賈姍姍，駱強(qiáng)偉，李莎莎，王躍進(jìn)

（1西北農(nóng)林科技大學(xué)園藝學(xué)院/旱區(qū)作物逆境生物學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/農(nóng)業(yè)部西北地區(qū)園藝作物生物學(xué)與種質(zhì)創(chuàng)制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，陜西楊凌 712100；2新疆維吾爾自治區(qū)葡萄瓜果研究所，新疆鄯善 838200）

0 引言

【研究意義】無核作為果樹育種的重要性狀之一，因其在不改變果實(shí)大小的情況下可減少種子量，增加水果可食率，進(jìn)而提高水果對食品加工業(yè)的適用性；在增強(qiáng)對消費(fèi)者吸引力的同時，無核果實(shí)又是人類消費(fèi)文明進(jìn)程中的重要需求。葡萄果實(shí)的芳香氣味不但能增加鮮食葡萄的風(fēng)味和口感，其中含有的揮發(fā)性芳香物質(zhì)可以通過味覺及嗅覺被人感知從而產(chǎn)生愉悅感，調(diào)節(jié)人體心理與生理機(jī)能平衡，與人類營養(yǎng)健康密切相關(guān)。目前，無核和香味形成的機(jī)理研究較少，無核和香味性狀結(jié)合的果實(shí)育種更少，因此，結(jié)合無核及香味兩種性狀的新品種研發(fā)十分迫切。隨著現(xiàn)代研究手段與分析技術(shù)不斷完善，帶有香味的無核葡萄逐漸成為國內(nèi)外葡萄育種工作者的主要育種目標(biāo)。目前利用常規(guī)雜交可以實(shí)現(xiàn)無核和香味兩種優(yōu)良性狀的聚合從而育出無核香味新品種，而大田雜交結(jié)合胚挽救技術(shù)可在聚合兩種優(yōu)良性狀的基礎(chǔ)上，擴(kuò)大親本選擇范圍、縮短育種年限，成為育種新手段[1-5]。影響胚挽救效率的主要因素有親本基因型、取樣時間、培養(yǎng)基添加物、培養(yǎng)時間、培養(yǎng)方式等[3,6-9]。利用分子標(biāo)記技術(shù)，通過檢測后代 DNA序列差異直接選擇合適的基因型，加快篩選速度，改變了傳統(tǒng)的田間雜交種表型鑒定法，提高了育種效率?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】自20世紀(jì)90年代固相微萃取技術(shù)（SPME）提出[10]后，隨著質(zhì)譜分析的發(fā)展，近年來固相微萃取結(jié)合氣相質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)（HS-SPME-GC-MS）開始在果實(shí)香氣物質(zhì)測定領(lǐng)域廣泛應(yīng)用[11-12]。目前已有研究證實(shí)葡萄中芳香物質(zhì)的形成存在3種途徑：脂肪酸代謝途徑、氨基酸代謝途徑和萜烯類化合物代謝途徑[13]。隨著控制果實(shí)中萜烯類合成酶及脂肪氧合酶的陸續(xù)發(fā)現(xiàn)，其關(guān)鍵基因也開始被報道。其中，VvDXS是萜類合成的關(guān)鍵酶[14]。萜烯合酶（TPS）為控制萜烯類合成最終產(chǎn)物的酶，在歐洲葡萄中被大量檢測到[15]。研究認(rèn)為萜烯類物質(zhì)是葡萄玫瑰香味的主要呈香物質(zhì)，其形成的香氣，是果實(shí)及其加工的食品中與營養(yǎng)和健康最為密切相關(guān)的物質(zhì)[16-18]。目前大部分無核香味新品種是利用常規(guī)雜交培育的，后代聚集無核、香味等優(yōu)良性狀概率較低，且對父本品種要求較高，自20世紀(jì)70年代開始，國內(nèi)外育出的香味品種共 40余種[19]，而利用胚挽救技術(shù)培育出的無核香味新品種較少。筆者課題組前期選擇帶有玫瑰香味的葡萄品種，通過配置無核×玫瑰香味雜交組合，并利用胚挽救育種技術(shù)，獲得大批帶有玫瑰香味的無核葡萄新種質(zhì)，確定了胚挽救過程中不同母本的雜交組合適宜取樣時間[9,20]?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】近年來無核香味葡萄新品種的育種進(jìn)程比較緩慢。本研究從胚挽救影響的因素出發(fā)，篩選玫瑰香味性狀優(yōu)良親本配置無核品種×玫瑰香味品種的雜交組合；優(yōu)化胚萌發(fā)培養(yǎng)基，對雜種后代進(jìn)行早期無核性狀的輔助篩選?！緮M解決的關(guān)鍵問題】測定香味品種果實(shí)中揮發(fā)性化合物含量以揭示葡萄果實(shí)中決定玫瑰香味的關(guān)鍵物質(zhì)，通過對香味物質(zhì)的定量分析為培育優(yōu)質(zhì)香味葡萄提供重要參考；同時將葡萄香味性狀融入無核品種，通過分子標(biāo)記初步篩選攜帶無核標(biāo)記的雜交后代，進(jìn)而獲得攜帶香味基因的無核新種質(zhì)。通過比較親本基因型對胚挽救結(jié)果的影響和對胚萌發(fā)培養(yǎng)基的篩選與優(yōu)化，提高無核香味葡萄胚挽救效率。

