高源，王大江，王昆，叢佩華，李連文，樸繼成

（中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院果樹研究所/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部園藝作物種質(zhì)資源利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，遼寧興城 125100）

0 引言

【研究意義】蘋果屬（MalusMill.）為薔薇科（Rosaceae）植物，世界蘋果屬植物資源約35個(gè)種[1-2]，主要分布于北溫帶，橫跨歐亞大陸和北美洲；而原產(chǎn)中國的有27個(gè)種，其中野生近緣種21種、栽培種6種[3]。研究分析蘋果屬植物不同種的遺傳結(jié)構(gòu)，探討其遺傳多樣性，是揭示物種的進(jìn)化歷史[4-5]、分析其進(jìn)化潛力和未來命運(yùn)[6]、探討物種稀有或?yàn)l危原因[7-8]的重要方法，對制訂種質(zhì)資源保護(hù)策略、指導(dǎo)核心種質(zhì)資源篩選和相關(guān)優(yōu)異基因挖掘具有重要意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】分子標(biāo)記是揭示不同品種間遺傳多樣性和親緣關(guān)系的有效手段[9]，RAPD[10]、AFLP[11]等分子標(biāo)記曾被用于蘋果的遺傳多樣性分析，SSR分子標(biāo)記被認(rèn)為是動植物中最重要的標(biāo)記之一[12]，在蘋果遺傳多樣性研究中應(yīng)用最為廣泛[13]。SNP即單核苷酸多態(tài)性，是由單個(gè)核苷酸變異引起的 DNA序列多態(tài)性，SNP標(biāo)記是目前所有DNA分子標(biāo)記中多樣性最為豐富的標(biāo)記。研究SNP最徹底、最精確的方法即為直接測定某特定區(qū)域的核苷酸序列，與參照基因組中對應(yīng)區(qū)域的核苷酸序列進(jìn)行比較，從而檢測出具有多態(tài)性的單個(gè)核苷酸變異。SNP基因型鑒定已經(jīng)被應(yīng)用到許多作物的遺傳結(jié)構(gòu)分析、遺傳多樣性評價(jià)和遺傳連鎖圖譜的構(gòu)建[14-15]。CHAGNE等[16]利用EST-SNP標(biāo)記的方法對蘋果基因進(jìn)行了研究?，F(xiàn)代測序技術(shù)的發(fā)展，蘋果全基因組測序的完成，對于SNP在蘋果研究中的應(yīng)用具有重要的推動作用。MICHELETTI等[17]對 27份蘋果屬種質(zhì)進(jìn)行測序，并篩選出237個(gè)SNP標(biāo)記研究 260份蘋果品種的遺傳多樣性并構(gòu)建遺傳連鎖圖譜。常源升等[18]、SUN等[19]和孫瑞[20]分別將SNP分子標(biāo)記的方法用于蘋果果形和果實(shí)品質(zhì)相關(guān)基因的主基因分析與QTL定位分析，劉更森[21]利用SNP標(biāo)記構(gòu)建了蘋果遺傳圖譜。隨著蘋果參考基因組的發(fā)表[22-24]，結(jié)合現(xiàn)代測序技術(shù)，有利于在全基因組范圍內(nèi)尋找多態(tài)的SNP分子標(biāo)記用于蘋果屬植物種質(zhì)資源遺傳多樣性研究，對于其保存和利用具有重要意義[25]。SLAF-seq（Specific Locus Amplified Fragment Sequencing）是一種高通量的簡化基因組深度測序技術(shù)，通過生物信息學(xué)方法設(shè)計(jì)最佳試驗(yàn)方案，在測序獲得海量特異性長度的DNA片段（SLAF標(biāo)簽）基礎(chǔ)上，在全基因組范圍開發(fā)出大量特異性SNP標(biāo)記。其已經(jīng)被應(yīng)用到多種作物，如水稻[26]、甘薯[27]、金花茶[28]和葡萄[29]等的SNP標(biāo)記開發(fā)中，陶紅霞[30]基于SLAF技術(shù)開發(fā)SNP構(gòu)建蘋果遺傳連鎖圖譜?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】隨著近些年國家蘋果資源圃蘋果屬植物種質(zhì)資源收集和保存工作的不斷深入，國家蘋果資源圃保存了大量待鑒定的蘋果屬植物種質(zhì)資源，可在 SLAF-seq基礎(chǔ)上從全基因組開發(fā) SNP標(biāo)記研究蘋果屬植物不同種的親緣關(guān)系和遺傳結(jié)構(gòu)?！緮M解決的關(guān)鍵問題】本研究在對國家蘋果種質(zhì)資源圃保存的15個(gè)種的427份蘋果屬植物種質(zhì)資源進(jìn)行高通量簡化基因組測序基礎(chǔ)上，開發(fā)SNP標(biāo)記，解析15種蘋果屬植物種內(nèi)和種間的親緣關(guān)系和遺傳結(jié)構(gòu)，探討不同種間的系統(tǒng)演化關(guān)系，為不同種蘋果屬植物的鑒定評價(jià)以及進(jìn)一步收集和保存提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

