣

病樣為2019年采自河南開封疑似感染病毒病的大蒜樣本，樣本采集后用液氮冷凍存放于-80 ℃冰箱中，用于后續(xù)試驗(yàn)。

1.2 主要試劑

RNAiso Plus、反轉(zhuǎn)錄試劑盒Prime ScriptTMRT Master Mix、ExTaq酶和克隆載體PMD 18-T購自寶生物工程(大連)有限公司(TaKaRa)，2×TaqMaster Mix購自Vazyme公司，大腸桿菌菌株TOP 10感受態(tài)細(xì)胞購自北京莊盟國際生物基因科技有限公司，瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒及質(zhì)粒提取試劑盒購自美國Axygen公司。其他試劑均為國產(chǎn)分析純，引物委托Invitrogen(上海)貿(mào)易有限公司合成。

1.3 病樣總RNA提取

取保存于-80 ℃冰箱中的大蒜病樣，將其置于液氮中用研缽磨成粉末，采取Trizol法[29]提取總RNA，提取后放在-80 ℃冰箱備用。

1.4 LYSV的RT-PCR檢測

以病樣總RNA為模板，進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，合成cDNA。反應(yīng)體系(10.0 μl)為：模板RNA 0.5 μl，5×Prime Script RT Master Mix 2.0 μl，RNase-Free H2O 7.5 μl。反應(yīng)程序：37 ℃保溫 15 min，85 ℃變性 5 s，4 ℃保存。以反轉(zhuǎn)錄獲得的cDNA為模板，利用韭蔥黃條病毒特異性檢測引物L(fēng)YSV1和LYSV2(表1)進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系：2×TaqMaster Mix 10 μl，ddH2O 7 μl，LYSV1和LYSV2各1 μl，cDNA 1 μl，總體系20 μl；反應(yīng)程序：94 ℃ 變性5 min；94 ℃ 45 s，55 ℃ 45 s，72 ℃ 30 s，34個(gè)循環(huán)；72 ℃ 延伸10 min，4 ℃保存。在0.5×TAE電泳緩沖液中，經(jīng)1 % 瓊脂糖凝膠電泳分離PCR產(chǎn)物，并檢測拍照。

表1 本研究用到的引物

1.5 LYSV CP 基因克隆

根據(jù)韭蔥黃條病毒外殼蛋白氨基酸序列設(shè)計(jì)引物L(fēng)YSVCP_F和LYSVCP_R(表1)，以檢測結(jié)果為陽性的病樣總RNA反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為模板進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增。CP基因擴(kuò)增體系： 10×ExTaqBuffer 2.5 μl，dNTP 0.5 μl，上下游引物各 1.0 μl，cDNA 1.5 μl，ExTaqDNA聚合酶 0.5 μl，ddH2O 18.0 μl，總體積 25.0 μl。擴(kuò)增程序：94 ℃ 5 min；94 ℃ 45 s，47 ℃ 45 s，72 ℃ 55 s，循環(huán) 34 次；72 ℃ 10 min，4 ℃ 保存。PCR反應(yīng)產(chǎn)物于0.5×TAE電泳緩沖液中經(jīng)1 % 瓊脂糖凝膠電泳檢測，檢測后得到的目的片段參照膠回收試劑盒說明書進(jìn)行回收純化后將目的片段與PMD-18T載體在16 ℃下過夜連接，連接產(chǎn)物經(jīng)熱激法轉(zhuǎn)化大腸桿菌TOP10感受態(tài)細(xì)胞，并涂布到含有氨芐青霉素的LB平板上，在37 ℃ 條件下倒置過夜培養(yǎng)，挑取平板上的克隆進(jìn)行菌落PCR和酶切鑒定，鑒定無誤后將菌液送通用生物系統(tǒng)(安徽)有限公司進(jìn)行序列測定。

1.6 序列分析

序列測定完成后根據(jù)擴(kuò)增引物去除兩端的冗余序列，序列多重比對、同源性分析使用ClustalX、BioEdit、DNAstar等軟件及NCBI網(wǎng)站上的BLAST程序(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/Blast.cgi)完成，聚類分析及進(jìn)化樹構(gòu)建采用MEGA6軟件(MEGA、美國)的鄰近法(Neighbor-joining)完成，進(jìn)化樹的可信度使用1 000次自導(dǎo)復(fù)制(Bootstrap)驗(yàn)證。

2 結(jié)果與分析

2.1 病害田間癥狀

本研究2019年對河南大蒜上病毒病進(jìn)行調(diào)查時(shí)發(fā)現(xiàn)當(dāng)?shù)卮笏獯嬖谝伤撇《靖腥镜牟≈辏l(fā)病大蒜植株葉片上出現(xiàn)明顯的黃色褪綠斑塊，有些呈點(diǎn)狀，有些呈條狀，病株偶有矮化現(xiàn)象。在田間調(diào)查過程中，我們發(fā)現(xiàn)該病在河南多個(gè)蒜區(qū)均有發(fā)生，田塊間發(fā)病程度差異比較大，重發(fā)田塊的發(fā)病率達(dá)30%，但零星發(fā)生田塊居多，未見整個(gè)田塊全發(fā)生或毀田的情況。

