張屹 閆雙雙 張成 王冠方 黃海云 韓珊珊

摘 要：為了提高乳腺癌患者的生存率，改善病人的臨床治療效果，從分子機(jī)制上研究了乳腺癌的致病基因。首先對(duì)113個(gè)正常組織和1 109個(gè)癌癥組織的表達(dá)量進(jìn)行差異分析，然后對(duì)差異表達(dá)的基因采用條件聯(lián)合分析方式對(duì)互補(bǔ)基因進(jìn)行分組，并用逐步Cox回歸挑選出一組基因擬合預(yù)后模型。研究結(jié)果顯示：VWCE，SPDYC，CRYBG3，DEFB1，SEL1L2，NMNAT2 6個(gè)基因?qū)颊呱媛适怯泻Φ模珹MZ1，GJB2，CXCL2，ALDOC 4個(gè)基因?qū)颊呱媛适怯欣?，最終確定10個(gè)基因的預(yù)后模型能夠顯著地將樣本分為高風(fēng)險(xiǎn)組和低風(fēng)險(xiǎn)組，并且對(duì)乳腺癌患者5年和10年的生存率進(jìn)行了預(yù)測，依賴時(shí)間的AUC值均可達(dá)0.7以上。所提方法能夠利用基因與基因之間的關(guān)聯(lián)性，很好地對(duì)高維數(shù)據(jù)進(jìn)行降維，消除基因與基因之間的共線性問題，10個(gè)基因的預(yù)后模型可以對(duì)患者的臨床預(yù)測提供幫助。

關(guān)鍵詞：生物數(shù)學(xué);乳腺癌;條件關(guān)聯(lián)基因;預(yù)后模型;臨床預(yù)測

中圖分類號(hào)：Q786?文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1008-1542（2020）04-0349-07

doi：10.7535/hbkd.2020yx04008

乳腺癌是女性常見的一種癌癥，對(duì)女性身心健康有非常嚴(yán)重的影響。世界癌癥研究基金會(huì)數(shù)據(jù)顯示，2018年，全球有超過200萬新增乳腺癌患者[1]。其中有研究表明被診斷為Ⅰ期和Ⅱ期（腫瘤比較小，或只見局部擴(kuò)散）的乳腺癌患者，5年的生存率大約為80%以上;但對(duì)于Ⅲ和Ⅳ期的晚期乳腺癌患者，5年的存活率僅有20%左右[2-3]?？梢姡瑢?duì)乳腺癌患者的治療效果還有待提高。手術(shù)和藥物治療對(duì)乳腺癌患者的治療有所改善，但是近一半的乳腺癌患者仍會(huì)復(fù)發(fā)，并因復(fù)發(fā)而導(dǎo)致死亡[4-5]。傳統(tǒng)治療是通過腫瘤大小、分期等風(fēng)險(xiǎn)因素作為乳腺癌患者的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估和確定治療計(jì)劃的依據(jù)。但是這些臨床病理風(fēng)險(xiǎn)因素?zé)o法將高風(fēng)險(xiǎn)和低風(fēng)險(xiǎn)的乳腺癌患者區(qū)分開，亦無法預(yù)測哪類患者更能受益于化療的治療方案。

隨著高通量技術(shù)的不斷提高，開始采用測序和基因芯片的數(shù)據(jù)來查找致癌基因或確立疾病的生物標(biāo)志物。這種數(shù)據(jù)的格式為在n個(gè)樣本中測得m個(gè)基因的基因表達(dá)量，結(jié)果應(yīng)為n×m維的矩陣，xij表示第i個(gè)樣本中測的第j個(gè)基因的值。針對(duì)同一基因在n個(gè)樣本中的測量數(shù)據(jù)所組成的向量稱為該基因的基因表達(dá)向量，可以表示為xi=[x1i，x2i，…，xni]。基因表達(dá)數(shù)據(jù)最明顯的特性就是樣本少而基因（特征）多，這種高維度的基因表達(dá)數(shù)據(jù)增加了鑒定出與癌癥相關(guān)基因的挑戰(zhàn)難度，嚴(yán)重影響了對(duì)疾病的正確預(yù)測。而且基因與基因之間也有著復(fù)雜的聯(lián)系，不同基因之間的關(guān)聯(lián)有可能會(huì)影響病人的生存期。國內(nèi)外對(duì)如何從眾多基因中挑選出與癌癥預(yù)后相關(guān)的基因一直都有研究。LIU等[6]對(duì)差異表達(dá)的基因，先使用單變量Cox比例回歸模型選出與預(yù)后顯著相關(guān)的，再使用逐步多元Cox回歸確立了最終的7個(gè)基因的預(yù)后模型。BIERMANN等[7]在單變量Cox回歸顯著基因的基礎(chǔ)上，將貝葉斯迭代模型平均應(yīng)用于多變量Cox回歸模型，確定了最終18個(gè)基因的預(yù)后模型。SHI等[8]通過構(gòu)建基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)和挖掘與生存相關(guān)的模塊來鑒定可作為乳腺癌預(yù)后標(biāo)志物的基因。關(guān)于最后的預(yù)后模型的建立，通常采用基于基本的統(tǒng)計(jì)方法Cox回歸來選擇最后的基因，采用一致性指數(shù)（C-Index）來評(píng)估模型擬合，用風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分（線性預(yù)測因子）將不同風(fēng)險(xiǎn)組的患者分開，最后通過ROC曲線函數(shù)下的時(shí)間依賴區(qū)域AUC對(duì)臨床預(yù)測能力進(jìn)行驗(yàn)證[9]。