427份蘋果種質(zhì)材料中有25份取自國家果樹種質(zhì)公主嶺寒地果樹圃（吉林省公主嶺），1份滇池海棠和1份滄江海棠取自國家果樹種質(zhì)云南特有果樹及砧木圃（云南省昆明），其余400份材料均取自國家果樹種質(zhì)興城梨、蘋果圃（遼寧省興城市）。427份種質(zhì)分屬于蘋果屬的15個(gè)種，供試各種名稱及種質(zhì)來源見表1。于2017年春季采集健康幼嫩葉片，葉片經(jīng)硅膠干燥之后備用。

表1 用于SLAF測序分析的15個(gè)種蘋果屬植物種質(zhì)資源Table 1 Fifteen species of Malus Mill.germplasm resources for SLAF-seq analysis

1.2 基因組DNA的提取

采用德國QIAGEN的DNeasy Plant Mini Kit提取供試材料春季嫩葉的基因組DNA。分別用1%的瓊脂糖凝膠電泳和超微量紫外分光光度計(jì)（美國DeNovix，DS-11 型）檢測其濃度和純度，對照 λDNA（40 ng·μL-1）將提取基因組的DNA濃度調(diào)整到100 ng·μL-1，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 酶切預(yù)測

以 2010年已經(jīng)發(fā)表的蘋果基因組作為參考基因組進(jìn)行酶切預(yù)測。參考基因組信息：蘋果（Malus pumilaMill.）基因組[22]（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/?term=apple），組裝出的基因組大小為1 874.77 Mb，GC含量為45.32%。利用SLAF-predict軟件，通過蘋果基因組進(jìn)行方案預(yù)測，確定酶切組合并進(jìn)行酶切。

1.4 測序及數(shù)據(jù)開發(fā)

將獲得酶切片段的3′端進(jìn)行加A處理，在加有polyA的酶切片段上連接測序接頭，經(jīng)過PCR擴(kuò)增和切膠回收目的片段，構(gòu)建文庫。在 Illumina HiSeqTM2500（美國Illumina公司，HiSeq 2500型）上對檢驗(yàn)合格的文庫進(jìn)行測序，測序結(jié)果經(jīng)過去接頭、低質(zhì)量閱讀框和污染處理而獲得干凈序列即SLAF標(biāo)簽。評估測序獲得序列的GC含量和Q30指標(biāo)，檢驗(yàn)測序質(zhì)量。

在不同樣品間有差異的 SLAF標(biāo)簽即為多態(tài)性SLAF標(biāo)簽。通過BWA軟件[31]將SLAF標(biāo)簽與蘋果參考基因組[22]以及在不同樣品間進(jìn)行比對，將其定位到參考基因組上獲得多態(tài)性的 SLAF標(biāo)簽。利用GATK[32]和SAMtools[33]兩種方法在多態(tài)性SLAF中開發(fā) SNP，篩選兩種方法共同得到的 SNP作為開發(fā)的SNP標(biāo)記數(shù)據(jù)集。根據(jù)完整度＞0.94，次要等位基因頻率（MAF）＞0.05過濾[34]，篩選多態(tài)性的SNP，用于進(jìn)一步的數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)和分析。