1 材料與方法

試驗(yàn)于2018年5月至2019年5月分別在新疆維吾爾自治區(qū)瓜果研究所、旱區(qū)作物逆境生物學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室和西北農(nóng)林科技大學(xué)資源圃進(jìn)行。

1.1 材料

用于香氣物質(zhì)測定的品種為：‘玫瑰香’（V.viniferaL.cv.Muscat Hamburg）、‘陽光玫瑰’（V.labruscanaBailey×V.viniferaL.cv.Shine Muscat）、‘早玫瑰’（V.viniferaL.cv.Zaomeiguixiang）、‘巨玫瑰’（V.viniferaL.×V.labruscaL.cv.Jumeigui）、‘亞歷山大’（V.viniferaL.cv.Muscat of Alexandria）、‘沙巴珍珠’（V.viniferaL.cv.Pearl of Csaba）、‘意大利’（V.viniferaL.cv.Italia）、‘粉紅玫瑰’（V.viniferaL.cv.Muscat Rose）、‘無核白’（V.viniferaL.cv.Thompson Seedless），其中‘亞歷山大’取于北京市林業(yè)果樹科學(xué)研究院試驗(yàn)場，其他葡萄品種取于西北農(nóng)林科技大學(xué)資源圃。用于胚挽救雜交的供試材料中，母本為5個種子敗育型無核品種，具體為：‘愛神玫瑰’‘火焰無核’‘紅寶石無核’‘昆香無核’‘克瑞森無核’，父本為6個玫瑰香味品種‘玫瑰香’‘陽光玫瑰’‘愛神玫瑰’‘紅亞歷山大’‘昆香無核’‘新郁’，以上雜交試驗(yàn)于新疆維吾爾自治區(qū)瓜果研究所進(jìn)行，供試葡萄品種均采用水平棚架栽培，株距1 m，行距5 m，東西行向，葡萄園地理位置北緯42.91°、東經(jīng)90.30°。雜交組合的配置見表1。

1.2 方法

1.2.1 果實(shí)香味物質(zhì)測定 選擇 10個葡萄品種的成熟果實(shí)，利用氣質(zhì)聯(lián)用儀（HS-SPME-GC-MS）測定葡萄果實(shí)香氣物質(zhì)含量，所用色譜柱為 HPINNOWAX（60 m×0.25 mm×0.25 μm）毛細(xì)管柱，內(nèi)標(biāo)物為10 μL 2-辛醇（0.1 g·L-1），其余具體操作參照譚偉等[21]的方法。

