黎江華 劉超蘭 馮 興 楊曉雁 郭義東

（成都大學(xué)， 四川抗菌素工業(yè)研究所， 四川成都610052）

傳統(tǒng)中藥百藥煎是由五倍子經(jīng)發(fā)酵制備而成，其始載于《丹溪心法》，炮制方法則最早被記載于《本草蒙筌》，另在《醫(yī)學(xué)入門》 《本草綱目》 等亦有記載。然歷代文獻(xiàn)記載的發(fā)酵制法中主要輔料為酒麯或酵糟或兩者均未加入；另有桔梗、甘草，水紅廖、烏梅煎，細(xì)茶，小廖汁、細(xì)茶及真茶汁加入之異［1］。進(jìn)一步查閱歷版《中國(guó)藥典》、全國(guó)各地炮制規(guī)范，僅浙江、四川和江西中藥炮制規(guī)范及北京中藥材標(biāo)準(zhǔn)，京幫、武漢文幫記載了其炮制方法，同樣存在輔料的不同記載，如北京用白酒曲，浙江和四川用酒糟，江西用米酒等［1?5］，尚無(wú)規(guī)范化、標(biāo)準(zhǔn)化的百藥煎的制備工藝。目前，已有文獻(xiàn)對(duì)五倍子發(fā)酵過(guò)程中酒曲的篩選和發(fā)酵工藝優(yōu)化進(jìn)行了報(bào)道［6?7］，探討了綠茶及其不同加入方式對(duì)五倍子發(fā)酵的影響［8］，而主要輔料酒曲與酒糟的差異性相關(guān)研究報(bào)道較少，且兩者的微生物多樣性差異分析尚無(wú)報(bào)道。

傳統(tǒng)研究微生物方法多為分離培養(yǎng)法，分離得到的微生物在種類和數(shù)量上均有限；隨著分子生物技術(shù)的發(fā)展成熟，尤其是高通量測(cè)序技術(shù)的研發(fā)與應(yīng)用，已逐步成為微生物研究領(lǐng)域強(qiáng)有力的工具。該方法無(wú)需培養(yǎng)分離菌群，卻能方便快捷、客觀還原實(shí)驗(yàn)樣品中微生物菌群結(jié)構(gòu)，并已成熟應(yīng)用到環(huán)境微生物［9］、茶葉發(fā)酵微生物［10］、食醋與酒等釀造微生物［11?12］的分析。因此，本實(shí)驗(yàn)以宜賓某酒廠生產(chǎn)白酒前后的酒曲與酒糟為研究對(duì)象，擬采用高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)比分析兩者的微生物多樣性。以期通過(guò)微生物多樣性的差異分析，探討主要輔料不同而均能得到百藥煎（五倍子發(fā)酵品） 的科學(xué)依據(jù)，以期為后續(xù)建立五倍子發(fā)酵百藥煎的微生物體系指標(biāo)（功能微生物群） 及進(jìn)一步優(yōu)化其制備工藝奠定基礎(chǔ)。

1 材料

1.1 材料 酒曲與酒糟樣品取自四川省宜賓市某濃香型白酒酒廠。Tris?酚購(gòu)于美國(guó)Sigma 公司；RNA 酶、Ex Taq 酶購(gòu)于日本TaKaRa Biotechnology公司。GeneJET 膠回收試劑盒購(gòu)于美國(guó)Thermo Sci?entific 公司；Qubit2.0 DNA 檢測(cè)試劑盒購(gòu)于美國(guó)Life 公司。氯仿、異戊醇、無(wú)水乙醇等均為分析純。

1.2 儀器 MastercyclerPCR 儀 （德國(guó)Eppendorf公司）；PowerPac3000 電泳儀 （美國(guó)Bio?Rad 公司）；Iontorrent 高通量測(cè)序平臺(tái)、Pico?21 臺(tái)式離心機(jī)（美國(guó)Thermo Fisher 公司）；GL?88B 漩渦混合器（海門其林貝爾儀器制造有限公司）。

2 方法與結(jié)果

2.1 方法

2.1.1 樣品準(zhǔn)備 分別取酒廠的酒曲與酒糟各約10 g，迅速粉碎并密封于無(wú)菌袋中，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.1.2 樣品基因組DNA 提取 采用CTAB 法分別提取酒曲與酒糟中微生物基因組DNA。具體步驟為樣品預(yù)處理，CTAB 法提取緩沖液，采用Tris酚、氯仿、異戊醇抽提，異丙醇沉淀，70%乙醇洗滌，DNA 溶解及RNA 酶酶解等。再用1% 瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA 純度和濃度，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.1.3 PCR 擴(kuò)增及高通量測(cè)序 利用引物（341F、806R） 和引物（ITS1F、ITS2R） 分別對(duì)細(xì)菌16S rDNA 的V3?V4 區(qū)和真菌內(nèi)源轉(zhuǎn)錄間隔ITS1 區(qū)進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，產(chǎn)物使用2%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測(cè)回收，并用GeneJET 膠回收試劑盒純化，利用單端測(cè)序的方法，構(gòu)建小片段文庫(kù)，構(gòu)建好的文庫(kù)經(jīng)過(guò)Qubit 定量和文庫(kù)檢測(cè)合格后，再采用IonS5TMXL 測(cè)序平臺(tái)進(jìn)行上機(jī)測(cè)序（北京諾禾致源科技股份有限公司）。