1.5 群體遺傳結(jié)構(gòu)和親緣關(guān)系分析

基于篩選的多態(tài)性 SNP，使用 MEGA 7[35]的 NJ（neighbor-joining）算法[36]，構(gòu)建蘋果屬不同種的系統(tǒng)進(jìn)化樹。不同種間的遺傳距離大小用系統(tǒng)進(jìn)化樹的分支長度體現(xiàn)，長度越短即代表兩份種質(zhì)之間的親緣關(guān)系越近。利用Admixture軟件[37]進(jìn)行群體遺傳結(jié)構(gòu)分析，假設(shè)樣品的分群數(shù)（K）為 1—15進(jìn)行聚類，根據(jù)交叉驗(yàn)證錯(cuò)誤率確定分群數(shù)。

2 結(jié)果

2.1 建庫和測序質(zhì)量評估

利用 SLAF-predict軟件，參照2010年蘋果基因組進(jìn)行酶切預(yù)測，確定選擇RsaI+HaeIII酶組合進(jìn)行酶切，篩選SLAF標(biāo)簽長度范圍為314—414 bp，共預(yù)測到151 808個(gè)SLAF標(biāo)簽，SLAF標(biāo)簽在基因組上基本分布均勻。以水稻的測序數(shù)據(jù)（http://rapdb.dna.affrc.go.jp/）為對照進(jìn)一步評估酶切的有效性和酶切效率，將水稻的測序數(shù)據(jù)與蘋果參考基因組進(jìn)行比對，雙端比對效率為 95.19%，酶切效率為 92.79%，酶切反應(yīng)正常，SLAF建庫正常。

對所有供試蘋果屬植物種質(zhì)測序共獲得1 276.7 Mb的讀長數(shù)據(jù)，各種質(zhì)樣品獲得的讀長數(shù)目在 1 189 223—1 968 102 bp，測序平均Q30為91.58%，所有測序樣品的Q30值均在80%以上；平均GC含量為40.04%，GC含量普遍較低。用于評估試驗(yàn)建庫準(zhǔn)確性的水稻測序獲得0.45 Mb數(shù)據(jù)量。測序結(jié)果的堿基錯(cuò)誤率低，測序數(shù)據(jù)達(dá)到要求。

2.2 SLAF標(biāo)簽與多態(tài)性SNP標(biāo)記篩選

對427份蘋果屬植物種質(zhì)測序獲得586 454個(gè)SLAF標(biāo)簽，平均測序深度為 6.42 X。通過 BWA軟件比對獲得463 612個(gè)多態(tài)性SLAF標(biāo)簽，開發(fā)5 896 021個(gè)群體SNP，根據(jù)完整度＞0.94、MAF＞0.05過濾，共得到46 460個(gè)多態(tài)性SNP位點(diǎn)，用于后續(xù)的群體結(jié)構(gòu)分析。根據(jù)篩選的多態(tài)性 SNP在染色體上的分布，繪制多態(tài)性的 SNP在染色體上的分布圖（圖1）。

2.3 基于SNP標(biāo)記的蘋果屬植物親緣關(guān)系分析

以每個(gè)種作為一個(gè)種群，基于每個(gè)種群的 SNP標(biāo)記用 MEGA7計(jì)算蘋果屬各種間的遺傳距離（表2）。蘋果屬植物兩兩種間的遺傳距離為0—1.000，其中花葉海棠與變?nèi)~海棠、麗江山荊子、滇池海棠、湖北海棠、滄江海棠、隴東海棠和山楂海棠間的遺傳距離均為1.000；變?nèi)~海棠與湖北海棠、滇池海棠、滄江海棠、隴東海棠、麗江山荊子和山楂海棠間的遺傳距離均為0.000；麗江山荊子與滇池海棠、湖北海棠、滄江海棠、隴東海棠和山楂海棠間的遺傳距離均為0.000；滇池海棠與湖北海棠、滄江海棠，隴東海棠和山楂海棠間的遺傳距離均為0.000，湖北海棠與滄江海棠、隴東海棠和山楂海棠間的遺傳距離均為0.000；滄江海棠與隴東海棠和山楂海棠，隴東海棠和山楂海棠間的遺傳距離均為0.000。以種間遺傳距離做15個(gè)種的系統(tǒng)發(fā)育樹（圖2），15個(gè)種明顯分為 4個(gè)類群，類群Ⅰ為隴東海棠、山楂海棠、滇池海棠、滄江海棠、湖北海棠、麗江山荊子和變?nèi)~海棠，類群Ⅱ?yàn)樯角G子，類群Ⅲ為垂絲海棠、楸子、花紅和八棱海棠，類群Ⅳ為中國蘋果、新疆野蘋果和花葉海棠。

