吳梅青，羅栩強(qiáng)，唐海飛，陳思，顏濤

1.湘潭醫(yī)衛(wèi)職業(yè)技術(shù)學(xué)院，湖南 湘潭 411102；2.中山市仙逸堂中藥飲片有限公司，廣東 中山 528436

吳茱萸為蕓香科植物吳茱萸Evodiarutaecarpa(Juss.)Bench.的干燥近成熟果實(shí)，辛、苦，熱；歸肝、脾、胃、腎經(jīng)，具有散寒止痛、降溫止嘔、助陽(yáng)止瀉的功效[1]，臨床主要用于治療寒凝疼痛、胃寒嘔吐、虛寒泄瀉等。吳茱萸入藥均是炮制品，有效的炮制方法是保證吳茱萸藥用功效、降低毒性成分的重要措施。吳茱萸的炮制方法很多，有湯洗、炒、酒炒、醋炒、鹽水炒、童便制、黃連制、黑豆汁制等[2]。現(xiàn)行的炮制方法有酒制、醋制、鹽制、姜制、黃連制、甘草制等方法，收錄于各省、地區(qū)炮制規(guī)范中，如2015年版《中華人民共和國(guó)藥典》(以下簡(jiǎn)稱(chēng)《中國(guó)藥典》)收錄了吳茱萸甘草制法，《貴州省中藥飲片炮制規(guī)范》收錄了姜制、鹽制的方法[3]，《四川省中藥飲片炮制規(guī)范》(2015年版)收錄了炒制、鹽制、醋制、黃連制的方法。生吳茱萸有小毒，多外用，長(zhǎng)于祛寒燥濕，用于口瘡、牙痛、濕疹；甘草制后降低毒性，緩和燥性，可供內(nèi)服，用于寒疝腹痛、寒濕腳氣、厥陰頭痛、脘腹脹痛、經(jīng)行腹痛、嘔吐吞酸、五更泄瀉等；鹽制吳茱萸能增強(qiáng)人腎的作用，宜用于疝氣疼痛[4-5]；醋吳茱萸能疏肝鎮(zhèn)痛，姜吳茱萸能散寒止嘔，酒吳茱萸治心腹氣滯作痛等[6]。吳茱萸所含化學(xué)成分復(fù)雜，主要包括生物堿類(lèi)、黃酮類(lèi)、萜類(lèi)、酚類(lèi)以及揮發(fā)油等[7]。吳茱萸堿、吳茱萸次堿、檸檬苦素是吳茱萸主要藥效成分，具有抗炎鎮(zhèn)痛、抗血栓形成、調(diào)節(jié)體溫、保護(hù)心臟、抗阿爾茨海默病、抗腫瘤等藥理作用，可以作為吳茱萸藥材質(zhì)量控制的主要指標(biāo)成分[8]。有文獻(xiàn)報(bào)道[9]，吳茱萸及其炮制品中吳茱萸堿、吳茱萸次堿和檸檬苦素成分含量有變化，會(huì)對(duì)臨床用藥效果產(chǎn)生影響。本研究選取了5個(gè)產(chǎn)地不同吳茱萸藥材，并按法定標(biāo)準(zhǔn)方法炮制同一產(chǎn)地吳茱萸藥材，得到甘草制、姜制、鹽制、醋制吳茱萸，并采用HPLC同時(shí)測(cè)定不同炮制品中指標(biāo)成分含量的變化，為優(yōu)化吳茱萸炮制工藝及不同炮制品在臨床的應(yīng)用提供參考。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

高效液相色譜儀(島津LC-16L)及工作站，島津SPD-16紫外可見(jiàn)檢測(cè)器，島津C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)色譜柱；十萬(wàn)分之一分析天平(賽多利斯BP211D)；KQ3200DB數(shù)控超聲波清洗儀(昆山超聲儀器有限公司)；XL-600B多功能粉碎機(jī)(永康市小寶電器有限公司)。

