崔新剛 王穎瑩 王新勝

1. 洛陽市婦幼保健院，河南 洛陽 471000；2. 洛陽市食品藥品檢驗所，河南 洛陽 471000；3. 河南科技大學化工與制藥學院，河南 洛陽 471000

三黃片系由大黃、黃芩浸膏、鹽酸小檗堿組成的中藥復方制劑，具有清熱解毒、瀉火通便的功效，為《中國藥典》收載的成方制劑[1]。主治三焦熱盛、目赤腫痛、口鼻生瘡、咽喉腫痛、心煩口渴、尿黃便秘[2]。目前，我國已有數家藥廠的三黃片投放市場，但臨床反映不同廠家三黃片的質量存在差異[3]。目前，報道市售三黃片質量控制方法多為單味藥大黃或其中兩味有效成分的檢測含量測定[4-6]，并不能全面反映市售三黃片的質量差異?！吨袊幍洹?015年版中規(guī)定對三黃片中的大黃素和大黃酚總量、鹽酸小檗堿以及黃芩苷含量進行測定，以此作為三黃片的質量評價指標。本研究基于HPLC法對不同廠家的10批三黃片指標成分進行分析，并結合聚類分析和主成分分析對其含量測定結果初步進行綜合分析，探討不同廠家三黃片質量差異，旨在為其質量控制提供依據。

1 材料

1.1 儀器 Agilent1200型高效液相色譜儀，包括G1315B型二極管陣列檢測器、自動進樣器(美國安捷倫科技有限公司)；KQ-100ES超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；賽多利斯BSA8201電子天平[賽多利斯科學儀器(北京)有限公司]；易普易達Smart-S2型超純水機(南京易普易達科技發(fā)展有限公司)。

1.2 藥品與試劑 大黃素對照品(中國食品藥品檢定研究院，批號：110756-201810)；大黃酚對照品(中國食品藥品檢定研究院，批號：110796-201814)；鹽酸小檗堿對照品(中國食品藥品檢定研究院，批號：110713-201711)；10批樣品分別為河南A廠(批號：190501-190702)、河北的B廠(批號：180901-181003)、山東的C廠(批號：190710-190912)、貴州的D廠(批號：20190201-20190402)、廣西的E廠(批號：181107-181212)；甲醇、乙腈為色譜純(天津天津市科密歐化學試劑有限公司)；磷酸為分析純(國藥集團化學試劑有限公司)。

2 方法與結果

2.1 大黃素和大黃酚的含量測定

2.1.1 色譜條件 色譜柱：Sysmetry C18 色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；柱溫：25 ℃；流速：1.0 mL·min-1；流動相：甲醇-0.1%磷酸溶液(85∶15)；進樣量：10 μL；檢測波長：254 nm。

2.1.2 對照品制備 精密稱取大黃素和大黃酚對照品適量，加無水乙醇-乙酸乙酯(2∶1)混合溶液制成每1 mL含大黃素10 μg,大黃酚25 μg的混合溶液，即得。

2.1.3 供試品制備 取本品20片，除去包衣，精密稱定，研細(過三號篩)，取約0.26 g，精密稱定，置錐形瓶中，精密加入乙醇25 mL,稱定重量，加熱回流1 h，放冷，用乙醇補足減失的重量，搖勻、濾過，精密量取續(xù)濾液10 mL，置燒瓶中，蒸干，加30%乙醇—鹽酸(10∶1)的混合溶液15 mL，置水浴中加熱回流1 h，立即冷卻，用三氯甲烷強力振搖提取4次，每次15 mL，合并三氯甲烷液，蒸干，殘渣用無水乙醇-乙酸乙酯(2∶1)的混合溶液溶解，轉移至5 mL量瓶中，并稀釋至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.1.4 樣品測定 按2.1.3制備樣品溶液，精密吸取樣品溶液和對照品溶液各10 μL，按2.1.1色譜條件，分別測定10個樣品中的大黃素、大黃酚，以外標法計算含量。色譜圖如圖1所示，測定結果見表1。

圖1 對照品(A)和樣品(B)色譜圖

表1 不同廠家指標成分含量測定結果 /mg/片

2.2 鹽酸小檗堿的含量測定

2.2.1 色譜條件 色譜柱：Sysmetry C18 色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；柱溫：25 ℃；流速：1.0 mL·min-1；流動相：乙腈-水(1∶1)(每1000 mL中加入磷酸二氫鉀3.4 g和十二烷基硫酸鈉1.7 g)；進樣量：10 μL；檢測波長：265 nm。