圖1 多態(tài)性的SNP在染色體上的分布Fig.1 The distribution of polymorphic SNP in 17 chromosomes

表2 基于SNP的蘋果屬植物15個(gè)種間的遺傳距離Table 2 Genetic distance of 15 species of Malus Mill.based on SNP

圖2 基于SNP位點(diǎn)的蘋果屬15個(gè)種的進(jìn)化樹Fig.2 Polygenetic tree of 15 species of Malus Mill.based on SNP

2.4 基于SNP標(biāo)記的蘋果屬植物的遺傳結(jié)構(gòu)分析

群體遺傳結(jié)構(gòu)分析能夠獲得個(gè)體的血統(tǒng)來源及其組成信息，是遺傳關(guān)系分析的一種重要手段。運(yùn)用Admixture軟件，分析 427份蘋果屬植物種質(zhì)基于多態(tài)性SNP的遺傳結(jié)構(gòu)。分別假設(shè)427份種質(zhì)的分群數(shù)（K值）為1—15（圖3），進(jìn)行聚類。根據(jù)交叉驗(yàn)證錯(cuò)誤率，當(dāng)K=5的時(shí)候，交叉驗(yàn)證錯(cuò)誤率有明顯降落，應(yīng)該為確定分群數(shù)的一個(gè)關(guān)鍵點(diǎn)，首先確定所有供試蘋果屬植物的分群數(shù)為5，來自于5個(gè)可能的原始祖先。隨著進(jìn)一步的分化，當(dāng)K=14時(shí)，交叉驗(yàn)證錯(cuò)誤率最小，因此確定最佳分群數(shù)為14，反映了這些蘋果屬植物種質(zhì)分化后可能來自于 14個(gè)祖先。從 K=1—14的群體遺傳結(jié)構(gòu)分析見圖4。

圖3 每個(gè)K值對應(yīng)的交叉驗(yàn)證錯(cuò)誤率Fig.3 Cross validation error rates corresponding to every K values

當(dāng)確定分群數(shù)為5時(shí)，類群Ⅰ包含25份種質(zhì)，有3份變?nèi)~海棠、3份垂絲海棠、1份麗江山荊子、1分新疆野蘋果和17份山荊子，其中有7份山荊子的Q值為1.000，這7份山荊子代表該類群的基因庫（藍(lán)色基因庫）。類群Ⅱ包含190份種質(zhì)，有1份八棱海棠、1份垂絲海棠、4份花紅、5份楸子、1份山荊子、20份中國蘋果和158份新疆野蘋果，其中有63份新疆野蘋果和1份中國蘋果（新疆）的Q值為1.000，這63份新疆野蘋果和1份中國蘋果代表該類群體的基因庫（綠色基因庫）。類群Ⅲ包含55份種質(zhì)，有3份八棱海棠、1份滄江海棠、2份垂絲海棠、1份滇池海棠、12份花紅、1份花葉海棠、4份隴東海棠、16份楸子、4份山定子、1份山楂海棠和10份中國蘋果，其中有1份八棱海棠、1份花紅、1份山荊子、1份中國蘋果和1份楸子的Q值為1.000，這5份材料代表了該類群的基因庫（淡綠色基因庫）。類群Ⅳ包含119份種質(zhì)，有2份八棱海棠、3份垂絲海棠、1份湖北海棠、2份楸子、2份新疆野蘋果、2份中國蘋果和107份山荊子，其中有26份山荊子的Q值為1.000，26份山荊子代表了該類群的基因庫（黃色基因庫）。類群Ⅴ包括39份種質(zhì)，有28份八棱海棠、3份花紅、2份楸子、4份山定子和1份中國蘋果，其中16份八棱海棠和1份楸子的Q值為1.000，該17份種質(zhì)代表了該類群的基因庫（淺黃色基因庫）。

