劉斯琪，趙燦，丁鵬敏，陶志，賡迪，王如峰

北京中醫(yī)藥大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，北京 102488

金蓮花TrolliuschinensisBunge是毛莨科多年生草本植物，主要分布于西南、西北、華北、東北和臺灣地區(qū)[1]。其干燥花作為中藥金蓮花(Flos Trollii)入藥[2]，味苦，性寒，無毒，具明目、解嵐障的功效，主治口瘡、喉腫、浮熱牙宣、耳疼、目痛[3]。中藥金蓮花中的主要化學(xué)成分包括黃酮、酚酸、生物堿等類成分。其中，黃酮類含量最高，主要為黃酮碳苷，包括葒草苷和牡荊苷及其衍生物[4]；酚酸類成分主要有藜蘆酸、苯甲酸、金蓮酸、原金蓮酸、金蓮花苷等[5-6]；生物堿類成分含量最低，主要為金蓮花堿[7]。中藥化學(xué)成分的體內(nèi)代謝過程對其藥效物質(zhì)的組成有重要影響[8]，而關(guān)于金蓮花化學(xué)成分的體內(nèi)代謝研究卻鮮有報道。由于中藥成分經(jīng)腸吸收最終進(jìn)入血液的成分較為微量，導(dǎo)致其分析較為困難，許多代謝產(chǎn)物無法被檢測到，而且金蓮花的主要成分為黃酮碳苷類，較難吸收，進(jìn)一步增加了檢測的難度。為了克服金蓮花入血成分及其代謝產(chǎn)物難以檢測的缺點，采取分步研究的策略較為實際，即先通過靜脈給藥方式研究金蓮花提取物的體內(nèi)代謝輪廓，總結(jié)代謝規(guī)律，在此基礎(chǔ)上再對口服給藥的血液移行成分進(jìn)行研究。因此，本研究采用高效液相色譜-電噴霧電離-串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)(LC-ESI-MS)對金蓮花提取物靜脈給藥后的血液移行成分進(jìn)行了鑒定和代謝途徑分析，為后續(xù)的深入研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料

1.1 儀器

高效液相色譜儀(Waters公司，美國)，Thermo LTQ ORBTTRAP XL質(zhì)譜儀(Thermo公司，美國)，甲酸，乙腈(Fisher公司，美國)。

1.2 實驗動物

清潔級SD大鼠，體質(zhì)量(200±20) g，由北京斯貝福實驗動物科技有限公司提供，合格證編號：SCXK(京)2011-0004。實驗前禁食不禁水24 h。

1.3 試藥

金蓮花藥材(批號：20110901)購自河北省安國藥材市場，經(jīng)北京中醫(yī)藥大學(xué)王如峰教授鑒定為毛茛科金蓮花屬植物金蓮花TrolliuschinensisBunge的干燥花。取金蓮花250 g，加12倍量蒸餾水回流提取2次，每次1 h。合并提取液，過濾，減壓濃縮和冷凍干燥后得金蓮花總提取物95.5 g?？偺崛∥锛舆m量蒸餾水溶解并稀釋成50 mg·mL-1的總提取物溶液，供大鼠靜脈給藥用。

2 方法

2.1 色譜條件

Phenomenex Synergi Polar-RP色譜柱(250 mm×4.6 mm，4 μm)，有預(yù)柱；流動相為乙腈(A)-0.1%甲酸(B)；梯度洗脫(0～12 min，2%～15%A；12～15 min，15%～27%A；15～27 min，27%～45%A；27～30 min，45%～2%A)；流速1.0 mL·min-1；進(jìn)樣量10 μL。

2.2 質(zhì)譜條件

Accela 600泵，電噴霧離子源(ESI)，負(fù)離子掃描模式，掃描范圍m/z：100～1000。毛細(xì)管溫度：350 ℃，毛細(xì)管電壓：-35 V，氣化溫度：300 ℃，鞘流氣流量：17 L·min-1。

2.3 給藥及采血

實驗動物按取血時間分為6個時間點，加上空白對照組，共7個組，每組雌雄各1只大鼠。實驗組動物0.004 5 mL·g-1尾靜脈注射給藥，0.003 5 mL·g-110%水合氯醛腹腔注射的方式麻醉，給藥后0、5、15、30、60、90 min下腔靜脈取血。

2.4 樣品處理

各時間點血樣均放置在室溫中，2.5 h靜置凝出血清，5000 r·min-1離心10 min(離心半徑為6.6 cm)，取上清液。雌雄各取0.8 mL血清混合，血清配總提取物組為1.6 mL空白血清，加入50 mg·mL-1總提取物溶液44 μL。上述樣品均分別加入3倍量乙腈混合，沉淀蛋白，12 000 r·min-1離心15 min(離心半徑為5.6 cm)，取上清液。吸取全部上清液，于37 ℃氮氣吹干，再用未吹干前體積的1/20倍甲醇復(fù)溶。超聲溶解2 min，12 000 r·min-1離心15 min(離心半徑為6.6 cm)。吸取上清液備LC-ESI-MS分析用。最終樣品為原血清樣品濃縮的5倍，血清配總提取物的最終檢測質(zhì)量濃度為6.67 mg·mL-1。

