石彩歌 肖奇志 黃士荷 張素粉 王群慧 陳興 聶繼躍 郭天棋

干擾素-α（IFN-α）和腫瘤壞死因子-β（TNF-β）在機體抵御微生物感染和抗腫瘤中有著非常重要的作用[1-6]。研究表明IFN-α和TNF-β上特定位點的基因多態(tài)性與免疫系統(tǒng)清除病原體及腫瘤患者的病情發(fā)展具有相關性[7-10]。其中IFN-α的rs6475526位點基因多態(tài)性與直腸癌發(fā)病有關；TNF-β的rs2239704位點的基因多態(tài)性可能與血液腫瘤的病情發(fā)展具有一定的相關性；TNF-β的rs909253位點的基因型多態(tài)性與胃癌和乳腺癌等腫瘤的發(fā)生密切相關。開展細胞因子的基因多態(tài)性臨床檢測研究有助于進一步開展細胞因子抗腫瘤和抗病毒機制的研究，提高對癌細胞病變過程的認識。本文以熒光探針熔解曲線技術平臺為基礎，建立了一個能夠單管同步檢測IFN-α的rs6475526位點和TNF-β的rs2239704、rs909253位點基因多態(tài)性的三重檢測體系。

1 資料與方法

1.1 基因多態(tài)性熔解曲線分析檢測體系的建立

本研究開發(fā)了一個能夠在單個實時熒光PCR體系中同步檢測IFN-α的rs6475526位點和TNF-β的rs2239704、rs909253位點的9種基因多態(tài)性的熔解曲線分析檢測體系。其技術原理如圖1所示，采用二重PCR擴增和三色熒光探針熔解曲線方案。其中IFN-F引物（5’-ACATTATTAAGTTGGGAGAAG TGTC-3’）和IFN-R引物（5’-ATGTATACATAAACTCAAG AGGTCA-3’）可擴增IFN-α基因片段并通過FAM熒光探針（5’-FAM-CACCTTATCATGTCTCTTAGAAGAAAGAAAGGTGBHQ1-3’）同步檢測rs6475526位點的3種基因多態(tài)性；TNF-F引物（5’-CAGTCAGAGAAACCCCAA-3’）和TNF-R引物（5’-CTTCCTCTATAAAGGGACCTG -3’）可擴增TNF-β基因片段并通過Cy5熒光探針（5’-Cy5-TAGGACACTGCGGGGCGGTAGTCCT-BHQ2-3’）檢測同步檢測rs6475526位點的3種基因多態(tài)性，通過ROX熒光探針（5’-ROXTAGAGAGGAATCATGGCAGA-BHQ2-3’）檢測同步檢測rs909253位點的3種基因多態(tài)性。

檢測體系的PCR反應體系體積共計25 μL，檢測體系成分 如 下：1 X TaqHS Buffer，3 mM MgCl2，0.2 mM dNTPs，2.0 U的TaqHS聚合酶（Takara，大連寶生物工程有限公司），50 nM IFN-F引物和TNF-F引物，500 nM IFN-R引物和TNF-R引物，IFN-α的rs6475526位點和TNF-β的rs2239704、rs909253位點的檢測熒光探針各500 nM。檢測儀器為SLAN-96實時熒光PCR儀（上海宏石醫(yī)療科技有限公司），檢測程序如下：PCR擴增程序為95℃5 min；10個循環(huán)的95℃ 15 s，65℃至55℃（每個循環(huán)降低1℃） 20 s和76℃ 20 s；50個循環(huán)的95℃ 15 s，65℃ 20 s和76℃ 20 s；熔解曲線分析程序為95℃2 min；40℃2 min；隨后按0.4℃/step的升溫速率（每個step的維持時間是5 s），將反應體系的溫度從40℃升溫至85℃，并在此過程中采集FAM、Cy5和ROX通道的熒光信號。

1.2 臨床試驗入組病例資料

本次臨床試驗共入組本院2018年1月—2019年6月共計282例宮頸拭子樣本。其中237例樣本采集自宮頸疾病的患者，45例樣本采集自體檢健康人群。宮頸疾病的患者包括：宮頸癌患者46例；宮頸上皮內(nèi)瘤變Ⅲ級（CIN Ⅲ）患者50例；宮頸上皮內(nèi)瘤變Ⅱ級（CIN Ⅱ）患者46例；宮頸上皮內(nèi)瘤變Ⅰ級（CIN Ⅰ）患者49例；宮頸炎患者46例。全部患者均因白帶異常、宮頸炎、陰道流血、接觸性出血、宮頸炎、陰道流血等癥狀出現(xiàn)而就診。所有病例均有性生活史，就診前一周內(nèi)未使用過抗生素行陰道藥物治療。宮頸疾病患者的年齡范圍為19～63歲，平均年齡及其標準偏差為（39.86±10.68）歲；健康人群的年齡范圍為26～66歲，平均年齡及其標準偏差為（42.56±10.96）歲。經(jīng)獨立樣本t檢驗后P= 0.124＞0.05，宮頸疾病患者與健康人群間的年齡分布無統(tǒng)計學差異。