1.2 試藥

吳茱萸堿、吳茱萸次堿、檸檬苦素對(duì)照品(批號(hào)分別為：110802-201409、110801-201608、110800-201406)均購(gòu)于中國(guó)食品藥品檢定研究院；甲醇、乙醇、乙腈為色譜純；自制超純水；四氫呋喃、磷酸均為分析純。

吳茱萸藥材分別購(gòu)自于湖南邵東廉橋藥材市場(chǎng)，產(chǎn)地分別為湖南岳陽(yáng)、瀏陽(yáng)、湘鄉(xiāng)，貴州銅仁，湖南新晃等地。經(jīng)中山市仙逸堂中藥飲片有限公司羅栩強(qiáng)藥師鑒定為吳茱萸Evodiarutaecarpa(Juss.)Bench.的干燥近成熟果實(shí)；吳茱萸炮制品均由對(duì)應(yīng)產(chǎn)地同一批吳茱萸藥材按法定標(biāo)準(zhǔn)方法炮制而得；甘草購(gòu)自于湖南邵東廉橋藥材市場(chǎng)，經(jīng)中山市仙逸堂中藥飲片有限公司羅栩強(qiáng)藥師鑒定為豆科植物甘草GlycyrrhizauralensisFisch.的干燥根和根莖。

2 方法和結(jié)果

2.1 吳茱萸炮制品的制備

2.1.1吳茱萸 取原藥材，除去雜質(zhì)，洗凈，干燥。

2.1.2甘草制吳茱萸 參照《中國(guó)藥典》(2015年版)甘草制吳茱萸的方法[1]：取3 g甘草搗碎，加適量水，煎湯，去渣，加入50 g凈吳茱萸，悶潤(rùn)吸盡后，炒制微干，取出，干燥，即得甘草制品。3份平行樣。

2.1.3姜制吳茱萸 參考相關(guān)文獻(xiàn)[9]：取 50 g生藥(3份平行樣)，藥材與干姜用量比100∶7.5，悶潤(rùn)2 h，炒制溫度150 ℃下炒制8 min，即得姜制品。3份平行樣。

2.1.4鹽制吳茱萸 按照 2015年版《四川省中藥飲片炮制規(guī)范》中鹽吳茱萸制法和《中國(guó)藥典》2015年版四部鹽灸法(炮制通則0213)：取 50 g生藥(3份平行樣)，加適量鹽水(1 g食鹽，用適量水溶解，濾過(guò)，即得)拌勻，悶透，置炒制器內(nèi)，以文火加熱，炒至規(guī)定的程度時(shí)取出，放涼，即得鹽制品。3份平行樣。

2.1.5醋制吳茱萸 按照 2015年版《四川省中藥飲片炮制規(guī)范》中醋吳茱萸制法和按照2015年版《中國(guó)藥典》四部醋灸法(炮制通則0213)：取50 g生藥 (3份平行樣)，用10 g米醋拌勻，悶透，用文火炒至規(guī)定的程度時(shí)取出，放涼，即得醋制品。3份平行樣。

2.2 對(duì)照品溶液的制備

取吳茱萸堿對(duì)照品約 2.0 mg、吳茱萸次堿對(duì)照品約1.2 mg和檸檬苦素對(duì)照品2.5 mg，精密稱(chēng)定，置25 mL量瓶中，用甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，得到含吳茱萸堿0.081 2 mg·mL-1、吳茱萸次堿0.050 4 mg·mL-1、檸檬苦素0.101 8 mg·mL-1的混合溶液，即為對(duì)照品溶液。

2.3 供試品溶液的制備

取2.1項(xiàng)下的5種吳茱萸樣品適量，打粉，過(guò)三號(hào)篩。取粉末約0.3 g，精密稱(chēng)定，置具塞錐形瓶中，精密加入70%乙醇25 mL，稱(chēng)定質(zhì)量，浸泡1 h，超聲處理(功率300 W，頻率40 kHz)40 min，放冷，再稱(chēng)定質(zhì)量，用70%乙醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得供試品溶液[1]。