2.2.2 對照品制備 精密稱取鹽酸小檗堿對照品適量，加甲醇制成每1 mL含0.1 mg的溶液，即得。

2.2.3 供試品制備 取本品10片，除去包衣，精密稱定，研細，取約0.1 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇-鹽酸(500∶1)的混合溶液20 mL密塞，稱定重量，超聲處理30 min，放冷，再稱定重量，用甲醇補足減失的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.2.4 樣品測定 按2.1.4樣品測定方法。色譜圖如圖2所示，測定結果見表1。

A.標準品 B.樣品圖2 鹽酸小檗堿高效液相色譜圖

2.3 黃芩苷的含量測定

2.3.1 色譜條件 色譜柱：Sysmetry C18 色譜柱(250 mm×4. 6 mm，5 μm)；柱溫：25 ℃；流速：1.0 mL·min-1；流動相：甲醇-0.1%磷酸溶液(55∶45)；進樣量：10 μL；檢測波長：280 nm。

2.3.2 對照品制備 取黃芩苷對照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1 mL含25 μg的溶液，即得。

2.3.3 供試品制備 取本品10片，除去包衣，精密稱定，研細，取約0.1 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入70%甲醇25 mL，密塞，稱定重量，超聲處理10 min，放冷，再稱定重量，用70%甲醇補足減失的重量，搖勻，濾過，精密量取續(xù)濾液1 mL，置10 mL量瓶中，加70%甲醇至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.2.4 樣品測定 按2.1.4樣品測定方法。色譜圖如圖3所示，測定結果見表1。

A. 對照品 B.供試品 圖3 黃芩苷高效液相色譜圖

2.4 主成分分析 主成分分析(Principal Components Analysis, PCA)是使用較廣的多指標線性降維變換的多元統(tǒng)計分析方法，廣泛應用于中藥的質量評價[7-8]。本研究以5個含量測定結果為變量，運用SPSS 24.0軟件，對10批三黃片進行主成分分析，計算成分特征值、貢獻率及累計貢獻率，前3個主成分累計貢獻率為 91.821%，可以反映三黃片質量，結果見圖4和表2。由圖4可知將不同生產廠家的三黃片大致分為4類，編號5、6、7和8為一類，編號3和4為一類，1和2為一類，9和10為一類。

表2 主成分特征值和貢獻率

圖4 主成分得分圖

2.5 聚類分析 聚類分析是將相似樣品歸類的最常用方法，不僅能將樣品聚類，還能反應樣品間的相近程度[9-10]。本研究以5個含量結果為變量，運用SPSS 24.0 統(tǒng)計軟件，以平均Euclidean距離為度量標準，采用組間聯(lián)接的方法對10批三黃片進行系統(tǒng)聚類分析，結果如圖5所示。由圖可知在組間距為25時，將10個廠家生產的三黃片分為4類，編號5-8分為一類，編號1和2為一類，編號3和4為一類，及編號9和10為一類。該結果與主成分分析結果一致。

圖5 聚類分析圖

3 討論

三黃片為我國傳統(tǒng)的中藥復方制劑，是常用臨床藥。由表1可知，不同廠家三黃片都合格，符合《中國藥典》要求，但其中指標成分差異顯著。這可能與各廠家選取藥材的產地、季節(jié)及加工炮制工藝有關，建議廠家嚴格控制藥材的基源，做到藥材可以溯源，從源頭保證藥材的穩(wěn)定。且不同廠家在生產過程中工藝路線不同，包括黃芩煎煮時間、投入溶劑量、溫度和濃縮環(huán)節(jié)的溫度、浸膏含水量等都影響三黃片質量。因此，廠家從源頭到生產不同環(huán)節(jié)嚴格把關，原藥材符合要求，生產工藝規(guī)范，確保生產藥品質量穩(wěn)定，以保證臨床療效和安全。

本實驗通過主成分分析和聚類分析將同一廠家不同批次的樣品聚在一組，說明同一廠家的生產工藝穩(wěn)定。山東C廠和貴州D廠的三黃片聚為一類，表明兩個生產廠家在原料來源和生產工藝具有類似之處。本實驗系統(tǒng)檢測了三黃片中三味藥的指標成分，獲得的聚類分析和主成分分析結果可為三黃片的質量控制提供依據。