圖4 427份15種蘋果屬植物種質(zhì)群體遺傳結(jié)構(gòu)（K=5和K=14）Fig.4 The genetic structure of 427 accessions of 15 species of Malus Mill.(K=5 and K=14)

當(dāng)確定分群數(shù)為14時(shí)，類群1包含24份種質(zhì)，有14份八棱海棠、3份花紅、1份楸子、1份山荊子和5份中國蘋果，其中有3份中國蘋果（綿蘋果）的Q值為0.9999，其代表了該類群的基因庫（藏藍(lán)色基因庫）。類群2包含37份種質(zhì)，有1份楸子、1份中國蘋果和35份新疆野蘋果，其中有2份新疆野蘋果的Q值為0.9999，其代表了該類群的基因庫（綠色基因庫）。類群3包含5份種質(zhì)，全部為山荊子，且全部為內(nèi)蒙古收集的山荊子，其Q值全部為0.9999，其代表了該類群的基因庫（淺綠色基因庫）。類群4包含16份種質(zhì)，有10份中國蘋果、2份花紅、2份楸子、1份八棱海棠和1份垂絲海棠，其中有5份中國蘋果（2份綿蘋果和3份檳子）的Q值為0.9999，其代表了該類群的基因庫（淺黃色基因庫）。類群5包含38份種質(zhì)，有1份中國蘋果，其余全部為山荊子，其中有6份山荊子的Q值為0.9999，此6份山荊子全部為內(nèi)蒙古收集到的山荊子，其代表了該類群的基因庫（黃色基因庫）。類群6包含124份種質(zhì)，除4份中國蘋果、1份山荊子和2份楸子外，其余全部為新疆野蘋果，且有11份新疆野蘋果的Q值為0.9999，其代表了該類群的基因庫（深黃色基因庫）。類群7包含了6份種質(zhì)，全部為新疆野蘋果，且Q值全部為0.9999，該類群為由新疆野蘋果全部代表的類群（土黃色基因庫）。類群8包含28份種質(zhì)，有2份花紅、4份山荊子、8份中國蘋果、3份垂絲海棠、8份楸子和3份八棱海棠，其中有1份中國蘋果、1份山荊子、1份花紅、1份楸子和2份八棱海棠的Q值為0.9999，其代表了該類群基因庫（橘色基因庫）。類群9包含12份種質(zhì)，有4份隴東海棠、1份滇池海棠、1份滄江海棠、1份山楂海棠、1份花葉海棠、3份變?nèi)~海棠和1份楸子，其中除 3份變?nèi)~海棠外的 9份種質(zhì)的 Q值全部為0.9999，代表了該類群的基因庫（紅色基因庫）。類群10包含13份種質(zhì)，有4份八棱海棠和9份山荊子，其中占比最重的為深藍(lán)色基因庫，但無純深藍(lán)色基因庫的種質(zhì)，全部為多種基因庫混雜的種質(zhì)。類群 11包含32份種質(zhì)，有1份麗江山荊子、1份花紅、1份中國蘋果、4份垂絲海棠、2份新疆野蘋果和23份山荊子，其中有9份山荊子和1份垂絲海棠的Q值為0.9999，9份山荊子來源于黑龍江和內(nèi)蒙古，其代表了該類群的基因庫（藍(lán)色基因庫）。類群12包含12份種質(zhì)，由 1份楸子和 11份八棱海棠組成，其中有 7份八棱海棠的Q值為0.9999，其代表了該類群的基因庫（淺藍(lán)色基因庫）。類群13包含51份種質(zhì)，除1份垂絲海棠、1份湖北海棠、1份八棱海棠、1份新疆野蘋果和3份楸子外，其余全部為山荊子，其中有5份山荊子的Q值為0.9999，其代表了該類群的基因庫（天藍(lán)色基因庫）。類群 14包含 28份種質(zhì)，由 10份花紅、9份山荊子、3份中國蘋果和6份楸子組成，其中 2份楸子、2份花紅和 1份中國蘋果的Q值≥0.9999，其代表了該類群的基因庫（湖藍(lán)色基因庫）。只由一個(gè)種來代表一個(gè)基因庫的類群有類群 1、類群2、類群3、類群4、類群5、類群6、類群11、類群12、類群13，代表種分別為中國蘋果（綿蘋果）、新疆野蘋果、山荊子（內(nèi)蒙古）、中國蘋果（綿蘋果和檳子）、山荊子（內(nèi)蒙古）、新疆野蘋果、山荊子（黑龍江和內(nèi)蒙古）、八棱海棠、山荊子（黑龍江）。

