黃愛招 李亦聰 梁超峰

摘要 目的：觀察松花粉總黃酮對急性化學(xué)性肝損傷模型小鼠的作用機(jī)制。方法：60只ICR小鼠隨機(jī)分為空白組、模型組及實(shí)驗(yàn)組，每組20只。其中模型組及實(shí)驗(yàn)組制備小鼠急性肝損傷模型，模型制備成功后實(shí)驗(yàn)組每日灌胃松花粉總黃酮，空白組及模型組灌胃同等劑量的生理鹽水，連續(xù)干預(yù)10 d。比較3組肝臟病理變化，外周血谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）的活性以及PI3K-AKT信號通路標(biāo)志性蛋白水平變化。結(jié)果：1）空白組小鼠肝臟形態(tài)正常，模型組小鼠肝臟出現(xiàn)明顯病理改變，實(shí)驗(yàn)組小鼠肝臟細(xì)胞空泡及炎性反應(yīng)侵潤現(xiàn)象較模型組減輕，肝臟細(xì)胞輕微壞死。2）與空白組比較，模型組外周血ALT、AST及Bax濃度均明顯上調(diào)（P<0.05），Bcl-2表達(dá)下降（P<0.05）;實(shí)驗(yàn)組上述指標(biāo)明顯改善。3）模型組肝臟組織的PI3K、p-AKT水平明顯下降，干預(yù)后小鼠上述指標(biāo)表達(dá)明顯上調(diào)，與模型組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。結(jié)論：松花粉總黃酮對化學(xué)性肝損傷有保護(hù)效應(yīng)，其作用機(jī)制可能與介導(dǎo)PI3K-AKT信號通路有關(guān)。

關(guān)鍵詞 化學(xué)性肝損傷模型，小鼠;松花粉總黃酮;ALT;AST;PI3K-AKT

Abstract Objective：To observe the mechanism of total flavonoids of pine pollen on acute chemical liver injury model mice. Methods：A total of 60 Institute of Cancer Research（ ICR） mice were randomly divided into blank group （n=20）， model group （n=20） and experimental group （n=20）. The mouse model of acute liver injury was made in the model group and the experimental group. After the successful preparation of the model， the experimental group was intragastrically infused with total flavonoids of pine pollen every day， and the blank group and the model group were intragastrically infused with the same dose of normal saline for 10 days. The pathological changes of liver， the activities of glutamic pyruvic transaminase （ALT） and glutamic oxaloacetic transaminase （AST） in peripheral blood and the levels of marker proteins in PI3K-AKT signal pathway were compared among the three groups. Results：1） the liver morphology of mice in the blank group was normal， and there were obvious pathological changes in the model group. The vacuolation and inflammatory infiltration of liver cells in the experimental group were less than those in the model group， and the liver cells were slightly necrotic. 2） compared with the blank group， the concentrations of ALT， AST and Bax in the model group were significantly increased， and the expression of Bcl-2 was decreased in the model group， and the above-mentioned indexes were significantly improved in the experimental group. 3） the levels of PI3K and p-AKT in the liver tissue of the model group decreased significantly， and the expression of the above-mentioned indexes increased significantly after intervention in the experimental group， which was significantly different from that of the model group （P<0. 05）. Conclusion：Total flavonoids of pine pollen have protective effect on chemical liver injury， and its mechanism may be related to the mediation of PI3K-AKT signal pathway.

Keywords Chemical liver injury model; Mouse; Total flavonoids from pine pollen; ALT;AST;PI3K-AKT

中圖分類號：R285.5 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A doi：10.3969/j.issn.1673-7202.2020.16.004

肝炎可引起肝細(xì)胞凋亡，誘發(fā)肝功能的下降、導(dǎo)致肝硬化和肝癌[1]。為了調(diào)節(jié)肝臟內(nèi)過量的炎性反應(yīng)，往往會使用大量的抑制免疫系統(tǒng)的甾體類藥物，以及一些抗氧化劑來彌補(bǔ)肝損傷。但是，這些免疫抑制劑具有腎功能降低及機(jī)會感染等不良反應(yīng)[2]。隨著研究的逐漸深入，越來越多文獻(xiàn)支持肝臟細(xì)胞增殖/凋亡失常是急性化學(xué)性肝損傷發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵，PI3K-AKT信號通路是經(jīng)典的與細(xì)胞增殖/凋亡密切相關(guān)的分子信號通路，有研究[3]顯示急性化學(xué)性肝損傷程度與PI3K/AKT信號通路激活程度密切相關(guān)。

