王珊珊 劉佳萌 孫晶 孫玉鳳 賈寧 劉佳妮 范蓓 王鳳忠

摘?要：綜述了石斛堿的藥用功效、檢測方法、含量分布規(guī)律以及合成途徑等方面的研究進(jìn)展，并針對存在的主要問題提出解決方案，為石斛堿的進(jìn)一步開發(fā)利用提供研究思路。

關(guān)鍵詞：石斛堿;藥用功效;檢測方法;分布規(guī)律;合成途徑

石斛屬（Dendrobium）植物目前在全球約有1 500種，在中國被認(rèn)定為有藥用價值的石斛屬植物已超過50余種[1-2]。本文將藥典里有明確規(guī)定用作藥用、傳統(tǒng)用作藥用、相關(guān)研究證明具有藥用療效的石斛統(tǒng)稱為藥用石斛。藥用石斛主要在歸胃、腎經(jīng)方面作用較為突出，《神農(nóng)本草經(jīng)》等古醫(yī)學(xué)典籍以及《中國藥典》均對其有所記載，被歷代醫(yī)家視為珍品[3-4]。大量現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究表明，藥用石斛中的多糖、生物堿、酚類、菲類和聯(lián)芐類等活性成分具有很好的抗腫瘤、抗衰老、抗氧化、降血糖以及提高免疫力等藥用功效，其中生物堿和多糖是藥用石斛的兩種主要藥效成分[5]。目前在藥用石斛屬植物中已發(fā)現(xiàn)有52個生物堿類化合物，主要可分為咪唑、倍半萜、四氫吡咯、八氫中氮茚和酰胺等5種類型[6]。石斛堿是石斛屬植物所特有的一種倍半萜類生物堿，被認(rèn)為是中藥石斛解熱鎮(zhèn)痛作用的有效成分[7]。早在1932年，鈴木秀干等[8]就首次在藥用金釵石斛（D.nobile）中分離獲得石斛堿;1964年，Onaka等[9]確定了石斛堿具有倍半萜骨架結(jié)構(gòu);2015年版《中國藥典》將石斛堿作為金釵石斛的檢測標(biāo)準(zhǔn)，規(guī)定其按干燥品計算，石斛堿的含量不少于0.40%[4]。本文對藥用石斛中石斛堿的藥用功效、檢測方法、含量分布規(guī)律以及合成途徑等方面的研究進(jìn)展進(jìn)行綜述，以期為石斛堿的進(jìn)一步開發(fā)利用提供科學(xué)依據(jù)。

1?石斛堿藥用功效

藥用石斛化學(xué)成分較多，對其藥效成分的研究多集中于總多糖、總生物堿、菲類以及聯(lián)芐類化合物。其中，石斛堿的藥理作用主要表現(xiàn)在抗炎癥、心血管保護(hù)、對神經(jīng)系統(tǒng)和糖脂代謝的調(diào)控以及清熱止痛等方面。Kudo等[10]研究發(fā)現(xiàn)，石斛堿在青蛙脊髓中幾乎與苦毒寧具有相同的神經(jīng)藥理學(xué)作用;王憲楷[11]研究表明，石斛堿具有解熱止痛、降低心率與血壓、產(chǎn)生中度高血糖以及強(qiáng)身健體等作用，同時還可解巴比妥中毒;張俊青[12]研究發(fā)現(xiàn)，石斛堿可通過降低外源性內(nèi)毒素脂多糖（LPS）誘導(dǎo)的大鼠大腦皮層星形膠質(zhì)細(xì)胞（Ac）炎癥因子NO的釋放，進(jìn)而發(fā)揮抗炎作用;劉嬋等[13]研究發(fā)現(xiàn)，石斛堿能通過抑制基因p-NF-κBp 65的表達(dá)，進(jìn)而抑制心臟成纖維細(xì)胞（CF）的增殖和炎性因子的表達(dá)，證實石斛堿具有抗炎癥以及保護(hù)心血管系統(tǒng)作用;Li等[14]首次研究發(fā)現(xiàn)，石斛堿可降低核糖核蛋白復(fù)合物vRNP的活性，以流感病毒NP蛋白作為抗流感病毒的作用靶點，通過與NP蛋白的結(jié)合抑制其出核及寡聚化，進(jìn)而對流感病毒的早期復(fù)制起到阻礙作用;Song等[15]研究發(fā)現(xiàn)，石斛堿可與順鉑聯(lián)合通過刺激JNK/p38應(yīng)激信號通路介導(dǎo)細(xì)胞死亡，激活促凋亡蛋白Bax和Bim，有效誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的特異性死亡，進(jìn)而對非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞（NSCLC）的抗癌活性增強(qiáng)，且不加重順鉑的心臟毒性，為人類肺癌的治療提供了一種新的研究思路。