3 討論

SNP變異通常由單個(gè)核苷酸堿基的替換、較小片段的插入或缺失引起[38]，其類型有單個(gè)堿基的轉(zhuǎn)換、顛換、摻入和缺失以及小片段的摻入缺失（InDel）。大多數(shù)的SNP并不直接體現(xiàn)在表型上，位于基因的非編碼區(qū)，但卻能夠體現(xiàn)群體間的遺傳和生物進(jìn)化關(guān)系，可作為遺傳標(biāo)記而應(yīng)用于動植物的群體遺傳關(guān)系和進(jìn)化研究[39-40]。在動植物研究的諸多方面均有應(yīng)用，諸如果蠅和小鼠[41]等動物以及擬南芥[42]、水稻[43]和小麥[44]等植物。SLAF測序技術(shù)的發(fā)展促進(jìn)了SNP標(biāo)記在多種植物的種質(zhì)資源鑒定、系統(tǒng)發(fā)育、遺傳進(jìn)化以及性狀關(guān)聯(lián)分析中的研究，諸如玉米[45]、小麥[46]、棉花[47]、茶樹[48]、大豆[49]和葡萄[50]等。本研究在 SLAF測序的基礎(chǔ)之上開發(fā)了46 460個(gè)多態(tài)性的SNP標(biāo)記，分析了15種蘋果屬植物的親緣關(guān)系和遺傳結(jié)構(gòu)，探討不同種間和種內(nèi)的系統(tǒng)演化關(guān)系。

基于種群間遺傳距離的系統(tǒng)發(fā)育分析以及群體遺傳結(jié)構(gòu)分析均表明，15種蘋果屬植物分為4個(gè)基本的類群，基于種間遺傳距離進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析時(shí)，花葉海棠與新疆野蘋果的遺傳距離只有0.019，與群體遺傳結(jié)構(gòu)的分析結(jié)果有所偏差，有可能是供試的15個(gè)種在以種作為種群分析時(shí)，各種群內(nèi)個(gè)體數(shù)量差異較大造成的分析結(jié)果有所偏差。

蘋果屬植物的遺傳結(jié)構(gòu)分析中，在K=5和K=14兩種分群情況下，隴東海棠、變?nèi)~海棠、花葉海棠、滇池海棠、滄江海棠和山楂海棠均在同一類群中，基因來源和背景相似。6個(gè)野生種中，除山楂海棠主要分布在中國吉林省長白山地區(qū)，其余5個(gè)種在中國的西南地區(qū)均有野生分布。隴東海棠、變?nèi)~海棠、花葉海棠和山楂海棠葉片均有裂刻，只是裂刻的深淺不一。這6個(gè)蘋果屬植物的野生種可能具有相似的起源種，但在演化過程中逐漸出現(xiàn)分化。

當(dāng)K=5時(shí)，類群2和類群3的中國蘋果中均有來自于山荊子代表的純基因庫（藍(lán)色基因庫）基因，兩個(gè)類群中各有1份中國蘋果種質(zhì)具有該類群的純基因庫，類群3的中國蘋果含有極少量的新疆野蘋果基因。此外，八棱海棠具有純的基因庫，其在遺傳結(jié)構(gòu)中的作用被突顯出來。新疆野蘋果和山荊子都有比較純的基因庫，中國蘋果的基因并不全來自于新疆野蘋果，而有山荊子基因的加入，并與栽培種的關(guān)系密切。