松花粉是我國傳統(tǒng)食藥兼用的花粉品種，神農(nóng)本草、本草綱目等多種醫(yī)籍中均有記載，有潤心肺、益氣、祛風(fēng)止血的功能[4-5]。松花粉中的多種酶、核酸、有機(jī)酸、黃酮等生物活性物質(zhì)能調(diào)節(jié)人體功能，具有延緩衰老，促進(jìn)新陳代謝的功能，對于保健及功能藥物的開發(fā)具有重要意義。本團(tuán)隊(duì)研究顯示松花粉可明顯改善患者肝功能，但其作用機(jī)制不明，因此我們以ICR小鼠為研究對象，以期探討松花粉總黃酮的作用機(jī)制，報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物 60只SPF級昆明種雄性ICR小鼠，體質(zhì)量為20～24 g，適應(yīng)期間自由攝食與飲水。所有動物飼養(yǎng)于本院動物實(shí)驗(yàn)中心，飼養(yǎng)條件：溫度（22±1.5）℃，濕度（50±2.）%，以12/12 h為光暗周期。各組小鼠在體質(zhì)量、鼠齡各方面差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），具有可比性。本研究方案經(jīng)醫(yī)院倫理會審批通過（倫理審批號：392034-5）。

1.1.2 藥物 松花粉黃總酮由本院藥劑科從馬尾松花粉提煉而成，本研究馬尾松花粉購自福貞堂[（長春）參茸有限公司，貨號：392832]。馬尾松花粉經(jīng)超微粉碎，石油醚回流脫脂、乙醇回流浸提后洗脫、揮干而得。

1.1.3 試劑和儀器 PI3k一抗抗體（Abcam公司，美國，貨號：ab19897）;AKT一抗抗體（Abcam公司，美國，貨號：ab151796）;p-AKT一抗抗體（Abcam公司，美國，貨號：ab129182）;Model68酶標(biāo)儀（Bio-Rad Laboratories公司，美國，型號：M-68）;SDS配膠試劑盒（碧云天生物公司，貨號：3923）。

1.2 方法

1.2.1 分組與模型制備 60只小鼠數(shù)字隨機(jī)法分為空白組（20只）、模型組（40只），參考文獻(xiàn)[6]中急性化學(xué)性肝損傷小鼠模型制備方法，給予1次性腹腔注射0.1%的CCl4-豆油溶液10 mL/kg，使之形成急性的肝臟損傷后的動物模型組。將空白組中小鼠的腹腔中注射進(jìn)入同等量的生理鹽水溶液。

1.2.2 給藥方法 實(shí)驗(yàn)組用5 mL/kg松花總酮灌胃，空白組及造模組大鼠接受等體積生理鹽水灌胃，各組均連續(xù)干預(yù)10 d。

1.2.3 檢測指標(biāo)及方法

1.2.3.1 HE染色觀察肝臟病理結(jié)構(gòu)改變 各組干預(yù)結(jié)束后將小鼠充分麻醉后冰上快速取出肝臟組織置于多聚甲醛溶液內(nèi)，隨后進(jìn)行脫水透明、浸蠟包埋、切片與貼片、脫蠟，再將標(biāo)本置于蘇木精水溶液中染色數(shù)分鐘，再進(jìn)行脫水透明，將已透明的切片用樹膠封固后光鏡下觀察肝臟組織病理變化。