2.2 韭蔥黃條病毒的檢測

為明確病樣感染的病毒種類，田間樣品采集后，我們對采集的樣品提取了總RNA并進(jìn)行RT-PCR檢測。結(jié)果發(fā)現(xiàn)在利用引物L(fēng)YSV1和LYSV2進(jìn)行檢測時(shí)，采集的38份疑似病樣中，有33份擴(kuò)增到了約為300 bp大小的條帶，與目的條帶(304 bp)大小相近(圖1)，而健康的對照樣品中沒有擴(kuò)增到相應(yīng)大小的條帶。這些結(jié)果初步說明在河南采集的大蒜病樣中可能存在韭蔥黃條病毒的感染。

M:DL 5 000 marker;CK:健康植株;a:19HNGD1-1;b:19HNGD1-2;c:19HNGD1-3;d:19HNGD1-4;e:19HNGD1-5;f:19HNGD1-6;g:19HNGD1-7*;h:19HNGD1-8;i:19HNGD1-9;j:19HNGD1-10;k:19HNGD1-11;l:19HNGD1-12;m:19HNGD2-1;n:19HNGD2-2;o:19HNGD2-3*;p:19HNGD2-4;q:19HNGD2-5;r:19HNGD2-6;s:19HNGD2-7;t:19HNGD2-8。標(biāo)星號(hào)樣品為抽選CP基因克隆樣品。圖1 病樣中韭蔥黃條病毒(LYSV)的RT-PCR檢測Fig.1 RT-PCR detection of leek yellow stripe virus(LYSV) in diseased garlic plants

2.3 韭蔥黃條病毒CP基因克隆

為進(jìn)一步確定檢測到的病毒是LYSV，我們針對LYSV的CP基因設(shè)計(jì)了1對引物：LYSVCP-F和LYSVCP-R(表1)，RT-PCR結(jié)果(圖2)顯示33份陽性樣品均能擴(kuò)增到大小約為860 bp左右的條帶，與預(yù)期目的條帶大小(864 bp)吻合，說明該條帶就是本研究要擴(kuò)增的CP基因目的條帶。

隨機(jī)抽選3個(gè)樣品(19HNGD1-7，19HNGD2-3，19HNGD2-10)，對擴(kuò)增到的目的條帶(圖2)進(jìn)行回收，回收產(chǎn)物連接PMD18-T載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌(TOP10)感受態(tài)細(xì)胞后通過菌落PCR方法篩選陽性克隆，陽性克隆經(jīng)酶切驗(yàn)證(圖2)后送通用生物系統(tǒng)(安徽)有限公司進(jìn)行序列測定(每個(gè)樣品隨機(jī)抽選2個(gè)陽性克隆)。

左:LYSV CP基因RT-PCR擴(kuò)增;右:PMD18T-CP 酶切驗(yàn)證(BamH I) 。左圖，M:DL 5 000 marker;a:19HNGD1-7;b:19HNGD2-3;c:19HNGD2-10;19HNGD1-7、19HNGD2-3、19HNGD2-10為用于LYSV CP基因克隆的樣品編號(hào)。右圖，M：DL 5 000 marker;1、2、3:篩選到的CP陽性克隆編號(hào)。圖2 CP基因的RT-PCR擴(kuò)增(左)及陽性克隆酶切驗(yàn)證(右)Fig.2 RT-PCR amplification of CP gene (left) and identification of positive clone by enzyme digestion (right)

2.4 韭蔥黃條病毒CP基因序列分析

對送測后獲得的序列信息進(jìn)行分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)本研究獲得的6個(gè)CP基因序列全長均為864 bp，編碼1個(gè)由289個(gè)氨基酸組成的相對分子質(zhì)量約32 300的蛋白質(zhì)，序列之間的同源性超過98.6%，BLAST分析結(jié)果顯示，其與LYSV(HQ258895)同源性最高，暗示了其屬于LYSV的1個(gè)分離物。

為進(jìn)一步分析其分類地位，我們使用ClustalX軟件將本研究測定的LYSVCP基因序列及已公開的其他LYSV分離物CP基因序列進(jìn)行了比對(表2)，并利用MEGA6軟件，使用臨近法(Neighbor-Joining，NJ)、Kimura 2-parameter模型重建了系統(tǒng)進(jìn)化樹(圖3)。

表2 6個(gè)樣品CP基因序列與已公布LYSV CP基因序列的同源性

各支上的數(shù)字是1 000次Bootstrap自導(dǎo)復(fù)制的置信度。●：本研究測定的LYSV河南分離物；○：之前報(bào)道的LYSV河南分離物。圖3 根據(jù)LYSV CP基因核苷酸序列一致性構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.3 Phylogenetic tree based on nucleotide sequence consistency of CP gene of LYSV