當(dāng)K=14時(shí)的群體遺傳結(jié)構(gòu)分析表明，中國原產(chǎn)蘋果屬植物有9個(gè)比較純的同源基因庫，其中有2個(gè)為中國蘋果的同源基因庫，2個(gè)為新疆野蘋果的同源基因庫，3個(gè)為山荊子的同源基因庫，中國蘋果中的部分綿蘋果和檳子、新疆野蘋果、內(nèi)蒙古和黑龍江的山荊子、八棱海棠代表了較為原始的基因來源。部分中國蘋果的種質(zhì)中有新疆野蘋果和山荊子的基因背景，再次證明部分中國蘋果在起源演化過程中有新疆野蘋果和山荊子的參與，這與 DUAN等[51]的結(jié)論一致。但中國蘋果中還有一部分綿蘋果（主要指彩蘋）和檳子可以獨(dú)立代表類群基因庫，其基因庫中并沒有新疆野蘋果的參與，其所在類群與山荊子以及蘋果屬植物的栽培種花紅、楸子和八棱海棠密切相關(guān)?；t、楸子和八棱海棠與山荊子的親緣關(guān)系更近，與蘋果屬植物其他野生種之間的親緣關(guān)系也近于與新疆野蘋果的親緣關(guān)系。而根據(jù)李育農(nóng)[3]的理論，中國蘋果起源于新疆野蘋果，在中國有近2 000年的栽培歷史，其作為“西洋蘋果”（Malus domesticaBorkh.）引入中國之前的中國特有種，與“西洋蘋果”有著不同的起源和演化過程。分析此種情況產(chǎn)生的原因，一是按照CAO等[52]的理論，人類活動可以造成SNP多態(tài)性的迅速降低。如果蘋果屬植物栽培種中國蘋果起源于新疆野蘋果，在從新疆野蘋果向中國蘋果的演化過程中，由于人為參與活動而使SNP多態(tài)性迅速降低，取而代之的是與其地理位置相近的蘋果屬其他種對其造成的影響；二是中國蘋果中部分類型本身可能也是一個(gè)起源種，其起源演化過程與新疆野蘋果可能并不相關(guān)。此次供試的中國蘋果大多數(shù)來源于中國的華北地區(qū)，來源于廢棄果園旁、靠近果園的山坡或者農(nóng)家院，與新疆野蘋果原始集中分布區(qū)相距甚遠(yuǎn)。即使是人類活動和鳥獸等對新疆野蘋果向中國蘋果的馴化過程有一定影響，也不足以使新疆野蘋果基因在部分供試的中國蘋果中幾乎完全消失。因此，中國蘋果與新疆野蘋果的起源演化關(guān)系有待于進(jìn)一步考究。隨著測序技術(shù)的發(fā)展，全基因重測序成本的降低，全基因組范圍零缺失的SNP標(biāo)記挖掘?qū)橄嚓P(guān)研究提供更多的證據(jù)。

4 結(jié)論

利用SLAF技術(shù)快速挖掘覆蓋全基因組的46 460個(gè)多態(tài)性SNP標(biāo)記，對427份15種中國原產(chǎn)蘋果屬植物種內(nèi)和種間的親緣關(guān)系和遺傳結(jié)構(gòu)進(jìn)行研究。15種蘋果屬植物分為4個(gè)基本的類群，一是山荊子類群，二是新疆野蘋果和少數(shù)中國蘋果類群，三是變?nèi)~海棠、花葉海棠、隴東海棠、山楂海棠、滇池海棠和滄江海棠類群，四是4個(gè)蘋果屬植物栽培種中國蘋果、八棱海棠、花紅和楸子類群。中國原產(chǎn)蘋果屬植物栽培種中國蘋果中部分種質(zhì)的起源演化過程有山荊子和新疆野蘋果的參與，中國蘋果與其他栽培種的親緣關(guān)系密切，其與新疆野蘋果的起源演化關(guān)系有待進(jìn)一步考究。