目前已發(fā)現(xiàn)與乳腺癌相關(guān)的某些分子標(biāo)記，多個(gè)基因生物標(biāo)記物對(duì)于癌癥的預(yù)后比單個(gè)生物標(biāo)記物更為準(zhǔn)確[10-13]，但當(dāng)前臨床預(yù)測和治療的結(jié)果仍不能令人滿意。主要的難點(diǎn)在于發(fā)現(xiàn)基因與基因之間復(fù)雜的聯(lián)系并有效地減少基因個(gè)數(shù)，為建立良好的預(yù)后模型奠定基礎(chǔ)。因此，本文借鑒了YANG 等[14]研究SNP對(duì)復(fù)雜性狀影響中采用的條件聯(lián)合多SNP分析的部分方法，先尋找互補(bǔ)基因，再對(duì)互補(bǔ)基因進(jìn)行Cox回歸，選擇與乳腺癌預(yù)后相關(guān)的基因，確定模型能夠很好地將樣本分為高風(fēng)險(xiǎn)組和低風(fēng)險(xiǎn)組，通過了對(duì)秩數(shù)的檢驗(yàn)，并對(duì)乳腺

癌患者5年和10年的生存率進(jìn)行了預(yù)測，檢驗(yàn)了此預(yù)后模型的準(zhǔn)確性。這種從分子機(jī)制上確定疾病的分子標(biāo)志物對(duì)病人治療的臨床結(jié)果有了很大改善，研發(fā)分子診斷標(biāo)記物來監(jiān)測和預(yù)測各種癌癥的療效是有實(shí)際意義的[15]。

通過確立出的生物標(biāo)志物能夠很好地將不同風(fēng)險(xiǎn)的個(gè)體區(qū)分開，采取不同的治療方案，改善治療效果，減少病痛，延長患者壽命。

1?材料及方法

針對(duì)基因表達(dá)量的數(shù)據(jù)特點(diǎn)，提出了基于條件篩選互補(bǔ)基因并進(jìn)行Cox回歸擬合的預(yù)后模型，對(duì)確定的預(yù)后模型進(jìn)行測試驗(yàn)證，算法過程如圖1所示。