隨著現(xiàn)代儀器設(shè)備及檢測方法的發(fā)展進(jìn)步，對石斛堿的藥代動力學(xué)也進(jìn)行了深層次的研究探索。魯艷柳團(tuán)隊[16]首次研究發(fā)現(xiàn)，金釵石斛中的生物堿對谷氨酸誘導(dǎo)的大鼠海馬神經(jīng)元軸突變性能夠起到一定的保護(hù)作用，作用機(jī)制主要是通過促進(jìn)大鼠海馬神經(jīng)元自噬體的形成和改善谷氨酸誘導(dǎo)的神經(jīng)元軸突變性損傷。該團(tuán)隊通過超高效液相色譜串聯(lián)四極桿-靜電場軌道阱高分辨質(zhì)譜系統(tǒng)（UPLC /LTQ-Orbitrap-MS）對石斛堿在人肝微粒體Ⅰ相代謝的4個主要代謝產(chǎn)物：M-250（[M + H]+ m/z 250.1801）、M-262（[M + H]+ m/z 262.1800）、M-280（[M + H]+ m/z 280.1906）、M-296（[M + H]+ m/z 296.185 6）以及Ⅱ相代謝的1個主要代謝產(chǎn)物：M-440（[M]+ m/z 440.227 8）進(jìn)行鑒定，結(jié)果表明，石斛堿經(jīng)過代謝生成了極性較大的代謝產(chǎn)物，肝臟核受體內(nèi)脂溶性環(huán)境可能會排斥極性較大的代謝產(chǎn)物。由于糖脂代謝主要由肝臟核受體調(diào)控，推測石斛堿該代謝過程可能會降低其調(diào)控糖脂代謝的活性作用[17]。在此基礎(chǔ)上，該團(tuán)隊利用超高效液相色譜-質(zhì)譜/一測多評法（UPLC-MS/QAMS）首次建立了測定小鼠血漿中石斛堿及其代謝產(chǎn)物M-250、M-280濃度的方法，并且研究對小鼠灌胃后，石斛堿在小鼠體內(nèi)主要組織部位的分布規(guī)律，結(jié)果顯示，石斛堿在肝臟和腸組織中分布最多，而在肝臟中藥物質(zhì)量分?jǐn)?shù)隨著時間的延長而迅速下降，推測石斛堿可能主要在肝臟中進(jìn)行代謝;同時發(fā)現(xiàn)，石斛堿雖然在腦組織中含量較低，但仍有明顯的分布。由此可見，石斛堿能夠透過血腦屏障，該結(jié)果為其具有保護(hù)神經(jīng)元損傷、抗老年癡呆等神經(jīng)藥理活性作用提供了科學(xué)依據(jù)[18-19]。