2.4 色譜條件

色譜柱：島津C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)；柱溫：25 ℃；流速：1.0 mL·min-1；檢測(cè)波長(zhǎng)為215 nm；流動(dòng)相：[乙腈-四氫呋喃(25∶15)]-0.02%磷酸溶液(35∶65)；進(jìn)樣量：10 μL。對(duì)照品及供試品色譜圖見(jiàn)圖1。

注：A.對(duì)照品；B.吳茱萸藥材；C.甘草制吳茱萸；D.姜制吳茱萸；E.鹽制吳茱萸；F.醋制吳茱萸；1.檸檬苦素；2.吳茱萸堿；3.吳茱萸次堿。圖1 吳茱萸藥材及炮制品HPLC圖

2.5 線性關(guān)系考察

取2.2項(xiàng)下對(duì)照品溶液，分別進(jìn)樣2.0、4.0、6.0、8.0、10 μL，按2.4項(xiàng)下色譜條件測(cè)定峰面積值。以進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)(X)，峰面積值為縱坐標(biāo)(Y)，結(jié)果見(jiàn)表1。結(jié)果表明3 種成分在進(jìn)樣量范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

表1 吳茱萸堿、吳茱萸次堿和檸檬苦素的 回歸方程、相關(guān)系數(shù)和線性范圍

2.6 精密度試驗(yàn)

精密吸取2.3項(xiàng)下方法制備的湖南岳陽(yáng)產(chǎn)吳茱萸藥材供試品溶液10 μL，連續(xù)進(jìn)樣6次，并記錄色譜峰的峰面積，結(jié)果表明，檸檬苦素、吳茱萸堿、吳茱萸次堿的峰面積的RSD分別為2.1%、2.5%、3.0%。說(shuō)明儀器精密度良好。

2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn)

精密吸取2.3項(xiàng)下方法制備的湖南岳陽(yáng)產(chǎn)吳茱萸藥材供試品液10 μL，分別于 0、2、3、8、12、24 h測(cè)定檸檬苦素、吳茱萸堿、吳茱萸次堿的峰面積。在24 h內(nèi)其RSD分別為1.8%、2.7%、3.1%，說(shuō)明樣品在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.8 重復(fù)性試驗(yàn)

取同一批湖南岳陽(yáng)產(chǎn)吳茱萸藥材樣品5份，按2.3項(xiàng)下方法制備供試品液，按2.4項(xiàng)下色譜條件測(cè)定其檸檬苦素、吳茱萸堿、吳茱萸次堿含量，結(jié)果檸檬苦素、吳茱萸堿、吳茱萸次堿含量(n=5)的 RSD分別為1.5%、2.3.%、2.9%。表明該方法重復(fù)性較好。

2.9 加樣回收率試驗(yàn)

稱(chēng)取已測(cè)含量的湖南岳陽(yáng)產(chǎn)吳茱萸藥材樣品6份(檸檬苦素質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.583%、吳茱萸堿質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.452%、吳茱萸次堿質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.248%)約0.1 g，精密稱(chēng)定，共6份，分別精密加入已知含量的對(duì)照品混合溶液5 mL，按2.3項(xiàng)下方法進(jìn)行處理，按2.4項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行分析，計(jì)算回收率。結(jié)果見(jiàn)表2。結(jié)果表明樣品回收率符合要求。

2.10 樣品指標(biāo)成分測(cè)定結(jié)果

分別取2.1項(xiàng)下方法制的吳茱萸藥材、甘草制、姜制、鹽制和醋制吳茱萸樣品，按2.3項(xiàng)下方法制備樣品溶液。精密吸取10 μL進(jìn)樣測(cè)定，按外標(biāo)法計(jì)算樣品中檸檬苦素、吳茱萸堿、吳茱萸次堿的含量。平行測(cè)定3次，結(jié)果取平均值，測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表3。