1.2.2 胚挽救流程 選擇長勢良好的花序，盛花前3—4 d人工去雄。去雄3 d后，柱頭分泌黏液時，進(jìn)行人工授粉。授粉后約45 d時取雜交組合果穗，將果實(shí)摘下放入網(wǎng)袋中流水沖洗6—8 h。在無菌條件下，將果實(shí)內(nèi)胚珠取出，接種于胚發(fā)育MM3固體培養(yǎng)基中暗培養(yǎng)。10周后，在解剖鏡下取胚接種于胚萌發(fā)培養(yǎng)基中進(jìn)行光照培養(yǎng)，培養(yǎng) 1個月后統(tǒng)計萌發(fā)胚數(shù)，2個月后統(tǒng)計成苗數(shù)。胚挽救具體程序參照文獻(xiàn)[7,22-23]的方法進(jìn)行。光照過程中及時觀察胚的生長狀態(tài)，統(tǒng)計不同組合發(fā)育胚的個數(shù)和正常成苗數(shù)，計算胚發(fā)育率和成苗率，胚發(fā)育率（%）=發(fā)育胚數(shù)/接種胚珠數(shù)×100，胚萌發(fā)率（或成苗率）（%）=胚萌發(fā)數(shù)（或成苗數(shù)）/接種胚數(shù)×100。

1.2.3 胚萌發(fā)培養(yǎng)基最適生長調(diào)節(jié)劑濃度篩選 試驗(yàn)共設(shè)置了 9種不同的胚萌發(fā)培養(yǎng)基，對 2,4-二氯苯氧乙酸（2,4-D）、激動素（KT）、玉米素（ZT）及萘乙酸（NAA）4種生長調(diào)節(jié)劑的不同濃度配比，以 WPM培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，進(jìn)行胚萌發(fā)培養(yǎng)基的優(yōu)化（表 3）。比較不同培養(yǎng)基中胚的萌發(fā)率和成苗率，從而篩選出胚萌發(fā)培養(yǎng)基中最適生長調(diào)節(jié)劑濃度及成分。取3次生物學(xué)重復(fù)平均值，統(tǒng)計方法同上。

1.2.4 胚發(fā)育形態(tài)差異觀察統(tǒng)計 以雜交組合‘紅寶石無核’ב玫瑰香’和‘昆香無核’ב愛神玫瑰’為材料，統(tǒng)計不同發(fā)育階段胚的數(shù)量，具體統(tǒng)計類型包括：心形胚（H）、球形胚（G）、魚雷形胚（F）、子葉形胚（C）、畸形胚（A）5種。后期統(tǒng)計對比不同類型胚的成苗株數(shù)，并比較分析不同發(fā)育形態(tài)的胚接種后胚萌發(fā)率及成苗率的差異。

表1 雜交組合配置Table 1 Cross combination configuration

1.2.5 雜交后代無核標(biāo)記檢測 提取雜交親本及后代基因組DNA，使用無核相關(guān)分子標(biāo)記GLSP1-569、SCF27-2000及 SCC8-1018標(biāo)記進(jìn)行檢測，引物序列及反應(yīng)程序參考文獻(xiàn)[22-23]。SCC8-1018酶切具體操作如下：模板DNA經(jīng)PCR擴(kuò)增后，取20 μL PCR產(chǎn)物，加1 UBglⅡ酶，37℃下培養(yǎng)2—3 h，酶切產(chǎn)物用濃度為1.5%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，兩端電壓為120 V，電泳結(jié)束后立即使用凝膠成像儀對其成像。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

香氣物質(zhì)經(jīng) GC/MS分析，各色譜峰經(jīng)計算機(jī)檢索NIST 2011標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)譜圖庫，輔以人工分析對應(yīng)化合物以定性鑒定；利用標(biāo)準(zhǔn)品法定量分析果實(shí)中提取出的香氣物質(zhì)，取3次生物學(xué)重復(fù)平均值作為香氣物質(zhì)的相對含量。胚發(fā)育率、萌發(fā)率和成苗率及其差異顯著性分析利用Excel和SPSS軟件進(jìn)行。