但是，在藥用石斛使用中不能忽視石斛堿自身存在的毒理作用。王彬容[20]研究發(fā)現(xiàn)，石斛堿對斑馬魚胚胎具有毒性作用，其半數(shù)致死濃度LC50為0.207 mg/mL，主要表現(xiàn)為心率下降、心包腫大。隨著石斛堿的濃度增加，其對斑馬魚的毒性作用增強(qiáng)，石斛堿在80 mg/mL濃度時對斑馬魚胚胎具有明顯的致畸作用，在140 mg/mL濃度時開始導(dǎo)致斑馬魚胚胎的死亡。斑馬魚死亡率與石斛堿濃度和處理時間都具有一定相關(guān)性。石斛堿濃度與細(xì)胞凋亡情況呈正相關(guān)，表明石斛堿誘導(dǎo)了斑馬魚胚胎的細(xì)胞凋亡。同時，SOD酶活性的增加以及MDA量的減少表明石斛堿引起了斑馬魚胚胎的氧化應(yīng)激，進(jìn)而產(chǎn)生致畸作用。由于人體對于藥物毒性的耐受量相比于動物來說要低很多，而國內(nèi)外目前對斑馬魚和人給藥劑量的換算系數(shù)尚未有定論，故在用藥時建議不要大劑量地服用含石斛堿的藥劑。由此可見，我們在關(guān)注石斛堿藥用功效的同時，也應(yīng)該對其毒理性進(jìn)行相關(guān)的研究，從而能夠合理、高效地發(fā)揮其藥用功效。

2?石斛堿含量分布規(guī)律

作為金釵石斛總生物堿中最主要的特征性成分，石斛堿占金釵石斛總生物堿含量的92%以上[7，21]。隨著對石斛堿研究的深入，在越來越多的石斛屬植物中檢測到石斛堿的存在，其含量主要受到石斛種類、植株部位、栽培條件、采收期及加工方式等多方面的影響。

2.1?不同石斛種類對石斛堿的影響

王曉媛等[22]比較了石斛屬6種石斛主要化學(xué)成分差異，包括線葉石斛（D.aurantiacum Rchb.f.）、蜻蜓石斛（D.pulchellum）、杓唇石斛[D.moschatum（Buch.-Ham.）Sw.]、疊鞘石斛（D.denneanum Kerr.）、流蘇石斛（D.fimbriatum Hook.）以及細(xì)葉石斛（D.?hancockii Rolfe），采集部位為1年生莖段，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，僅在線葉石斛中檢測到石斛堿存在，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.02%，低于《中國藥典》規(guī)定。陳志輝等[23]運(yùn)用TLC對疊鞘石斛、流蘇石斛、金釵石斛的化學(xué)成分進(jìn)行比較鑒定，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，僅在金釵石斛中檢測出石斛堿色譜斑點，而流蘇石斛和疊鞘石斛中未發(fā)現(xiàn)石斛堿色譜斑點;李振堅等[6]研究表明，目前僅石斛屬4個種中發(fā)現(xiàn)含有石斛堿，包括金釵石斛、矩唇石斛（D.linawianum Rchb.?f.）、棒節(jié)石斛（D.findleyanum Par.et Rchb.f.）以及線葉石斛，鐵皮石斛（D.officinale Kimura et Migo）作為石斛市場的主流產(chǎn)品，雖然對其研究比較多，但是并未檢測到石斛堿的存在。陳曉梅等[24]研究也表明，在鐵皮石斛中未能檢測出石斛堿，而石斛堿在金釵石斛中具有較高的含量;此外，HPLC-MS分析結(jié)果顯示，鐵皮石斛中總堿含量低、生物堿類化合物數(shù)量少[25]。但近幾年，有相關(guān)研究報道稱在鐵皮石斛中檢測分離到石斛堿，如李海濤等[26]從云南產(chǎn)鐵皮石斛組培苗中提取到石斛堿，提取率分別為根（0.06%）、莖（0.34%）、葉（0.00%）;徐德林等[27]對采集到的9個來自云南和浙江不同石斛樣品中石斛堿含量進(jìn)行測定，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，不同石斛種之間的石斛堿含量具有較大的差異。其中，金釵石斛干燥莖中石斛堿含量均高于6.0 mg/g，而鐵皮石斛中石斛堿含量僅為金釵石斛的12%～46%;楊洋等[28]、葛穎華等[29]也在鐵皮石斛中檢測到石斛堿的存在。在其他研究相對較少的石斛品種中，也發(fā)現(xiàn)了石斛堿的存在。如姚春等[30]對燈籠石斛組的7個石斛品種進(jìn)行化學(xué)成分測定，發(fā)現(xiàn)在密花石斛（D.densiflorum Lindl.）（0.07%）和聚石斛（D.lindleyi Stendel）（0.02%）中檢測到石斛堿的存在，且含量較低。