1.2.3.2 Western Blot檢測各組小鼠肝臟組織PI3K、p-AKT水平變化 干預(yù)結(jié)束后各組隨機(jī)抓取5只小鼠，利用10%水合氯醛腹腔麻醉后冰上快速取出肝臟組織，按照100 mg：0.5 mL裂解液的比例加入適量1%PMSF的蛋白裂解液，勻漿后室溫下靜置10 min后，用BCA試劑盒測定樣本總蛋白，根據(jù)結(jié)果得出上樣量后進(jìn)行電泳跑膠，轉(zhuǎn)膜，加入PI3K、p-AKT及β-actin一抗，比例均按照1∶ 1 000稀釋，再進(jìn)行生物辣根過氧化酶HRP標(biāo)記的二抗孵育，最后顯影、拍攝，用Image（BIO-RAD公司）的圖像處理軟件進(jìn)行處理，測定各樣本灰度值。

1.2.3.3 ALT、AST、Bcl-2、Bax濃度檢測 收集大鼠的腹主動脈血，4 ℃ 10 000 r/min下離心5 min，離心半徑15 cm，抽吸上清液，使用ELISA（酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)）對小鼠外周血清ALT、AST、Bcl-2、Bax濃度進(jìn)行檢測，具體過程如下：將樣本滴加如反應(yīng)孔中，37 ℃孵育1 h，用PBS洗滌反應(yīng)孔后每孔加入0.1 mL的酶標(biāo)抗體，37 ℃孵育30 min，在用PBS洗滌，隨后在各反應(yīng)孔中加入0.1 mL的TMB底物溶液，37 ℃孵育30 min，再加入2 M硫酸0.05 mL中止反應(yīng)。隨后將反應(yīng)孔板置于酶標(biāo)儀中讀取數(shù)據(jù)，波長設(shè)置492 nm。操作過程全部按照試劑盒說明書進(jìn)行檢測。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。所得數(shù)據(jù)都用（均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差）（±s）來描述，組間比較采用兩樣本t檢驗(yàn)或兩樣本秩和檢驗(yàn);組內(nèi)比較采用配對t檢驗(yàn)或配對秩和檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組肝臟組織HE染色結(jié)果 空白組小鼠的肝臟表面光滑，色澤均勻，顏色鮮紅，肝臟細(xì)胞排列有序。模型組小鼠肝臟組織質(zhì)地較硬，肝臟邊緣粗糙，顏色暗沉無光澤，肝臟細(xì)胞壞死，空泡及炎性反應(yīng)侵潤現(xiàn)象明顯，表面見散在的點(diǎn)狀及片狀出血點(diǎn);實(shí)驗(yàn)組小鼠肝臟細(xì)胞空泡及炎性反應(yīng)侵潤現(xiàn)象較模型組減輕，肝臟細(xì)胞輕微壞死。見圖1。

2.2 各組肝臟組織PI3K、p-AKT水平變化 經(jīng)過模型制備的小鼠肝臟組織的PI3K、p-AKT水平明顯下降，經(jīng)過松花粉總黃酮干預(yù)后小鼠上述指標(biāo)表達(dá)明顯上調(diào)，與模型組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。具體見圖2，表1。

2.3 各組外周血ALT、AST、Bax及Bcl-2活性比較 ?與空白組比較，接受急性化學(xué)性肝損傷模型制備的小鼠外周血ALT、AST及Bax濃度均明顯上調(diào)（P<0.05），Bcl-2表達(dá)下降（P<0.05）;與模型組比較，實(shí)驗(yàn)組小鼠ALT、AST及Bax濃度有所下降，Bcl-2表達(dá)增加，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。見表2。

