曹淑曼 王雪涵 田薇

摘要：目的：通過微生物宏基因組測序方法檢測10種市售益生菌產(chǎn)品的菌種組成。方法：從益生菌產(chǎn)品中直接提取微生物宏基因組DNA，采用第二代高通量基因測序方法進行宏基因組測序，對測序結(jié)果進行生物信息學分析，確定每種產(chǎn)品中益生菌的菌種組成以及相對豐度。結(jié)果：所檢測的10種產(chǎn)品中，僅有2種產(chǎn)品的檢測結(jié)果與產(chǎn)品說明中所標注的菌種組成完全相符，其他產(chǎn)品均與各自標注有不符合之處，主要表現(xiàn)為菌種缺失或（和）含有其他混雜菌種。兩次獨立抽樣檢測結(jié)果一致。結(jié)論：監(jiān)管部門需要對益生菌產(chǎn)品質(zhì)量進行嚴格監(jiān)控，而微生物宏基因組測序技術(shù)為監(jiān)管部門提供了一個檢測益生菌產(chǎn)品菌種組成的新方法。

關(guān)鍵詞：益生菌;宏基因組;菌種組成

人體健康與人體共生的各種微生物密切相關(guān)，益生菌通過四個主要機制對人體產(chǎn)生有益的影響[1]：通過結(jié)合在粘附位點與病原菌競爭來干擾病原菌的定殖[2];改善腸道上皮細胞的屏障功能[3];參與免疫調(diào)節(jié)[4];通過免疫系統(tǒng)[5]和神經(jīng)遞質(zhì)產(chǎn)生對身體其他器官的影響[如γ氨基丁酸（GABA）和5羥色胺][6]。市場上常見的益生菌主要包括雙歧桿菌屬（Bifidobacterium）和乳酸桿菌屬（Lactobacillus）的微生物群。例如，鼠李糖乳桿菌（Lactobacillus rhamnosus）GG ATCC 53103可促進微生物群的關(guān)鍵成分與宿主上皮之間的相互作用，潛在地促進了腸道定居微生物的抗炎通路[7]，從而改善腸道微環(huán)境;長雙歧桿菌可促進抗腫瘤免疫并加強抗PDL1的功效[8]。益生菌的功能具有種屬特異性和個體差異性，即使屬于同一菌種的不同菌株，也會有功效的差異。例如，假鏈狀雙歧桿菌（Bifidobacterium pseudocatenulatum）CECT 7765能夠有益地調(diào)節(jié)慢性應激反應[9]，假鏈狀雙歧桿菌IPLA 36007有益于異黃酮活化[10]，而假鏈狀雙歧桿菌G4可以抑制血膽固醇的增加[11]。因此，益生菌菌種乃至菌株的正確使用是益生菌產(chǎn)品發(fā)揮功能的最重要的一環(huán)。

除了傳統(tǒng)上用于食品生產(chǎn)加工的菌種外，原衛(wèi)生部辦公廳發(fā)布的《可用于食品的菌種名單》和《可用于嬰幼兒食品的菌種名單》中，列出了7個菌屬共計35個益生菌菌種可用于食品[1217]。市場上的益生菌產(chǎn)品所使用的菌株應當符合國家標準，并且應當標注明確到具體的菌株。目前鑒定益生菌的方法大多限于傳統(tǒng)方法和比較粗放的分子生物學方法，如平板稀釋計數(shù)法、顯微鏡測數(shù)法、濁度測定法、流式細胞計數(shù)法。平板菌落計數(shù)法[18]是最經(jīng)典的細菌計數(shù)方法，需要培養(yǎng)活菌，操作簡單、結(jié)果穩(wěn)定，但只能從菌落的形態(tài)、顏色等方面初步辨別真菌與細菌。顯微鏡測數(shù)法[19]是利用血球計數(shù)板，在顯微鏡下計算一定容積里微生物的數(shù)量，快速、準確，但不能區(qū)分死菌或活菌，不適于對運動細菌的計數(shù)，需要較高的細菌濃度，且僅能根據(jù)染色后顏色和形態(tài)等對細菌做大致的分類。流式細胞計數(shù)法[2021]也能夠一定程度上鑒定細菌，但是無法鑒定到種水平。16S rRNA擴增子測序[2223]既能體現(xiàn)不同菌屬之間的差異，又能利用測序技術(shù)較容易地得到其序列，但有的菌種由于屬內(nèi)/種間差異小，單獨依靠16SrDNA鑒定不能鑒定到種水平。Patro等[24]構(gòu)建了一個名為FDA GutProbe高效可靠的平臺，使用DNA微陣列芯片法鑒定膳食補充劑中微生物成分的存在并確定其差異。但這些常用的方法只是定量測定細胞濃度的方法，無法對微生物進行物種的鑒定，這是傳統(tǒng)方法的局限性。