隨著人工組培技術(shù)的發(fā)展，對于石斛品種的道地性產(chǎn)生了一定的沖擊和影響，加之石斛種類繁多、種質(zhì)混雜，故造成以上現(xiàn)象的產(chǎn)生。筆者建議，未來可加大對于石斛品種鑒定的研究力度，如生物學(xué)特性分析、特征指紋圖譜構(gòu)建以及DNA條形碼鑒定等;同時，在結(jié)合對石斛道地性的考慮分析基礎(chǔ)上，規(guī)范石斛組培技術(shù)的標(biāo)準(zhǔn)化，保障石斛組培苗質(zhì)量。

2.2?不同植株部位對石斛堿的影響

莖作為石斛的入藥部位，富含豐富的石斛堿，而研究表明，在金釵石斛的葉片、花和根中也檢測到石斛堿的存在。王憲楷等[31]對栽培在10種木本植物上以及生長于石縫間的金釵石斛中石斛堿的含量進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)石斛堿含量莖>葉的石斛栽培附生植物為烏柏、油桐、柿、楓楊、李和四川虎皮楠，莖<葉的有棗、杏、香椿和梨，而石縫間野生的金釵石斛中石斛堿含量最高，分別為莖中含石斛堿（3.18%）、葉（0.83%）、根（0.08%）;胡志剛等[32]研究發(fā)現(xiàn)，貴州赤水金釵石斛中石斛堿的含量分布規(guī)律為莖（0.63%）>花（0.45%）;李華云等[33]研究發(fā)現(xiàn)，四川瀘州和貴州赤水產(chǎn)的金釵石斛，只有莖中的石斛堿含量符合《中國藥典》規(guī)定，而葉和根中的石斛堿含量遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于《中國藥典》標(biāo)準(zhǔn)?？傮w來說，石斛莖中石斛堿含量較石斛其他部位的含量高，再一次佐證了傳統(tǒng)醫(yī)藥學(xué)以及《中國藥典》中以石斛莖入藥的依據(jù)。

2.3?不同栽培條件對石斛堿的影響

目前對于石斛屬植物的主要栽培方式可分為野生栽培、仿野生栽培以及人工溫室種植三大類型。徐曉林等[34]對采集自17個不同地區(qū)的野生金釵石斛中石斛堿的含量進(jìn)行分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，廣西百色產(chǎn)金釵石斛中石斛堿含量高于其他地區(qū)，云南、貴州以及緬甸地區(qū)產(chǎn)金釵石斛中石斛堿含量差異較小，而西藏、四川以及海南地區(qū)金釵石斛中石斛堿含量未能達(dá)到藥典規(guī)定的0.40%;李文濤等[35]利用偏最小二乘回歸法（PLS）對16份采集自不同省份的金釵石斛中化學(xué)成分及其與生態(tài)因子的相關(guān)性進(jìn)行研究，結(jié)果表明，石斛堿含量為貴州（0.28 mg/g）>廣西（0.25 mg/g）>云南（0.24 mg/g）>四川（0.23 mg/g）。年降水量與石斛堿含量呈最大正相關(guān)性，其次為日照時長;土壤類型與石斛堿含量呈最大負(fù)相關(guān)，其次為濕度。VIP直方圖表明，土壤類型（1.730）、年降水量（1.592）和年均溫（1.041）的權(quán)重系數(shù)>1，為影響石斛堿含量積累的主導(dǎo)因子;李在軍等[36]研究發(fā)現(xiàn)，林下仿野生環(huán)境栽培的金釵石斛中石斛堿含量（0.18%）高于溫室內(nèi)栽培的石斛（0.15%）;王憲楷等[31]研究發(fā)現(xiàn)，石縫間野生的金釵石斛中石斛堿含量較高，優(yōu)于樹上栽培的石斛;任紅等[37]研究發(fā)現(xiàn)，金釵石斛中石斛堿的含量分布為仿野生貼石栽培（0.82%）>仿野生貼樹（0.60%）>大棚離地床栽（0.53%），這一結(jié)果與王憲楷研究結(jié)果相一致;牛曉娟等[38]研究發(fā)現(xiàn)，培養(yǎng)溫度、培養(yǎng)天數(shù)、初始pH以及搖床轉(zhuǎn)速均能對金釵石斛懸浮培養(yǎng)細(xì)胞中的石斛堿含量產(chǎn)生一定的影響;Jin-ling Li等[39]對培養(yǎng)在溫室中不同培養(yǎng)條件下的金釵石斛中石斛堿含量進(jìn)行研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，石斛莖中石斛堿含量在光照強(qiáng)度為75.02%時達(dá)到最高，而石斛葉片中石斛堿的含量在光照強(qiáng)度為39.74%時達(dá)到最高;魏明等[40]研究發(fā)現(xiàn)，硝酸鑭濃度為5.0 mg/L時，可提高金釵石斛中多糖和石斛堿的含量;倪竹君等[41]研究發(fā)現(xiàn)，石斛組培苗經(jīng)5-氮雜胞苷（5-azaC）處理后，其石斛堿含量在每克干重材料中的占比在處理60 d和90 d后，分別達(dá)到0.17 mg/g和0.18 mg/g，為對照組的1.5、1.6倍;薛敏等[42]研究發(fā)現(xiàn)，利用不同種類的葉面肥對金釵石斛幼苗進(jìn)行噴施處理之后，石斛莖中石斛堿含量依次為沼液肥（0.23%）>葉面肥1（0.17%）>葉面肥2（0.14%）>多元素復(fù)合肥（0.13%），與對照組（清水處理，0.09%）相比，分別增加石斛堿含量：155.56%、88.89%、55.56%、44.44%。由此可見，藥用石斛屬植物的產(chǎn)地、生態(tài)環(huán)境因子（土壤類型、年降水量、年均溫、日照時長、濕度等）、附生基質(zhì)（巖壁、數(shù)載、棚栽等）以及人工栽培時的培養(yǎng)條件（光照強(qiáng)度、肥料、培養(yǎng)溫度、稀土元素、DNA化學(xué)修飾等）均能對其藥效成分產(chǎn)生一定的影響。