1.1?數(shù)據(jù)的下載與預(yù)處理

從TCGA（the cancer genome atlas）數(shù)據(jù)庫中下載乳腺癌的基因表達(dá)量數(shù)據(jù)和對(duì)應(yīng)的臨床數(shù)據(jù)，由于乳腺癌的基因表達(dá)量數(shù)據(jù)包含1 222個(gè)樣本（其中正常組織樣本113個(gè)，癌癥組織樣本1 109個(gè)），樣本量較大，不能從網(wǎng)頁直接下載基因表達(dá)量的數(shù)據(jù)，需下載官方下載工具gdc-client并在終端命令行中下載。將下載后的每個(gè)樣本中的各個(gè)基因的表達(dá)量數(shù)據(jù)進(jìn)行合并，合并后的基因表達(dá)量數(shù)據(jù)為矩陣形式，行代表的是1 222個(gè)樣本，列代表的是5萬多個(gè)基因，基因表達(dá)量數(shù)據(jù)有3種格式，本文中用的是counts值格式的數(shù)據(jù)。對(duì)ENSEMBL格式的基因名字進(jìn)行轉(zhuǎn)換，轉(zhuǎn)換成只對(duì)人類基因命名的Official Gene Symbol格式，并對(duì)樣本中80%以上表達(dá)量為0的低質(zhì)量基因進(jìn)行剔除，減少基因個(gè)數(shù)。整理好基因表達(dá)量數(shù)據(jù)后，對(duì)113個(gè)正常組織和1 109個(gè)癌癥組織的表達(dá)量進(jìn)行差異分析。首先對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化，然后創(chuàng)建分組矩陣和設(shè)計(jì)矩陣，查看上調(diào)基因和下調(diào)基因，篩選出與癌癥顯著相關(guān)的基因，降低維數(shù)，以利于下一步模型的計(jì)算與構(gòu)建。其中差異表達(dá)基因的篩選標(biāo)準(zhǔn)為log FC>2和FDR<0.05，將滿足條件的基因與臨床數(shù)據(jù)合并，其中的臨床數(shù)據(jù)包括生存時(shí)間、生存狀態(tài)、年齡、組織學(xué)亞型等。

1.2?尋找多組關(guān)聯(lián)互補(bǔ)基因

對(duì)已有的高維基因表達(dá)量數(shù)據(jù)進(jìn)行差異分析，雖然很大程度降低了維數(shù)，但是并不能直接對(duì)此時(shí)的差異基因進(jìn)行預(yù)后模型估計(jì)，此時(shí)的基因不能滿足Cox回歸模型的前提假設(shè)，存在多重共線性問題。因此提出了一種新的方式尋找多組互補(bǔ)關(guān)聯(lián)基因。

假設(shè)有多個(gè)基因?qū)ι鏁r(shí)間有線性影響，采用式（1）來表示此模型：

1.3?Cox回歸

對(duì)篩選出來的每一組基因分別進(jìn)行多元Cox回歸時(shí)，并不是一組里的每個(gè)基因都是有用的。因此，將數(shù)據(jù)分為訓(xùn)練集和測試集，在訓(xùn)練集中對(duì)每一組數(shù)據(jù)進(jìn)行逐步Cox回歸，逐步Cox回歸采取AIC信息準(zhǔn)則作為衡量模型擬合的優(yōu)劣，AIC越小，說明模型擬合得越好，多個(gè)基因的Cox回歸模型如式（18）所示：

其中h（t，X）表示的是在時(shí)刻t時(shí)，m個(gè)基因影響下的危險(xiǎn)率，h0（t）稱為基準(zhǔn)危險(xiǎn)率。w1是自變量的偏回歸系數(shù)，一般取RRj=exp（wj）為相對(duì)危險(xiǎn)度，通過相對(duì)危險(xiǎn)度來直觀地解釋Xj的取值是否對(duì)h（t，X）的取值產(chǎn)生影響。如果RRj>1，說明第j個(gè)基因?qū)Π┌Y樣本有著危害影響;如果RRj<1，說明第j個(gè)基因?qū)Π┌Y樣本有著保護(hù)影響;如果RRj=1，說明第j個(gè)基因基本不會(huì)對(duì)癌癥樣本產(chǎn)生影響。因此，可以通過擬合好的模型提取對(duì)乳腺癌病人生存時(shí)間有著主要影響的基因。Cox比例風(fēng)險(xiǎn)模型一般采用一致性指數(shù)即C-Index來評(píng)價(jià)模型的預(yù)測能力，一致性指數(shù)越接近于1，說明模型的預(yù)測能力越強(qiáng)，預(yù)測的準(zhǔn)確率越高。

1.4?風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分及預(yù)后分析

對(duì)訓(xùn)練集和測試集的基因表達(dá)數(shù)據(jù)利用確定好的多個(gè)基因的Cox回歸模型對(duì)風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分進(jìn)行預(yù)測，風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分表達(dá)式如式（19）所示：

預(yù)測出的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分的中位數(shù)為閾值，將每個(gè)樣本的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分與閾值進(jìn)行比較，大于閾值的樣本為高風(fēng)險(xiǎn)組，小于樣本閾值的為低風(fēng)險(xiǎn)組。對(duì)訓(xùn)練集、測試集和整個(gè)數(shù)據(jù)集分別繪制K-M生存曲線，并用對(duì)數(shù)秩檢驗(yàn)，檢驗(yàn)兩組患者的風(fēng)險(xiǎn)是否有顯著區(qū)別，如果檢驗(yàn)的p值<0.05，說明通過了顯著性檢驗(yàn)，選出來的基因確定的Cox回歸預(yù)測模型能夠很好地預(yù)測患者的風(fēng)險(xiǎn)。然后再對(duì)患者5年和10年的臨床預(yù)測能力繪制ROC，并計(jì)算出AUC值，越接近于1，說明臨床預(yù)測能力越強(qiáng)，準(zhǔn)確率越高。