3 結(jié)果

各時間點LC-ESI-MS的質(zhì)譜總離子流圖，見圖1。

3.1 原型成分質(zhì)譜裂解規(guī)律分析

根據(jù)LC-ESI-MS數(shù)據(jù)分析了酚酸類、黃酮類、生物堿類原型成分在質(zhì)譜電噴霧離子源(ESI)系統(tǒng)中形成的碎片(表1)，并對其斷裂規(guī)律進(jìn)行歸納總結(jié)。

酚酸類成分與糖結(jié)合的氧苷易斷裂，會產(chǎn)生葡萄糖醛酸碎片及其互補(bǔ)離子對，同時還會出現(xiàn)脫羧基的碎片等。

黃酮類成分幾乎全部是六碳糖碳苷，其中代表性的碎片為[M-C2H4O2-H]-、[M-C3H6O3-H]-、[M-C4H8O4-H]-、[M-C5H10O5-H]-、[M-C6H12O6-H]-等。葒草素、葒草素-2″-O-β-L-半乳糖苷、2″-O-(2?-甲基丁酰基)葒草素及6?-HMG-2″-O-β-L-半乳糖苷葒草素等均存在葒草素特征離子碎片m/z357、327，而葒草素-2″-O-β-L-吡喃木糖苷與葒草素-2″-O-β-L-半乳糖苷的結(jié)構(gòu)基本相同，前者在2″連了1個五碳糖，后者連了1個六碳糖，相差1個CH2O，故其離子碎片基本為葒草素-2″-O-β-L-半乳糖苷的特征離子碎片減去1個甲氧基。牡荊素、牡荊素-2″-O-β-L-半乳糖苷等均存在m/z341、311等牡荊素特征離子碎片。2″-O-(2?-甲基丁?；?牡荊素和3″-O-2-甲基丁酰牡荊素是同分異構(gòu)體，僅甲基丁酰基的位置不同，均存在m/z323、293，即牡荊素特征碎片失去1分子水。同時，2″-O-(2?-甲基丁酰基)牡荊素的特征離子碎片也基本為金蓮花碳苷Ⅲ減去1個甲基。異槲皮素的碎片中存在m/z151.00和311.12，可能是經(jīng)逆狄爾斯-阿德爾(RDA)裂解產(chǎn)生的A1，3-離子碎片。

注：A. 大鼠空白血清；B. 血清配總提取物；C. 0 min含藥血清；D. 5 min含藥血清；E. 15 min含藥血清；F. 30 min含藥血清；G. 60 min含藥血清；H. 90 min含藥血清。圖1 空白血清、血清配總提取物和含藥血清的總離子流圖

表1 原型成分結(jié)構(gòu)式及二級碎片信息

續(xù)表1

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生物堿類原型成分只檢測到了金蓮花堿，樣品中金蓮花堿的提取離子流圖顯示，保留時間為14.9 min，但是這個時間點的提取離子流圖是金蓮花堿的硫酸酯化產(chǎn)物m/z298.04。由于硫酸酯鍵易斷裂，因此在提取離子流圖中就能提到其最大豐度的二級碎片m/z218.08[M-H]-。金蓮花中的金蓮花堿在體內(nèi)的代謝較快，基本被上述提取峰所壓制，故在提取離子流圖中沒有體現(xiàn)。

3.2 代謝產(chǎn)物及代謝規(guī)律分析

酚酸類成分的代謝過程大多為結(jié)合反應(yīng)，如藜蘆酸、金蓮花苷及原金蓮酸的羧羥基可與硫酸酯以酯鍵結(jié)合，也可以同甘氨酸以肽鍵結(jié)合。該羧基還可以發(fā)生還原反應(yīng)，還原為醇羥基后，再進(jìn)行結(jié)合。除此之外還會發(fā)生O-脫甲基或直接脫甲氧基的現(xiàn)象，O-脫甲基形成羥基后也可發(fā)生與葡萄糖醛酸結(jié)合及上述其他結(jié)合反應(yīng)。金蓮花苷及原金蓮酸都易發(fā)生ω-氧化，金蓮花苷的氧化位置可能為3-位甲氧基，原金蓮酸則可能發(fā)生于C3側(cè)鏈末端或C5位[10]。酚酸類成分代謝途徑見圖2～3，各代謝產(chǎn)物結(jié)構(gòu)及二級碎片信息見表2。

黃酮類成分代謝過程大多為開環(huán)裂解過程，可能會發(fā)生A型或B型裂解，生成C6-C3及C6-C2型衍生物，其羥基同樣會發(fā)生葡萄糖醛酸、硫酸酯結(jié)合反應(yīng)或羧基還原成醛后發(fā)生甲基結(jié)合反應(yīng)。黃酮類成分代謝途徑見圖4，各代謝產(chǎn)物結(jié)構(gòu)及二級碎片信息見表3。