表2 檸檬苦素、吳茱萸堿、吳茱萸次堿加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果(n=6)

表3 吳茱萸及不同炮制品中3種指標(biāo)成分含量的測(cè)定結(jié)果(n=3) %

以湖南岳陽(yáng)產(chǎn)吳茱萸炮制前后3種指標(biāo)成分比較，結(jié)果見(jiàn)圖2。

圖2 湖南岳陽(yáng)產(chǎn)吳茱萸炮制前后指標(biāo)成分含量比較

由表3和圖2可知，5個(gè)不同產(chǎn)地的吳茱萸藥材，含有的檸檬苦素、吳茱萸堿、吳茱萸次堿的含量也有差異；同一產(chǎn)地不同炮制品中檸檬苦素、吳茱萸堿、吳茱萸次堿的含量變化明顯；檸檬苦素含量變化趨勢(shì)：藥材>姜制品>醋制品>鹽制品>甘草制品；吳茱萸堿含量變化趨勢(shì)：藥材>甘草制品>醋制品>鹽制品>姜制品；吳茱萸次堿含量變化趨勢(shì)：藥材>甘草制品>醋制品>鹽制品>姜制品。

3 討論

《中國(guó)藥典》(2015年版)收載吳茱萸炮制項(xiàng)目有吳茱萸和制吳茱萸，其中制吳茱萸為甘草汁制，其方法為：取甘草搗碎，加適量水，煎湯，去渣，加入凈吳茱萸，悶潤(rùn)吸盡后，炒制微干，取出，干燥，每100 kg 吳茱萸用甘草6 kg[1]?，F(xiàn)今對(duì)于吳茱萸的炮制研究中均以制吳茱萸飲片品種為主，因?yàn)閰擒镙墙?jīng)甘草炮制后能降低毒性、緩和燥性[8]，達(dá)到增效解毒目的。本實(shí)驗(yàn)按照法定標(biāo)準(zhǔn)中規(guī)定的方法炮制了5個(gè)產(chǎn)地共25個(gè)吳茱萸樣品，所測(cè)吳茱萸藥材和不同炮制品中吳茱萸堿和吳茱萸次堿的總量為0.420%～0.786%、檸檬苦素的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.724%～1.763%，均高于《中國(guó)藥典》(2015年版)規(guī)定的炮制品下限(吳茱萸堿和吳茱萸次堿總量≥0.15%，檸檬苦素≥ 0.2%)。

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)顯示，甘草制吳茱萸中吳茱萸堿和吳茱萸次堿總量與吳茱萸藥材相比無(wú)明顯變化，而醋制中3種指標(biāo)成分都高于鹽制和姜制，吳茱萸的醋制品有引藥入肝、理氣止血、散癖止痛等[10]的作用，與吳茱萸醋制后3種指標(biāo)成分的變化是否有關(guān)聯(lián)性還需進(jìn)一步研究。姜制吳茱萸中3種指標(biāo)成分的含量最低。炮制品中檸檬苦素與吳茱萸藥材相比含量明顯降低，可能與檸檬苦素中的內(nèi)酯容易水解有關(guān)。該研究為吳茱萸不同炮制品在臨床的應(yīng)用提供了有利依據(jù)，但臨床作用機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。

產(chǎn)地不同的吳茱萸藥材，檸檬苦素和吳茱萸堿、吳茱萸次堿的含量也有差異，可能與產(chǎn)地環(huán)境、采收時(shí)間、吳茱萸品種、樹(shù)齡等有關(guān)系。分析實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)還發(fā)現(xiàn)，吳茱萸總堿含量偏高的藥材，檸檬苦素的含量偏低，說(shuō)明吳茱萸檸檬苦素的量和總生物堿的量有某種相關(guān)關(guān)系，具體原因需要進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)研究。