2 結(jié)果

2.1 果實(shí)風(fēng)味物質(zhì)檢測與玫瑰香味品種篩選

對1個非香味品種及9個香味品種果實(shí)進(jìn)行香氣物質(zhì)鑒定（表 1）。由結(jié)果可看出，果實(shí)揮發(fā)性物質(zhì)中的主要成分醛類、醇類、酯類等 C6化合物含量較高。與對照相比，8個玫瑰香味葡萄品種果實(shí)香氣成分中萜烯物質(zhì)含量均較高，范圍為 0.0246—1.3824，其中含量最高的品種為‘莎巴珍珠’，而萜烯物質(zhì)被認(rèn)為是主導(dǎo)玫瑰香味的揮發(fā)性物質(zhì)，基于此，本研究篩選出適于作為香味雜交父本的品種有‘莎巴珍珠’‘巨玫瑰’‘亞歷山大’‘陽光玫瑰’。

表2 玫瑰香味葡萄果實(shí)中所含化合物種類及含量Table 2 Concentrations of volatile compounds determined in the aroma grapes (μg·g-1)

2.2 親本基因型對胚挽救效果的影響

2.2.1 不同母本基因型對胚挽救效果的影響 本試驗(yàn)配置了13個雜交組合，共獲得雜種胚珠17 016個，雜種苗 1 284個。胚發(fā)育率的變化范圍為 4.31%—48.59%，成苗率的變化范圍0—51.71%。

分析母本基因型對胚挽救效率的影響，結(jié)果表明，以‘紅寶石無核’‘火焰無核’為母本的雜交組合成苗率高于其他雜交組合，成苗率最高分別達(dá)到51.71%和37.59%（表3）。

2.2.2 不同父本基因型對胚挽救效果的影響 以‘愛神玫瑰’為母本，比較父本基因型影響，以‘昆香無核’作父本時成苗率最高（23.49%）；以‘火焰無核’為母本與不同父本雜交，以‘紅亞歷山大’做父本時成苗率最高；以‘紅寶石無核’為母本時，比較不同父本雜交后代成苗率，最高的為‘愛神玫瑰’。

在母本相同的情況下，以‘陽光玫瑰’‘紅亞歷山大’和‘愛神玫瑰’為父本的雜交組合成苗率較高，其中‘紅亞歷山大’成苗率最高。同時，試驗(yàn)中設(shè)置了‘昆香無核’和‘愛神玫瑰’正反交的雜交組合，結(jié)果表明，以‘昆香無核’為母本，‘愛神玫瑰’為父本的雜交組合胚發(fā)育率高于其反交組合，而兩個組合的最終成苗率無明顯差異（表3）。

2.3 生長調(diào)節(jié)劑對胚挽救結(jié)果的影響

T2處理組對胚萌發(fā)的促進(jìn)效果最顯著，因此，該組合中生長調(diào)節(jié)劑的最適濃度為：1.0 mg·L-1KT＋0.5 mg·L-1NAA＋1.0 mg·L-1ZT。隨著 2,4-D 濃度的升高，胚發(fā)育率及成苗率均下降；NAA與2,4-D同為生長素類似物，其作用機(jī)理類似，因此重復(fù)添加使培養(yǎng)基中生長素濃度過高則會抑制胚的生長；在一定范圍內(nèi)提升KT和ZT濃度對胚的發(fā)育有促進(jìn)作用，二者在濃度約為1 mg·L-1時胚發(fā)育及萌發(fā)率較高。同時，T2處理的胚生根顯著多于對照（圖1），說明ZT對促進(jìn)幼苗生根有明顯的效果。

表3 無核香味葡萄胚挽救育種結(jié)果Table 3 The result of embryo rescue for breeding seedlessness with aroma grapevine

表4 不同生長調(diào)節(jié)劑對胚挽救成苗的影響Table 4 Effect of different growth regulators on plant development

圖1 ‘昆香無核’ב愛神玫瑰’雜種胚生長發(fā)育情況Fig.1 Growth and development of hybrid embryos of Kunxiang Seedless × Aishenmeigui