2.4?不同采收期對石斛堿的影響

《中國藥典》中注明，金釵石斛、鼓槌石斛（D.?chrysotoxum）、流蘇石斛及其近似種的新鮮或干燥莖全年均可采收，而建議鐵皮石斛的干燥莖在11月至翌年3月進(jìn)行采收[4]，不同采收期會對石斛屬植物中活性成分的含量產(chǎn)生一定的影響。蔡偉等[43]比較測定同一產(chǎn)地金釵石斛莖中石斛堿含量，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，1年生（0.55%）>2年生（0.40%）>4年生（0.36%）>3年生（0.35%）;劉楊等[44]研究發(fā)現(xiàn)，1年生金釵石斛莖中石斛堿含量最高（0.90%），第2年進(jìn)入生長期之后，其含量開始逐漸下降，最低為0.40%;顏壽等[45]研究發(fā)現(xiàn)，四川省合江縣產(chǎn)的不同生長年限金釵石斛中石斛堿的含量依次為1年生（0.48%）>2年生（0.44%）>3年生（0.22%）。從石斛的采收月份來看，蔡莉等[46]研究發(fā)現(xiàn)，貴州省赤水市旺隆鎮(zhèn)鴨嶺村和紅花村產(chǎn)的2年生金釵石斛莖中石斛堿含量在12月均達(dá)到最高值，分別為0.70%和0.64%，在8月（0.40%）和9月（0.41%）達(dá)到最低值;李金玲[47]研究發(fā)現(xiàn)，1年生金釵石斛莖中石斛堿含量變化波動較大，出現(xiàn)了2次升高：第一次是在3—6月，石斛堿含量發(fā)生迅速的升高;第二次是在10—12月，石斛堿含量緩慢地升高;2年生金釵石斛莖中石斛堿含量在11月已超過《中國藥典》規(guī)定的0.40%、12月含量為0.49%、翌年1月含量超過0.50%，而2月含量卻低于0.40%。