由CP基因核苷酸序列構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹(圖3)可以看出，本研究獲得的6個(gè)LYSV河南分離物全部聚類到LYSV分支中，說明本研究從河南分離到的病毒為LYSV。對進(jìn)化樹分析可以得出LYSV分為2個(gè)大組，LYSV病毒中國分離物、西班牙分離物、墨西哥分離物、印度分離物及巴西的1個(gè)分離物和澳大利亞的1個(gè)分離物共同聚類到第1組(Group I)，而LYSV病毒阿根廷分離物、澳大利亞2個(gè)分離物、日本分離物及巴西的1個(gè)分離物聚類到第2組(Group II)。針對聚類到第1組的LYSV病毒中國分離物，他們也分布于不同的小分支中，其中本研究報(bào)道的河南分離物與中國廈門等地的2個(gè)分離物共同聚類到1個(gè)小分支中，他們相對近緣。而與其他LYSV分離物(如浙江分離物、云南分離物、臺(tái)灣分離物、黑龍江分離物、湖北分離物、山東分離物等)聚類到不同的小分支，相對遠(yuǎn)緣(同源性低于85%)，其中與之前報(bào)道的LYSV河南分離物之間的同源性僅為81%(圖3、表2)，暗示了本研究報(bào)道的LYSV與之前報(bào)道的存在較大的差異，可能屬于不同類型或不同株系。

3 討 論

大蒜是一種重要的蔬菜作物，除作為調(diào)味品外，在醫(yī)學(xué)研究和應(yīng)用上也占有重要地位[30]，因此其經(jīng)濟(jì)價(jià)值相對較高，種植面積比較廣泛。隨著種植區(qū)域的擴(kuò)大，大蒜上病毒病的種類也異常復(fù)雜，目前有報(bào)道可以侵染危害大蒜的病毒種類至少有20種[5]，這些病毒以單獨(dú)侵染或復(fù)合侵染的方式危害大蒜，影響大蒜產(chǎn)量[31]。加之大蒜多采用無性繁殖的方式生產(chǎn)，病毒會(huì)通過鱗莖直接傳播，不斷加劇對大蒜的危害,造成產(chǎn)量損失、品質(zhì)下降、品種退化等[8，32]。

河南省大蒜栽培面積達(dá)1.3×105hm2，面積、產(chǎn)量均居全國第2位[3]，在中國大蒜生產(chǎn)、供給中起著重要作用。本研究對2019年采自河南表現(xiàn)花葉癥狀的大蒜樣品進(jìn)行檢測時(shí)發(fā)現(xiàn)LYSV的感染，進(jìn)一步的基因克隆及序列分析結(jié)果顯示，其屬于LYSV的1個(gè)分離物。早在2002年Chen等[23]就曾報(bào)道河南大蒜上存在LYSV，因此本研究并不是LYSV在河南發(fā)生危害的首次報(bào)道，但是CP基因序列分析結(jié)果顯示，本研究獲得的LYSV分離物與2002年報(bào)道的河南LYSV分離物之間的同源性僅為81%(而與中國廈門等地的LYSV分離物同源性超過98%)，二者在系統(tǒng)進(jìn)化樹上也未聚類到同一小分支，相對遠(yuǎn)緣。在馬鈴薯Y病毒屬中，CP基因核苷酸序列同源性76%～77%是病毒種的分類閾值[27-28]，因此本研究報(bào)道的河南分離物屬于LYSV，但是該分離物與之前報(bào)道的LYSV河南分離物存在較大的差異，這種差異可能不僅僅體現(xiàn)在基因序列的同源性上，二者在致病性及危害損失上也可能存在差異，暗示河南大蒜上可能出現(xiàn)了新的LYSV類型或株系。由于大蒜多通過無性繁殖進(jìn)行生產(chǎn)，同時(shí)各地大蒜品種也存在頻繁的調(diào)運(yùn)，因此很難判斷河南新的LYSV類型出現(xiàn)的原因是當(dāng)?shù)夭《就ㄟ^變異演化產(chǎn)生還是通過種苗等方式從外地傳入，但生產(chǎn)上應(yīng)對這類病毒的危害密切關(guān)注，防止該病毒擴(kuò)散蔓延造成更大的危害。

鑒于目前有報(bào)道可以侵染危害大蒜的病毒種類有多種，因此在調(diào)查過程中，除LYSV外，本研究也對采集樣品中的其他病毒如洋蔥黃矮病毒(Onion yellow dwarf virus，OYDV)、大蒜A病毒(Garlic virus A，GarV-A)、大蒜B病毒(Garlic virus B，GarV-B)、大蒜X病毒(Garlic virus X，GarV-X)、青蔥潛隱病毒(Shallot latent virus，SLV)等進(jìn)行了檢測，結(jié)果在樣品中也檢測到了OYDV、SLV等病毒，且普遍存在復(fù)合侵染的現(xiàn)象，這些結(jié)果說明河南大蒜上病毒病種類比較復(fù)雜，因此要明確當(dāng)?shù)夭《痉N類及群體變化特征還需要更廣泛的樣品采集及更系統(tǒng)的種類調(diào)查。