2?實(shí)驗(yàn)結(jié)果及分析

2.1?差異分析結(jié)果

下載后的基因表達(dá)量完成數(shù)據(jù)的預(yù)處理后為1 222個(gè)樣本和21 487個(gè)基因，對(duì)113個(gè)正常組織和1 109個(gè)癌癥組織進(jìn)行差異分析，使用R語言的limma包，將閾值設(shè)定為log FC>2和FDR<0.05，對(duì)2個(gè)條件同時(shí)滿足的差異表達(dá)基因繪制火山圖，如圖2所示，差異基因中有278個(gè)上調(diào)基因和868個(gè)下調(diào)基因。

2.2?預(yù)后基因的確定

1）將差異分析后得到的顯著基因與臨床數(shù)據(jù)合并，分別進(jìn)行單基因Cox回歸和單基因的一元線性回歸分析，選出與乳腺癌患者總生存期之間顯著的基因，檢驗(yàn)每個(gè)基因回歸系數(shù)值，2個(gè)回歸中以p<0.05作為閾值，篩選顯著基因并進(jìn)行合并，其中線性回歸中顯著基因有211個(gè)，Cox回歸中顯著基因有438個(gè)，對(duì)2種單基因回歸分析中顯著基因取并集后的612個(gè)基因按關(guān)聯(lián)互補(bǔ)方式選擇開始進(jìn)行分組。

2）提取單基因的一元線性回歸系數(shù)及顯著性檢驗(yàn)的p值， p值最小的一個(gè)作為第一組的第一個(gè)入選基因，剩下的基因叫做備選組，計(jì)算在入選基因組的基礎(chǔ)上再從備選組中選擇一個(gè)基因加入的條件閾值，如果有p<0.05，選擇最小的p值加入，以此類推，加入下一個(gè)基因，直至沒有p值小于0.05，這樣就選出了第一組基因，共4個(gè)。

3）重復(fù)步驟2），至所有的基因都分了組，共分47個(gè)組。通過驗(yàn)證證明了組中基因個(gè)數(shù)小于15，進(jìn)行擬合Cox回歸，C-Index均小于0.7，所以將組中基因個(gè)數(shù)小于15的組刪掉，剩下15個(gè)組。

4）完成數(shù)據(jù)分組后，對(duì)935個(gè)樣本數(shù)據(jù)集采用計(jì)算機(jī)生成隨機(jī)數(shù)的方式劃分訓(xùn)練集735個(gè)樣本和測試集200個(gè)樣本，對(duì)每一組基因分別進(jìn)行逐步Cox回歸，最終選出了第8組的10個(gè)基因作為乳腺癌的預(yù)后基因。 通過這10個(gè)基因確定了乳腺癌的預(yù)后模型，Cox回歸結(jié)果如表1所示。

最終多變量Cox回歸模型的10個(gè)基因中有6個(gè)基因（VWCE，SPDYC，CRYBG3，DEFB1，SEL1L2，NMNAT2）的風(fēng)險(xiǎn)比值均大于1，說明對(duì)乳腺癌患者的生存率有著危害的影響，剩下的4個(gè)基因（AMZ1，GJB2，CXCL2，ALDOC）的風(fēng)險(xiǎn)比值均小于1，說明對(duì)乳腺癌患者的生存率有著有利的影響。對(duì)10個(gè)基因的回歸系數(shù)進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)，8個(gè)p值均小于0.05，剩下2個(gè)p值小于0.1，由于對(duì)多變量模型的預(yù)測能力強(qiáng)而被保留在模型中。

2.3?預(yù)后模型的測試

通過10個(gè)基因在訓(xùn)練集中估算乳腺癌患者的生存風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分：