總體來說，相比于其他年份采收的石斛屬植物而言，1年生該屬植物中石斛堿含量最高，具有較高的藥用價值。但是，由于人工栽培的石斛屬植物生產(chǎn)周期較長，石斛堿含量隨生長時間的動態(tài)變化規(guī)律還有待進(jìn)一步的深入研究。故而，在確定石斛屬植物的合理采收期時，不應(yīng)該僅僅以多糖、生物堿或石斛堿等某個單一指標(biāo)來確定，應(yīng)結(jié)合石斛生長特性以及干物質(zhì)的積累量、藥效成分含量等多項指標(biāo)進(jìn)行綜合考慮。

2.5?不同加工方式對石斛堿的影響

石斛通常以其新鮮或干燥莖入藥，對其加工方式主要有煎煮、榨汁、干燥、潤蒸、粉碎以及制成各種石斛藥品或石斛保健品，如復(fù)方石斛片、石斛夜光丸、石斛花茶等。不同的加工方式會導(dǎo)致石斛制品中藥效成分含量的不同。朱南南等[48]研究發(fā)現(xiàn)，貴州赤水4個基地的金釵石斛干品和鮮品中石斛堿含量各有高低，但經(jīng)過配對t檢驗處理，發(fā)現(xiàn)整體上差異不顯著;錢桂敏等[49]研究發(fā)現(xiàn)，不同的干燥方法對金釵石斛中石斛堿含量影響依次為冷凍干燥法（0.45%）>傳統(tǒng)烘干法（0.43%）>熱風(fēng)循環(huán)干燥法（0.42%）;黎恩立[50]首次對金釵石斛進(jìn)行超微粉碎加工，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，超微粉和普通粉的多糖溶出率分別為0.284 8 g/g 和0.193 6 g/g，而石斛堿的溶出率分別為0.003 5 g/g和0.003 3 g/g;孫蕓等[51]在小議石斛的煎煮方式時提到，石斛中的有效成分主要為難溶于水的生物堿，故為了提高石斛的臨床療效，建議在煎藥時先煎1～2 h后再與其他藥一起煎煮，以免造成不必要的浪費(fèi);歐德明等[52]研究發(fā)現(xiàn)，不同炮制方法對石斛堿含量的影響依次為白酒潤蒸（0.28%）>蒸制品（0.23%）>黃酒潤蒸（0.23%）>黃酒炙品（0.22%）>白酒炙品（0.22%）>石斛干品（0.18%）。由此可見，酒是較好的溶劑，能顯著提高生物堿等藥用植物中多種有效成分的溶出率，因此，在對藥用石斛加工時，建議可先以酒炙方法進(jìn)行炮制，以增加其有效成分的溶出率，縮短煎煮的時間[53]。同時，使用超微粉碎技術(shù)對石斛屬植物進(jìn)行加工，雖然石斛堿的得率差異不大，但是卻大大提升了石斛多糖的溶出率，而且普通粉和超微粉表現(xiàn)出相似的紅外光譜吸收，說明其有效成分在超微粉碎過程中并沒有被破壞，故超微粉碎技術(shù)也不失為藥用石斛屬植物的一種有效加工方式。隨著現(xiàn)代加工技術(shù)的不斷發(fā)展，石斛屬植物的加工方式也在不斷地進(jìn)行著改進(jìn)和完善，特別是其干燥方式。建議將來可對傳統(tǒng)的單一加工技術(shù)以不同的方式進(jìn)行組合優(yōu)化，以達(dá)到生產(chǎn)成本與產(chǎn)品質(zhì)量之間的穩(wěn)態(tài)平衡，進(jìn)一步提高中草藥植物藥用功效成分提取利用率。