1.3 臨床試驗方案

臨床試驗采用雙盲法對全部282例的入組樣本同步進行熔解曲線分析檢測體系與Sanger測序的平行檢測，檢測結(jié)果由第三方人員核對。臨床試驗具體方案如下：（1）用Qiagen人類組織和細胞DNA提取試劑盒提取宮頸拭子中的人基因組DNA。（2）將提取后的基因組DNA均分為兩份，一份直接加樣進行解曲線分析體系檢測，另一份再均分為三份分別用進行PCR擴增后獨立進行Sanger測序驗證。（3）第三方人員核對熔解曲線分析檢測體系與Sanger測序檢測結(jié)果，并計算兩種檢測方法的一致率。

1.4 統(tǒng)計學方法

用SPSSV22.0軟件統(tǒng)計IFN-α的rs6475526位點和TNF-β的rs2239704、rs909253位點在不同類型病例中的基因多態(tài)性分布，并采用卡方（χ2）檢驗驗證P值是否小于0.05，不同類型人群的基因型多態(tài)性分布是否具有差異性。

2 結(jié)果

2.1 基因多態(tài)性熔解曲線分析檢測體系的建立

圖1 多重熒光探針熔解曲線檢測IFN-α和TNF-β基因多態(tài)性技術原理圖

圖2 多重熒光探針熔解曲線檢測IFN-α的rs6475526基因多態(tài)性的檢測結(jié)果圖（左圖）；同一樣本的Sager測序?qū)φ战Y(jié)果（右圖）

圖3 本次臨床試驗中rs6475526、rs2239704和rs909253位點基因多態(tài)性分布圖

本研究基于熒光探針熔解分析曲線技術平臺，建立了一個同步檢測IFN-α的rs6475526位點和TNF-β的rs2239704、rs909253位點基因多態(tài)性的檢測體系。圖2以FAM熒光通道IFN-α的rs6475526位點結(jié)果為例，左圖為熔解曲線檢測體系對rs6475526位點三種多態(tài)性基因型樣本的檢測結(jié)果：當在60.0℃處出現(xiàn)熔解曲線峰時為T/T基因型；當在53.0℃處出現(xiàn)熔解曲線峰時為C/C基因型；當在60.0℃和53.0℃處同時出現(xiàn)熔解曲線峰時為C/T基因型。檢測結(jié)果對應的測序圖譜詳見圖2右圖，本次臨床試驗中Sanger測序采用反向引物測序，因此圖譜中顯示的是對應的互補堿基。

TNF-β的rs2239704位點檢測熒光通道為Cy5熒光通道，當在74.2℃處出現(xiàn)熔解曲線峰時為T/T基因型；當在68.7℃處出現(xiàn)熔解曲線峰時為G/G基因型；當在74.2℃和68.7℃處同時出現(xiàn)熔解曲線峰時為G/T基因型。TNF-β的rs909253位點檢測熒光通道為ROX熒光通道，當在61.5℃處出現(xiàn)熔解曲線峰時為C/C基因型；當在57.7℃處出現(xiàn)熔解曲線峰時為T/T基因型；當在61.5℃和57.7℃處同時出現(xiàn)熔解曲線峰時為C/T基因型。

2.2 臨床試驗結(jié)果分析

2.2.1 基因多態(tài)性統(tǒng)計分析 本次臨床試驗中，熔解曲線分析檢測體系和Sanger測序技術對282例宮頸拭子樣本的IFN-α的rs6475526位點和TNF-β的rs2239704、rs909253位點基因多態(tài)性檢測結(jié)果一致率為100%，具體基因型分布如圖3所示，其中TNF-β的rs909253位點基因型分布為：C/C基因型83例（29.4%），C/T基因型120例（42.6%），T/T基因型79例（28.0%）；rs2239704位點基因型分布為：T/T基因型144例（51.1%），G/T基因型99例（35.1%），G/G基因型39例（13.8%）；IFN-α的rs6475526位點基因型分布為：T/T基因型122例（43.3%），C/T基因型129例（45.7%），T/T基因型31例（11.0%）。