2.4 不同形態(tài)雜種胚對胚挽救結(jié)果的影響

統(tǒng)計雜交組合‘昆香無核’ב愛神玫瑰’和‘紅寶石無核’ב玫瑰香’分別暗培養(yǎng)7周和8周后發(fā)育形成不同形態(tài)的胚數(shù)量及所占比率，具體統(tǒng)計類型包括：球形胚（G）、心形胚（H）、魚雷形胚（F）、子葉形胚（C）、畸形胚（A）。根據(jù)表5可以看出，‘昆香無核’ב愛神玫瑰’暗培養(yǎng)7周后獲得幼胚中球形胚數(shù)量最多，而暗培養(yǎng)8周的‘紅寶石無核’ב玫瑰香’中獲得魚雷形胚數(shù)量在總幼胚數(shù)中比率較高。對比不同類型胚的成苗株數(shù)，結(jié)果顯示，在胚發(fā)育進(jìn)程中，接種發(fā)育成熟的魚雷形胚和子葉形胚可以獲得較高的成苗率，其中子葉形胚的萌發(fā)率及成苗率都顯著高于其他形態(tài)的雜種胚，均可達(dá) 100%，而畸形胚接種后成苗率較低。

表5 不同形態(tài)雜種胚的萌發(fā)成苗Table 5 Embryo germination and plantlet development in vitro of different stages of embryogenesis

2.5 胚挽救雜交子代無核性狀的早期分子標(biāo)記篩選

2.5.1 不同組合親本的無核性狀分子標(biāo)記篩選 利用3種無核標(biāo)記對雜交組合中7個雙親進(jìn)行無核性狀篩選，無核探針GSLP1-569的擴(kuò)增結(jié)果為：母本中‘火焰無核’‘紅寶石無核’和‘克瑞森無核’擴(kuò)增出了569 bp的特異性條帶；父本中，‘愛神玫瑰’‘玫瑰香’未在569 bp處出現(xiàn)特異性條帶（圖2-A），可用于檢測‘克瑞森無核’ב玫瑰香’及‘紅寶石無核’ב玫瑰香’雜交后代無核性狀。無核標(biāo)記SCF27-2000的結(jié)果表明，親本中‘玫瑰香’未擴(kuò)增出2 000 bp的特異性條帶（圖 2-B），可用于以‘愛神玫瑰’‘玫瑰香’為父本的所有組合雜交后代的無核早期鑒定。SCC8酶切后結(jié)果為‘火焰無核’和‘昆香無核’只有 1 000 bp附近一條帶，表現(xiàn)無核純合基因型SCC8+/SCC8+，有核品種‘玫瑰香’只有750 bp附近一條帶，表現(xiàn)出有核純合基因型 SCC8-/SCC8-（圖2-C）；而無核品種‘紅寶石無核’及‘愛神玫瑰’同時擴(kuò)增出1 000 bp及750 bp的兩條帶，表現(xiàn)為無核雜合基因型 SCC8+/SCC8-，因此可用于‘紅寶石無核’ב玫瑰香’‘愛神玫瑰’ב玫瑰香’‘昆香無核’ב愛神玫瑰’雜交后代無核性狀的早期鑒定。

2.5.2 無核標(biāo)記 GSLP1-569、SCF27-2000及 SCC8對‘紅寶石無核’ב玫瑰香’雜交子代的檢測 對‘紅寶石無核’ב玫瑰香’41個子代的檢測結(jié)果中，使用無核探針GSLP1-569擴(kuò)增出569 bp特異性條帶的共 32個株系（圖 3-A），使用無核探針SCF27-2000擴(kuò)增出2 000 bp特異性條帶的共5個株系（圖3-B），使用SCC8酶切后擴(kuò)增出1 018 bp特異性條帶的有23個株系，且均為純合（圖3-C），同時擴(kuò)增出3種無核特異性條帶的有4個株系（圖3-A、3-B、3-C），編號為8-16、8-25、8-28、8-32。初步推斷這 4個株系為無核的概率最大，后代無核率為12.20%。

2.5.3 無核標(biāo)記SCF27-2000、SCC8對‘愛神玫瑰’ב玫瑰香’雜交子代的檢測 對‘愛神玫瑰’ב玫瑰香’14個雜種子代檢測結(jié)果中，使用SCF27-2000標(biāo)記擴(kuò)增出2 000 bp特異性條帶的有5個株系（圖4-A），使用SCC8酶切后擴(kuò)增出2 000 bp特異性條帶的有9個株系（圖4-B）。在兩種標(biāo)記檢測時均擴(kuò)增出了無核特異性條帶的株系有 3株（圖4-A、4-B），編號為 2-1、2-7、2-13，可認(rèn)為這 3個株系的無核概率更大，該組合雜交后代無核率為21.43%。