3?石斛堿的合成途徑

自1970年Kaneko等[54]首次以二氫黃蒿萜酮為起始材料合成了石斛堿的三環(huán)骨架結(jié)構(gòu)以來，對石斛堿的人工合成途徑報道從未間斷。王亞蕓等[7]對石斛堿的人工合成途徑進(jìn)行了詳細(xì)的綜述。隨著現(xiàn)代科學(xué)技術(shù)的發(fā)展進(jìn)步，對于石斛堿的人工合成途徑進(jìn)行著不斷地完善和改進(jìn)。Padwa等[55]使用呋喃甲酸酯的IMDAF環(huán)加成/重排序列完成了（±）-Dendrobine的正式合成，將重新排列的環(huán)加合物轉(zhuǎn)化為Kende的高級中間體只需要8個步驟;Hu等[56]利用手性催化劑（20 moL%催化劑ent-8）在甲苯中反應(yīng)48 h，從非手性組分的Diels-Alder反應(yīng)中得到手性產(chǎn)物，為通過Kende反應(yīng)進(jìn)行（—）-Dendrobine的對映選擇性合成開辟了新的道路;Kreis等[57]報道了一種（—）-Dendrobine的不對稱合成途徑，總共需要18步，總得率為4.0%，大大改善了以往的任何合成途徑的產(chǎn)量;Lee等[58]開發(fā)了一種可以快速得到石斛堿核心結(jié)構(gòu)的過渡金屬催化級聯(lián)工藝，并可避免不穩(wěn)定中間體的生成;Guo等[59]報道了一種只需要12步（總得率：6.7%）或者11步（總得率：3.8%）對映選擇性全合成左旋石斛堿（—）-Dendrobine的方法。

20世紀(jì)70年代以來，對于石斛堿化學(xué)合成途徑的研究從未間斷，為化學(xué)合成藥物提供了較好的基礎(chǔ)。但是目前石斛堿發(fā)揮其藥用功效的主要途徑仍然以食用含有石斛堿的藥用石斛屬植物的新鮮或干燥莖為主，故如何提高石斛堿在藥用石斛屬植物中的含量仍需加以關(guān)注。

朱勝男[60]利用茉莉酸甲酯（Me JA）、水楊酸（SA）、一氧化氮供體（SNP）三種信號分子對金釵石斛組培苗進(jìn)行處理，并比較測定其石斛堿含量，通過構(gòu)建cDNA文庫以及采用實時熒光定量PCR技術(shù)，篩選到2個參與金釵石斛中石斛堿代謝合成途徑的關(guān)鍵酶基因：托品酮還原酶基因Dn TRI和Dn TRII;李金玲[47]以石斛堿含量存在顯著差異的不同時期金釵石斛莖為樣本，進(jìn)行數(shù)字基因表達(dá)譜（DGE）的測序，同時構(gòu)建金釵石斛轉(zhuǎn)錄組文庫，對不同時期金釵石斛莖中的差異表達(dá)基因（DEGs）進(jìn)行分析，對DEGs的數(shù)量、功能和表達(dá)模式進(jìn)行比較分析，系統(tǒng)篩選石斛堿合成代謝途徑上的相關(guān)基因，并通過實時熒光定量PCR技術(shù)進(jìn)行驗證。最終篩選出5個參與石斛堿合成途徑的關(guān)鍵酶基因：甲羥戊酸激酶（MVK）基因（Unigene1219）、賴氨酸甲基化酶基因（CL429）、異戊烯焦磷酸異構(gòu)酶（IDI）基因（CL3435）、法尼基轉(zhuǎn)移酶基因（CL11407）和半胱氨酸甲基酯酶基因（CL8067）。初步提出了石斛堿的萜類合成途徑為：先按照萜類化合物形成的共同途徑至單萜[甲羥戊酸（MVA）途徑和2-C-甲基-D-赤蘚醇-4-磷酸（MEP）途徑]，再按照倍半萜途徑進(jìn)行生物合成。