宏基因組測序[25]可分析特定環(huán)境微生物群體基因組成及功能、菌群的多樣性與豐度，可以鑒定出混合環(huán)境中包含有哪些菌株，精度可鑒定到菌株水平。Patro等[26]運用宏基因組測序技術(shù)鑒定膳食補充劑樣品中微生物活菌，用kmer方法計算其豐度，可快速有效地識別各種膳食補充劑樣品中物種水平，確定這些產(chǎn)品中特定污染物的存在。因此，宏基因組測序技術(shù)應用于檢測益生菌產(chǎn)品的菌株組成有其不可替代的優(yōu)勢。本實驗采用宏基因組測序技術(shù)，分析市售10種益生菌產(chǎn)品的菌種組成，為我國益生菌產(chǎn)品的質(zhì)量監(jiān)控探索一種新方法。

1材料與方法

11主要試劑與儀器

天根糞便基因組DNA提取試劑盒，天根生化科技有限公司;柏爾快速建庫試劑盒（貨號：514402）;Ampure XP磁珠，Beckman公司;微量核酸定量儀（ND1000 型），美國Nano Drop 公司;PCR 儀（2720 型），美國 Applied Biosystems 公司;電泳儀（PowerpacTM基礎型），美國 BIORAD 公司;凝膠成像系統(tǒng)（Alpha Imager EP通用型），美國 Alpha Innotech 公司;離心機（Z216 MK 型），德國 HERMLE 公司;超聲破碎儀（Bioruptor）;Mini Bead beater16（607EUR型），購于美國BioSpec公司。

12益生菌產(chǎn)品和微生物基因組DNA提取

從京東商城采購10 種市面上常見的益生菌產(chǎn)品，實驗時產(chǎn)品均在保質(zhì)期范圍內(nèi)。對于10種產(chǎn)品，均于同一批次內(nèi)分別隨機抽取2份獨立小包裝，作為實驗重復。使用天根糞便基因組DNA提取試劑盒進行DNA提?。悍Q取（200±5） mg益生菌產(chǎn)品干粉至2 mL離心管中，置于冰上。稱取03 g直徑01 mm 的玻璃珠，向樣本中加入14 mL緩沖液GSL，用bead beater 振蕩2 min。用95 ℃、900 r/min振蕩孵育10 min。渦旋15 s。12 000 r/min離心1 min。然后按照天根糞便基因組DNA提取試劑盒的標準流程進行DNA提取。DNA 提取結(jié)果用 1% 瓊脂糖凝膠電泳100 V、60 min，通過凝膠成像系統(tǒng)進行檢測。

13微生物DNA濃度檢測

使用Nano Drop核酸濃度測定儀，按照使用說明書，分別取以上益生菌產(chǎn)品提取得到的DNA 洗脫液 1 μL 加樣于檢測區(qū)，讀取DNA的濃度。濃度要求不少于10 ng/μL。

14測序文庫的構(gòu)建及質(zhì)控

取20 μg微生物宏基因組DNA，使用柏爾快速建庫試劑盒構(gòu)建測序文庫。具體步驟如下：取檢測合格的20 μg DNA樣品，用Bioruptor儀器隨機打斷成長度約為350 bp的片段，再用磁珠純化，經(jīng)末端修復、加A尾、加測序接頭、純化、PCR 擴增等步驟完成整個文庫制備。文庫構(gòu)建完成后，使用Qubit 20進行初步定量，稀釋文庫至2 ng/μL，隨后使用Agilent 2100對文庫的插入片段大小進行檢測，使用qPCR方法[27]對文庫的有效濃度進行準確定量（文庫有效濃度>3 mmol/L），以保證文庫上機質(zhì)量。