3 討論

化學(xué)性肝損害指的是各種因素（大量乙醇攝入、藥物、有毒物質(zhì)等）對肝臟組織產(chǎn)生損傷性破壞的一類疾病。急性化學(xué)性肝損害治療不及時或不當(dāng)，會進(jìn)而發(fā)展成肝硬化、肝癌[7-9]。近年來由于環(huán)境污染日趨嚴(yán)重、藥物濫用或生活方式改變，急性化學(xué)性肝損傷發(fā)病率逐年升高，故急性化學(xué)性肝損傷早期發(fā)現(xiàn)、及時有效干預(yù)，是抑制其發(fā)展成重癥不可逆轉(zhuǎn)肝病的關(guān)鍵。CCL4所致的肝損害模型是目前經(jīng)典的肝損傷模型，該模型重現(xiàn)性強(qiáng)，且可準(zhǔn)確反映出肝細(xì)胞損害的物理形態(tài)學(xué)變化，大量的國內(nèi)外文獻(xiàn)均以該模型為研究媒介進(jìn)行一系列研究，故本研究亦采用CCL4所致的肝損害模型小鼠作為研究對象。松花粉首載于《唐本草》，入肝脾兩經(jīng)[10-11]。《本草經(jīng)解》中認(rèn)為：“松花，氣溫益肝之陽氣，味甘益脾之陰氣也……風(fēng)氣通肝，氣溫散肝”，是治療肝臟疾病的藥食兼用花粉品種。大量的臨床文獻(xiàn)亦證實(shí)松花粉或者其主要成分松花粉總黃酮可有效治療肝臟疾病。本研究利用CCL4所致的肝損害模型小鼠作為研究對象，證實(shí)了松花粉總黃酮確可有效降低模型鼠ALT及AST水平，這意味著松花粉總黃酮確有明顯的保肝效應(yīng)。ALT及AST是診斷肝功能損傷的主要指標(biāo)，然而在臨床中ALT及AST的輕度升高并不足以引起臨床工作者的重視，這就意味著早期化學(xué)性肝損傷極易被忽略，從而為疾病的進(jìn)一步惡化留下隱患，因此在ALT及AST基礎(chǔ)上探尋敏感的生物標(biāo)志物，是更準(zhǔn)確的預(yù)測化學(xué)性肝損傷的關(guān)鍵。

既往傳統(tǒng)認(rèn)為肝臟細(xì)胞的異常凋亡是肝臟化學(xué)行損傷主要形式，但隨著研究的不斷深入，越來越多證據(jù)顯示細(xì)胞凋亡參與了肝臟缺血的病理變化過程[12-13]。肝臟細(xì)胞的缺血缺氧導(dǎo)致了細(xì)胞凋亡效應(yīng)增強(qiáng)，而肝臟異常凋亡是導(dǎo)致肝功能受損的重要原因，此外，肝臟細(xì)胞屬于可執(zhí)行特定功能的終末分化成熟細(xì)胞，再分裂潛能極其微弱，故肝臟壞死導(dǎo)致的細(xì)胞減少或丟失對肝功能具有致命的影響，而細(xì)胞凋亡在一定程度屬于部分可逆，因此抗凋亡是治療肝損傷，改善其遠(yuǎn)期預(yù)后的重要靶向。PI3K/AKT信號通路是經(jīng)典抗凋亡通路，PI3K激活后介導(dǎo)第二信使PIP3的生成，PIP3進(jìn)一步結(jié)合下游的AKT使其核移位，促進(jìn)AKT的磷酸化而影響其構(gòu)象的改變，啟動細(xì)胞凋亡程序[14-15]。Bcl-2與Bax亦是與凋亡密切相關(guān)的因子，兩者之間有45%的同源性，作用相反，當(dāng)Bcl-2與Bax形成異二聚體復(fù)合物后相互抑制功能，有研究人員[16-18]證實(shí)正常生理狀態(tài)下Bax以單體的形式存在于細(xì)胞核內(nèi)，在受到凋亡信號的刺激后其構(gòu)象發(fā)生變化，寡聚在線粒體膜上，誘發(fā)細(xì)胞色素C自線粒體的釋放，誘導(dǎo)細(xì)胞的凋亡。本研究結(jié)果顯示經(jīng)過模型制備的小鼠PI3K、p-AKT、Bcl-2水平明顯下降，Bax濃度上調(diào)，經(jīng)過松花粉總黃酮干預(yù)后大鼠上述指標(biāo)表達(dá)明顯改善。

總之，松花粉總黃酮可明顯逆轉(zhuǎn)化學(xué)性肝損傷病理，其作用機(jī)制可能與抑制肝臟細(xì)胞凋亡，而該過程可能是通過PI3K/AKT信號通路介導(dǎo)的。

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（2019-08-30收稿 責(zé)任編輯：徐穎）