圖4 本次臨床試驗中不同組人群樣本在rs6475526、rs2239704和rs909253位點上的基因型多態(tài)性分布差異圖

2.2.2 患者健康狀況與基因多態(tài)性關系分析 根據(jù)入組人群的健康狀況和患病類型，本研究在圖4中對檢測結(jié)果進行歸類分析。由于不同基因型樣本例數(shù)差距較大，圖4中采用樣本基因型性分布率（基因型中特定人群數(shù)/該基因型的總?cè)虢M人數(shù)）代替樣本數(shù)進行統(tǒng)計。從統(tǒng)計結(jié)果中可以看出：IFN-α的rs6475526位點中，健康人群在T/C基因型中分布率（18%）高于T/T（15%）和C/C基因型（16%）；TNF-β的rs2239704位點中，健康人群在G/G基因型中分布率（26%）高于T/T（15%）和T/G基因型（13%）；TNF-β的rs909253位點中，健康人群在C/T基因型中分布率（18%）高于C/C（16%）和T/T基因型（14%）。經(jīng)卡方（χ2）檢驗健康人群和患宮頸疾病人群在IFN-α的rs6475526位點和TNF-β的rs2239704、rs909253位點中的基因多態(tài)性分布率的P值均小于0.05，即健康人群和患病人群在這三個位點的基因多態(tài)性分布率都具有差異性。

3 討論

細胞因子的特定位點基因多態(tài)性與腫瘤細胞的產(chǎn)生和清除密切相關，IFN-α和TNF-β是其中兩類重要的抗病毒和抗腫瘤細胞因子。已有研究表明IFN-α的rs6475526位點和TNF-β的rs2239704、rs909253位點的基因多態(tài)性與多種腫瘤的病情發(fā)展相關[7-10]。目前對基因多態(tài)性的檢測方法的金標準依舊是傳統(tǒng)的Sanger測序技術。Sanger測序技術對基因多態(tài)性的識別有很高的準確性，但是Sanger測序技術如果要檢測多種細胞因子的不同基因位點就需要進行多管的PCR擴增后再進行多次的測序檢測[11]。而且Sanger測序的檢測通量非常有限，難以對大批量的樣本開展臨床試驗。建立簡便、快速并適合臨床使用的基因多態(tài)性檢測技術可為開展大規(guī)模的基因多態(tài)性臨床試驗，也進一步為研究基因多態(tài)性與疾病的相關性提供有力的工具。

已有大量研究報道證實多重熒光探針熔解曲線技術在基因多態(tài)性檢測中具有很好的檢測準確性和臨床適用性[12-16]。本研究以IFN-αrs6475526位點和TNF-β的rs2239704、rs909253位點為模型，驗證了多重熒光探針熔解曲線在細胞因子基因多態(tài)性臨床檢測中應用的可行性。在此基礎上開展了小規(guī)模的臨床驗證實驗。從圖1技術原理中可以看出本文所建立的三色熒光探針熔解曲線分析檢測體系可以在單個PCR管內(nèi)同步檢測9種基因多態(tài)性。無論是純合樣本還是雜合樣本，檢測結(jié)果與金標準Sanger測序技術完全一致（圖2）。從圖2雜合樣本檢測結(jié)果中可以看出熔解曲線分析檢測體系檢測結(jié)果比Sanger測序技術更容易判讀。熔解曲線分析檢測體系在一臺實時熒光PCR儀上可在2小時內(nèi)同步檢測96例臨床樣本，且樣本DNA上樣后無需其它人工操作，對檢測人員的操作要求不高。該體系的檢測通量、操作簡便性和臨床適用性均明顯優(yōu)于傳統(tǒng)Sanger測序技術。為了證實熔解曲線分析檢測體系檢測結(jié)果的可靠性，本研究通過在本院收集的282例宮頸拭子進行了小規(guī)模的臨床試驗。試驗結(jié)果表明實熔解曲線分析檢測體系和Sanger測序技術檢測結(jié)果完全一致。本次臨床試驗結(jié)果在一定范圍內(nèi)反映了珠海地區(qū)人群在IFN-αrs6475526位點和TNF-β的rs2239704、rs909253位點中的基因多態(tài)性分布情況。根據(jù)人群健康狀況進行進一步分析后可以看出健康人群樣本和宮頸疾病患病人群樣本在這三個位點的基因型多態(tài)性中的分布情況具統(tǒng)計學差異性（P＜0.05）?？梢娺@三個位點的基因多態(tài)性可能和宮頸疾病的發(fā)生和發(fā)展具有特定的相關性。

綜上所述，本研究證明了熒光探針熔解曲線技術在IFN-α和TNF-β基因多態(tài)性檢測中臨床應用的可行性，為細胞因子基因多態(tài)性的臨床檢測增加了一種準確且高效的臨床檢測方法。所建立的熒光探針熔解曲線檢測體系具備很好的設計彈性，通過改變引物和探針序列即可檢測其它基因多態(tài)性位點，有望能夠在細胞因子基因多態(tài)性的臨床檢測中廣泛應用。