最終的計(jì)算結(jié)果表明，風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分的中位數(shù)為1.013，平均數(shù)為1.473，最小值為0.052，最大值為26.788。采用訓(xùn)練集中風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分的中位數(shù)將訓(xùn)練集、測試集和整個(gè)數(shù)據(jù)集中的乳腺癌患者分為高風(fēng)險(xiǎn)組和低風(fēng)險(xiǎn)組，繪制生存風(fēng)險(xiǎn)曲線。訓(xùn)練集中高風(fēng)險(xiǎn)組和低風(fēng)險(xiǎn)組中樣本個(gè)數(shù)分別為367個(gè)和368個(gè)，測試集中高風(fēng)險(xiǎn)組和低風(fēng)險(xiǎn)組中樣本個(gè)數(shù)分別為88個(gè)和112個(gè)。K-M分析顯示這2組的生存曲線顯著不同，與低風(fēng)險(xiǎn)組相比，高風(fēng)險(xiǎn)組的患者表現(xiàn)出更短的生存時(shí)間，且通過了對(duì)秩數(shù)檢驗(yàn)，p值都分別小于0.05，如圖3所示。

為了評(píng)估這10個(gè)基因預(yù)后模型的準(zhǔn)確率，分別對(duì)訓(xùn)練集、測試集和整個(gè)數(shù)據(jù)集繪制了時(shí)間依賴性的ROC曲線，

如圖4所示，在訓(xùn)練集中，5年和10年的AUC值分別為 0.75和0.81。

如圖5所示，在測試集中，5年和10年的AUC值分別為0.77和0.78。以上這些結(jié)果表明，風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分是乳腺癌患者臨床結(jié)果的有力預(yù)測指標(biāo)。

3?結(jié)?論

研究并設(shè)計(jì)出能夠區(qū)分基因與基因之間復(fù)雜關(guān)系、更好地降低維數(shù)、更為簡單高效的癌癥預(yù)后模型，具有十分重要的理論意義和臨床應(yīng)用價(jià)值。本研究使用了一種新的方式來尋找關(guān)聯(lián)互補(bǔ)基因，對(duì)每組基因分別進(jìn)行Cox回歸，得到了一組穩(wěn)健的預(yù)后模型，并分別通過了訓(xùn)練集和測試集的驗(yàn)證，通過10個(gè)預(yù)后基因，可以將高風(fēng)險(xiǎn)組和低風(fēng)險(xiǎn)組顯著分開。

通過在GeneCard上查找已經(jīng)選擇出來的基因的分子功能，發(fā)現(xiàn)VWCE是β-catenin信號(hào)傳導(dǎo)途徑中的調(diào)控元件，也是化學(xué)預(yù)防細(xì)胞癌的靶標(biāo)。SPDYC通過結(jié)合和激活CDK1與CDK2，能夠促進(jìn)整個(gè)細(xì)胞周期的進(jìn)展。GJB2表達(dá)于耳蝸，在表皮的上基底層和乳腺及子宮內(nèi)膜的上皮細(xì)胞中弱表達(dá)。防御素β1（DEFB1）基因與COPD相關(guān)，在COPD患者中，人DEFB1的表達(dá)上調(diào)會(huì)影響肺功能的下降[16]。CXCL2是一種趨化因子，炎癥介質(zhì)，趨化因子在協(xié)調(diào)免疫細(xì)胞向炎癥或損傷部位的協(xié)調(diào)募集中起作用[17]。比如其他趨化因子CCL2已被報(bào)道能夠負(fù)面調(diào)節(jié)管腔B乳腺癌細(xì)胞的過程，包括自噬和壞死[18]。有文獻(xiàn)證明CXCL2通過抑制ERK1/2信號(hào)傳導(dǎo)通路，減弱成骨細(xì)胞分化[19]。NMNAT2是維持健康軸突的重要生存因素[20]。

總之，確定的10個(gè)乳腺癌的預(yù)后生物標(biāo)記物基因被證明具有高預(yù)測能力，且會(huì)隨著時(shí)間的推移保持穩(wěn)定研究結(jié)果有助于開發(fā)更有效的預(yù)后工具，最終改善患者預(yù)后。得到的這些標(biāo)志性基因在其他文獻(xiàn)中雖然沒有顯示出與乳腺癌直接關(guān)聯(lián)，但是這些基因與疾病相關(guān)，說明有致病影響，還需要作進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)研究，了解這些基因之間的相互作用，對(duì)臨床結(jié)果進(jìn)行預(yù)測，制定治療方案，從而為高危乳腺癌患者提供更好的治療選擇，對(duì)低危患者減少過度治療。此方法也可作為篩選其他癌癥預(yù)后標(biāo)志物的方法，結(jié)果有待進(jìn)一步測試驗(yàn)證。

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