2.5.4 無核標(biāo)記SCF27-2000、SCC8酶切對‘昆香無核’ב愛神玫瑰’雜交子代的檢測 對‘昆香無核’ב愛神玫瑰’46個雜種子代檢測結(jié)果。其中使用SCF27-2000擴(kuò)增出2 000 bp特異性條帶的共20個株系（圖5-A），經(jīng)SCC8酶切后擴(kuò)增出1 018 bp特異性條帶的共31個株系（圖5-B）。兩種標(biāo)記均可檢測到無核性狀的共20個株系（圖5-A、5-B），編號為：1-12、1-14、1-16、1-17、1-18、1-20、1-23、1-24、1-25、1-27、1-28、1-29、1-30、1-31、1-32、1-37、1-39、1-42、1-43、1-44以上株系更可能被鑒定為無核品種，該雜交組合無核率為43.48%。

圖2 無核性狀相關(guān)分子標(biāo)記對雜交親本的檢測Fig.2 Molecular marker-assisted selection of parents with grapevine seedlessness gene

圖3 不同分子標(biāo)記對‘紅寶石無核’ב玫瑰香’雜交后代的檢測Fig.3 Molecular marker-assisted selection of hybrid progeny of Ruby Seedless × Muscat Hamburg cross with seedlessness gene

圖4 不同分子標(biāo)記對‘愛神玫瑰’ב玫瑰香’雜交后代的檢測Fig.4 Molecular marker-assisted selection of hybrid progeny seedlings of the cross Aishenmeigui × Muscat Hamburg with grapevine seedlessness gene

3 討論

已有研究認(rèn)為歐亞種葡萄特有的玫瑰香味與其含有的萜類物質(zhì)及其含量密切相關(guān)，玫瑰香味的主要呈香物質(zhì)為萜類物質(zhì)中的香葉醇、里那醇等，其中里那醇對玫瑰香味的貢獻(xiàn)最大[11,24-26]。本研究中里那醇在8個玫瑰香味品種中含量范圍為 0.0396—1.0790，含量最高的品種為‘亞歷山大’，含量最低的品種為‘早玫瑰’，這與感官感覺到的玫瑰香味濃淡相符[18]。本試驗(yàn)篩選出部分香味性狀優(yōu)良的玫瑰香味品種，用于創(chuàng)制無核香味新品種。下一步研究將以目前已測定的香味物質(zhì)為參考依據(jù)，按照已報道的35個香味基因序列為基礎(chǔ)，設(shè)計香味的基因標(biāo)記，對本研究獲得雜種后代的香味基因進(jìn)行分子標(biāo)記輔助選擇，提高基因標(biāo)記選擇的效率。

本研究發(fā)現(xiàn)影響胚挽救效果的因素有雜交組合親本基因型、培養(yǎng)基成分、培養(yǎng)時間，而親本基因型對胚挽救成苗的影響主要體現(xiàn)在親本雜交親和力差異上[27]。本研究中雜交組合‘紅寶石無核’ב愛神玫瑰’所獲成苗率最高，可能是由于親本之間親和性強(qiáng)，有利于合子胚的形成和萌發(fā)。母本胚珠的發(fā)育程度是胚挽救的關(guān)鍵[7,9,28-30]，母本的種子敗育類型不同，其幼胚的形成能力有較大的差異[21,27,31-32]。本研究結(jié)果顯示，胚敗育發(fā)生過早或可挽救性差的品種如‘克瑞森無核’‘昆香無核’等不宜用作母本材料，這可能與其胚珠發(fā)育不良有關(guān)。而成苗率較高的品種如‘紅寶石無核’‘火焰無核’‘愛神玫瑰’更適宜作為無核香味葡萄胚挽救的母本材料。