15測序

將構(gòu)建好的文庫在Illumina Hiseq 2500平臺上機進行測序。

16物種注釋

使用MOCAT[28]預處理過濾低質(zhì)量序列、過短序列以及錯誤序列，得到有效數(shù)據(jù)。從各樣品質(zhì)控后的有效數(shù)據(jù)出發(fā)，進行Metagenome組裝[29]。從gene catalogue出發(fā)，用bowtie把序列和MicroNR庫進行比對，獲得Unigenes的物種注釋信息，并結(jié)合基因豐度表，獲得不同分類層級的物種豐度表。

2結(jié)果與分析

21所檢測到的菌株總覽

根據(jù)Metagenomic測序生成的進化分支圖，本次檢測的益生菌產(chǎn)品中所測出的菌株，分屬于11個科、11個屬、22個種，其中益生菌集中在2個屬—雙歧桿菌屬（Bifidobacterium）和乳酸桿菌屬（Lactobacillus），其他益生菌還包括鏈球菌屬（Streptococcus）。腸桿菌屬、腸球菌屬、分枝桿菌屬等為產(chǎn)品中痕量的微生物污染。

22所檢測到的菌種與產(chǎn)品說明的對比

在市場上所隨機抽取的10種益生菌產(chǎn)品名稱以字母代號表示。如附圖所示，所檢測的10種益生菌產(chǎn)品中，只有代號為TCBJ和DMKHS的兩個產(chǎn)品的檢測結(jié)果和產(chǎn)品標注完全相同，且兩次抽檢檢測到的菌種組成完全一致。其他產(chǎn)品均不達標，表現(xiàn)為缺失產(chǎn)品說明中所列示的菌種，或者含有產(chǎn)品說明中未標示的菌種。10種益生菌產(chǎn)品中，菌種組成的合格率僅為20%。

23分析

市場上的益生菌產(chǎn)品主要包括乳制品、粉劑、片劑等，本次實驗的產(chǎn)品主要是粉劑、片劑、膠囊，近年來這些產(chǎn)品作為補充身體益生菌的主要膳食補充劑而廣受推崇。10種市售的益生菌產(chǎn)品中的菌種大多屬于乳酸桿菌屬和雙歧桿菌屬，其中用的最常見的是嗜酸乳桿菌（Lactobacillus acidophilus）和嬰兒雙歧桿菌（Bifidobacterium infantis）。本實驗中，通過宏基因組測序檢測出最多的菌種是鼠李糖乳桿菌（Lctobacillus rhamnosus）和動物雙歧桿菌（Bifidobacterium animalis）?？傮w上，本次檢測的產(chǎn)品存在較為突出的問題，10個產(chǎn)品平均有1～2個標注的益生菌種未檢測到，其中代號為HSYP的產(chǎn)品標注為嗜酸乳桿菌（Lactobacillus acidophilus），而檢測到的全部為瑞士乳桿菌（Lactobacillus helveticus）;所有產(chǎn)品包裝都沒有標注的菌種玉米乳桿菌（Lactobacillus zeae）在兩個產(chǎn)品中檢測到，且在BSY中為主要益生菌組分;個別產(chǎn)品（代號BSY）益生菌沒有污染的雜菌豐度高，兩次重復測定中益生菌比例僅占285%～32%。部分非產(chǎn)品標注的乳酸菌的出現(xiàn)，可能是由于生產(chǎn)企業(yè)為了延長保質(zhì)期限，將某些可以產(chǎn)生細菌素的乳酸菌如副干酪乳桿菌（Lactobacillus paracasei）和植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum ）等作為食品添加劑導致的[30]。中國目前市場流通的益生菌產(chǎn)品質(zhì)量良莠不齊，生產(chǎn)企業(yè)對微生物的菌種鑒定水平與生產(chǎn)管理水平亟待提高。

3結(jié)論

使用宏基因組測序技術(shù)對我國益生菌產(chǎn)品質(zhì)量進行評價發(fā)現(xiàn)，益生菌產(chǎn)品市場存在著不規(guī)范和安全隱患的問題，可以利用高通量測序的新技術(shù)來對國內(nèi)益生菌產(chǎn)品市場進行監(jiān)管。益生菌廠家生產(chǎn)時應使用符合國標的具有明確編號的菌株，保證生產(chǎn)、包裝環(huán)境無菌，保證消費者的權(quán)益?！?/p>

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