從植物內(nèi)生菌方面著手，研究石斛堿合成途徑也不失為一條很好的研究策略。閆浩利等[61]研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)菌根真菌MF23（Mycena sp.）處理后的組培苗石斛堿含量比對照組高15.69%。Li等[62]結(jié)合轉(zhuǎn)錄組高通量測序以及實時熒光定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（qRT-PCR）對真菌MF23影響石斛堿的作用機(jī)制進(jìn)行了探究，結(jié)果顯示，與石斛堿倍半萜骨架形成相關(guān)的乙酰輔酶A?；D(zhuǎn)移酶（AACT）、焦磷酸甲羥戊酸脫羧酶（MVD）、磷酸甲羥戊酸激酶（PMK）和萜烯合酶（TPS21）基因在真菌MF23接種9周后表達(dá)水平發(fā)生顯著變化，推測MF23可能通過調(diào)節(jié)參與甲羥戊酸途徑的基因表達(dá)來影響石斛堿的生物合成，為石斛堿合成途徑的研究奠定了基礎(chǔ)。該團(tuán)隊在近幾年中利用反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（RT-PCR）和cDNA末端快速擴(kuò)增（RACE）技術(shù)，從金釵石斛中分離克隆得到3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A合酶（HMGS）基因：Dn HMGS（KX789180）;3-羥基-3-甲基戊二酸單酰輔酶A還原酶（HMGR）基因：Dn HMGR2（KX825920）;MVD基因：Dn MVD（KY626328），并進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，克隆到的基因均受到菌根真菌MF23的調(diào)控，為進(jìn)一步解析菌根真菌MF23對金釵石斛中石斛堿合成代謝途徑調(diào)控機(jī)制奠定了研究基礎(chǔ)[63-65]。

植物的次生代謝一般都涉及很多條轉(zhuǎn)錄因子、關(guān)鍵基因及其對應(yīng)酶的相互協(xié)同表達(dá)。隨著現(xiàn)代生物分子技術(shù)的發(fā)展，對植物次級代謝產(chǎn)物合成途徑上的關(guān)鍵基因進(jìn)行超表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)次生代謝產(chǎn)物的生成已成為研究的熱點。石斛堿基本骨架為含15個碳原子、有一個五元內(nèi)酯環(huán)型倍半萜類生物堿，目前石斛堿合成途徑尚不清晰，僅見于少量對石斛堿合成途徑上關(guān)鍵酶基因相關(guān)的研究，迄今為止共篩選出11個參與石斛堿合成途徑的關(guān)鍵酶基因，對于石斛堿復(fù)雜的代謝合成途徑仍需要開展大量研究工作。

4?展望

在中草藥的品種、栽培、收獲、加工以及貯存等工作程序中，只有以中草藥有效成分的“質(zhì)”和“量”為前提，才能確保中草藥應(yīng)有的療效。石斛堿具有神經(jīng)系統(tǒng)保護(hù)、清熱止痛、抗炎癥、心血管保護(hù)、抗癌以及抗甲型流感病毒等藥用功效，具有很好的挖掘潛力與應(yīng)用前景，但我們在關(guān)注石斛堿藥用功效的同時，也應(yīng)該對其毒理性進(jìn)行相關(guān)的研究，從而能夠合理、高效地發(fā)揮其藥用價值。雖然對影響石斛中石斛堿含量的因素已有相當(dāng)多的研究報道，但是也存在一定的局限性：（1）所收集的材料是否具有地區(qū)代表性有待考究;（2）大多數(shù)材料都是野生石斛，生長的年限無法得到統(tǒng)一控制;（3）石斛種類繁多、種質(zhì)混雜，石斛品種鑒定有待進(jìn)一步的考究;（4）檢測方法的不同也會對石斛堿的含量造成一定的影響。因此，目前研究結(jié)果只能在一定程度上根據(jù)所收集的材料對不同藥用石斛屬植物的品質(zhì)做出預(yù)測，為其新育種技術(shù)在一定程度上提供理論支持。目前，我國獲取中藥藥效成分的方法主要是依賴于從藥用植物中直接提取分離，但藥用植物的栽培易受產(chǎn)地、氣候、品種以及病蟲害等的影響，進(jìn)而導(dǎo)致藥用活性成分產(chǎn)量和質(zhì)量的不穩(wěn)定。故應(yīng)加大對石斛堿在植物體內(nèi)生物合成途徑的研究力度，明確關(guān)鍵酶基因，通過基因表達(dá)調(diào)控、轉(zhuǎn)基因等手段實現(xiàn)其在植株中的高效合成，或者通過合成生物學(xué)技術(shù)實現(xiàn)石斛堿的異源生物合成，進(jìn)而提高藥用石斛屬植物中石斛堿的含量，為中藥資源的可持續(xù)利用發(fā)展提供重要的科學(xué)意義和應(yīng)用價值。

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