利用歐亞種葡萄獨(dú)特的玫瑰香味，通過胚挽救技術(shù)實(shí)現(xiàn)香味和無核性狀的聚合，培育無核香味新品種是一個有效策略。本研究中父本材料‘玫瑰香’‘陽光玫瑰’‘愛神玫瑰’‘紅亞歷山大’‘昆香無核’是具有玫瑰香味的品種[9,20,30]，這5個父本與同一母本雜交，以‘紅亞歷山大’‘愛神玫瑰’和‘陽光玫瑰’作為父本的胚挽救效率更高。說明父本基因型對胚挽救效率有一定影響，香味品種中，適合作為父本選育香味種質(zhì)的為‘紅亞歷山大’‘愛神玫瑰’‘陽光玫瑰’。

胚萌發(fā)培養(yǎng)基的成分對幼胚能否萌發(fā)并存活有直接影響，因此，該階段培養(yǎng)基成分是胚挽救獲得成苗的關(guān)鍵影響因素之一。激素配比及濃度影響著成苗方式、植株狀態(tài)及成苗率。鄧向陽等[33]認(rèn)為在培養(yǎng)基中添加2,4-D、NAA、ZT和KT等生長調(diào)節(jié)劑并以適當(dāng)濃度配比，可分別促進(jìn)誘導(dǎo)離體胚生根及不定芽發(fā)生，且在含有1 mg·L-12,4-D的培養(yǎng)基中幼胚的萌發(fā)率最高可達(dá)66.7%[33]。本研究中，無核葡萄胚萌發(fā)成苗率在一定范圍內(nèi)的增大可能是NAA、KT及ZT濃度的上升造成的，胚萌發(fā)成苗率呈下降趨勢可能與2,4-D濃度的增大有關(guān)；在以WPM為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，添加1.0 mg·L-1KT＋0.5 mg·L-1NAA＋1.0 mg·L-1的生長調(diào)節(jié)劑時，對胚萌發(fā)有明顯的促進(jìn)作用。但對不同雜交組合，最適其生長的胚發(fā)育培養(yǎng)基和成苗途徑，仍需進(jìn)一步確定[4]。

胚珠離體培養(yǎng)時間同樣對胚挽救效果有重要影響[9]。培養(yǎng)時間導(dǎo)致了胚發(fā)育形態(tài)的不同，不同形態(tài)胚接種于胚萌發(fā)培養(yǎng)基上，其萌發(fā)率及成苗率直接受到影響。本研究結(jié)果證明暗培養(yǎng)8周時可取得較好的胚挽救結(jié)果，即大部分胚發(fā)育至魚雷形，而接種魚雷形和子葉形胚可保證胚發(fā)育率和成苗率較高。

分子標(biāo)記輔助選擇是利用遺傳標(biāo)記在幼苗期對目標(biāo)性狀進(jìn)行選擇，可縮短育種年限，提高育種效率[34]。目前用于葡萄無核性狀鑒定的分子輔助標(biāo)記有GLSP1-569、SCF27-2000、VMCF7f2-198、SCC8-1018和 p3-AGL11-196[35-37]。本研究選用 GLSP1-569、SCF27-2000和SCC8-10183共3個無核分子標(biāo)記對雜交組合的親本和后代進(jìn)行檢測，以‘紅寶石無核’為母本的雜交組合后代無核率更高，可為雜交親本的選擇提供依據(jù)。下一步可對已獲得的雜交后代進(jìn)行田間性狀觀察與鑒定，選育同時具有無核和香味的新材料，同時也對無核性狀和香味性狀的遺傳規(guī)律進(jìn)行研究，為無核香味育種提供參考。

4 結(jié)論

不同的親本基因型對胚挽救成苗的影響不同，以‘紅寶石無核’‘火焰無核’作母本和以‘紅亞歷山大’‘愛神玫瑰’‘陽光玫瑰’作父本的雜交組合胚挽救成苗率較高。WPM培養(yǎng)基+KT+ZT可以促進(jìn)胚挽救的幼胚生根。在101個雜種后代中進(jìn)行無核基因標(biāo)記檢測，篩選出27個雜種后代同時攜帶不同無核分子標(biāo)記的特異條帶。