金蓮花堿多為葡萄糖醛酸、硫酸酯及甲基結(jié)合反應(yīng)，除此之外也可能發(fā)生雜環(huán)開裂等過程，其代謝途徑見圖5，各代謝產(chǎn)物結(jié)構(gòu)及二級碎片信息見表4。

注：A.代謝途徑一；B.代謝途徑二。圖2 藜蘆酸體內(nèi)代謝途徑

圖3 金蓮花苷及原金蓮酸體內(nèi)代謝途徑

表2 酚酸類代謝產(chǎn)物及二級碎片信息

續(xù)表2

續(xù)表2

續(xù)表2

圖4 黃酮類成分體內(nèi)代謝途徑

表3 黃酮類代謝產(chǎn)物及二級碎片信息

續(xù)表3

續(xù)表3

續(xù)表3

續(xù)表3

圖5 金蓮花堿體內(nèi)代謝途徑

表4 生物堿類代謝產(chǎn)物及二級碎片信息

4 討論

金蓮花中的酚酸基本上是以藜蘆酸和金蓮花苷及其衍生物為主。本研究發(fā)現(xiàn)藜蘆酸和金蓮花苷在體內(nèi)發(fā)生的Ⅱ相代謝[12],以硫酸酯化、甲基化、葡萄糖醛酸化和氨基酸結(jié)合反應(yīng)為主，其中氨基酸一般指的是甘氨酸，這類型代謝產(chǎn)物還會通過酰胺鍵的斷裂再生成新的代謝產(chǎn)物。藜蘆酸Ⅰ相代謝的氧化分為甲氧基末端的ω氧化、芳香環(huán)上加氧成羥基和環(huán)氧化。還原大多指羧基的還原，一般會經(jīng)歷羧基還原成醛最終還原成醇的過程。金蓮花苷的氧化除了甲氧基末端的ω氧化和O-脫甲基等外，還有側(cè)鏈末端的ω氧化、烯鍵氧化和環(huán)氧化。烯鍵氧化一般會產(chǎn)生羧基，再發(fā)生還原，依次生成醛和醇。醛會通過重排生成烯醇，雙鍵環(huán)氧化后最終會水解生成2個羥基。除此以外本研究表明,金蓮花提取物體內(nèi)代謝和單體酚酸體內(nèi)代謝的最大不同在于金蓮花提取物能夠產(chǎn)生兩類酚酸的縮合產(chǎn)物，其中尤以藜蘆酸的羧基還原為醇后易發(fā)生縮合反應(yīng)。

金蓮花中黃酮類成分以碳苷為主，各成分可以通過水解轉(zhuǎn)化，同時其水解反應(yīng)也是黃酮類成分在體內(nèi)的重要反應(yīng)類型。經(jīng)靜脈注射給藥黃酮類成分的主要代謝器官是肝臟，而發(fā)生的反應(yīng)主要是Ⅱ相代謝，包括硫酸酯化、甲基化和葡萄糖醛酸反應(yīng)，這類反應(yīng)使原型成分極性增加，利于排泄或者失活?？偨Y(jié)研究成果發(fā)現(xiàn)，當(dāng)黃酮母核B環(huán)只存在4′位1個羥基時，易發(fā)生葡萄糖醛酸反應(yīng)，當(dāng)同時存在3′-和4′-2個羥基時，容易同時發(fā)生甲基和硫酸酯結(jié)合反應(yīng)，或者是甲基和葡萄糖醛酸結(jié)合反應(yīng)，甲基化一般發(fā)生在3′-羥基。黃酮類成分還會發(fā)生裂解，這類反應(yīng)一般是通過腸內(nèi)菌代謝產(chǎn)生，但是經(jīng)靜脈注射的給藥方式并不經(jīng)過腸代謝，可能的原因是體內(nèi)存在肝腸循環(huán)，能夠使經(jīng)靜脈注射給藥的中藥成分同樣擁有與口服給藥一樣完整的體內(nèi)代謝。本研究中黃酮類成分在體內(nèi)的開裂大多為A型或B型開裂2種，A型開裂部位在C環(huán)的C4和A環(huán)的C5之間，生成C6-C3型(苯丙酸)衍生物和間苯三酚衍生物；B型開裂則發(fā)生于C環(huán)的C3和C4之間，生成C6-C2型(苯乙酸)衍生物，黃酮醇一般發(fā)生B型開裂。黃酮類成分開裂形成的C6-C3型和C6-C2型衍生物和酚酸一樣會在體內(nèi)發(fā)生Ⅰ相和Ⅱ相代謝生成對應(yīng)的代謝產(chǎn)物。

金蓮花堿在體內(nèi)的Ⅱ相代謝也是以甲基化、硫酸酯化和葡萄糖醛酸化為主，其他類型的反應(yīng)應(yīng)該都與其雜環(huán)開裂有關(guān)，雜環(huán)開裂形成的伯胺又易發(fā)生乙?；磻?yīng)。