2.1.4 序列數(shù)據(jù)處理與分析 使用Cutadapt（V1.9.1） 對(duì)Reads 進(jìn)行過(guò)濾，截去Barcode 和引物序列并去除嵌合體序列，得到最終的Clean Reads［13］；利用 Uparse 軟件 （V7.0.1001） 對(duì)Clean Reads 在97%的相似度水平下進(jìn)行聚類成為OTU （Operational taxonomic unit）［14］。根據(jù)OTU 的聚類結(jié)果，以SSUrRNA 數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)OTU 序列進(jìn)行物種注釋分析［15］，獲得分類學(xué)信息和酒曲與酒糟在不同分類水平上的菌群組成，用柱狀圖或餅圖進(jìn)行可視化。同時(shí)，使用Qiime （V1.9.1） 進(jìn)行OTU豐度與Alpha 多樣性指數(shù)的計(jì)算。

2.2 結(jié)果

2.2.1 樣品OTU 聚類分析 由表1 可知，本次高通量測(cè)序結(jié)果充分反映了酒曲與酒糟的微生物多樣性。酒曲中得到的可用于后續(xù)數(shù)據(jù)分析的細(xì)菌有效序列80 065 條，有效率為95.92%；真菌的有效序列31 898，有效率為95.71%。酒糟中得到的可用于后續(xù)數(shù)據(jù)分析的細(xì)菌有效序列80 096 條，有效率為97.32%；真菌的有效序列21 504，有效率為97.01%。酒曲與酒糟中細(xì)菌的ACE 和Chao1 指數(shù)均大于真菌，表明兩者中細(xì)菌菌群豐富度大于真菌菌群，提示細(xì)菌可能將在后續(xù)的五倍子發(fā)酵過(guò)程中發(fā)揮著重要的作用。從Shannon 指數(shù)和Simpson 指數(shù)來(lái)看，酒曲與酒糟中細(xì)菌群落的多樣性也高于真菌，且酒糟的細(xì)菌和真菌菌群的多樣性均高于酒曲。另外，兩者Coverage 指數(shù)都非常接近1，表明本實(shí)驗(yàn)測(cè)序結(jié)果能真實(shí)有效地反映酒曲與酒糟中微生物多樣性。

表1 樣品OTU 聚類和多樣性指數(shù)Tab.1 OTU clustering and diversity index of samples

2.2.2 樣品OTU 物種統(tǒng)計(jì) 將酒曲與酒糟中OTU以門、綱、目、科、屬、種的秩序依次進(jìn)行分類信息統(tǒng)計(jì)，分析兩者在各水平上的菌群結(jié)構(gòu)，見表2。

表2 樣品各分類水平OTU 物種統(tǒng)計(jì)Tab.2 Statistics of OTU species in each grade samples

由表2 可知，本研究的酒曲樣品中細(xì)菌菌群分布在6 個(gè)門、9 個(gè)綱、18 個(gè)目、23 個(gè)科、29 個(gè)屬中；真菌菌群分布在在4 個(gè)門、6 個(gè)綱、10 個(gè)目、16 個(gè)科、21 個(gè)屬中。而酒糟樣品中細(xì)菌菌群則分布在9 個(gè)門、12 個(gè)綱、25 個(gè)目、36 個(gè)科、56 個(gè)屬中；真菌菌群則分布在4 個(gè)門、9 個(gè)綱、14 個(gè)目、19 個(gè)科、28 個(gè)屬中。以上結(jié)果進(jìn)一步表明，酒曲與酒糟中細(xì)菌菌群多樣性均高于真菌菌群，且酒糟中細(xì)菌與真菌菌群多樣性則分別高于酒曲。另外，表2 中顯示酒曲與酒糟中微生物種水平的數(shù)據(jù)比屬水平少，特別是細(xì)菌種屬表現(xiàn)尤為明顯，這可能與16S rDNA 對(duì)于親緣關(guān)系較近的種屬分辨率不高，部分微生物的分類鑒定僅到屬水平相關(guān)；但采用16S rDNA 和ITS 的高通量測(cè)序法基本可在屬及以上水平準(zhǔn)確劃分微生物［16］。

2.2.3 樣品中微生物在門水平的組成 對(duì)酒曲與酒糟中微生物在門分類水平上進(jìn)行分析，并將菌群豐度大于或等于1% 劃分為優(yōu)勢(shì)菌門，其他菌門（豐度＜1.0%） 歸納為其他（Others），結(jié)果見圖1。酒曲細(xì)菌群主要包括厚壁菌門 （Firmicute，72%）、變形菌門 （Proteobacteria，20%） 及擬桿菌門（Bacteroidetes，7%），其他細(xì)菌菌門豐度值均小于1% （圖1 S1?B）；真菌群主要包括接合菌門 （Zygomycota，64%）、擔(dān) 子 菌 門（Basidiomycota，25%）、子囊菌門 （Ascomycota，10%），其他真菌菌門豐度值小于1% （圖1 S1?F）。酒糟細(xì)菌群主要包括厚壁菌門（Firmicute，38%）、放線菌門（Actinobacteria，24%）、變形菌門（Proteobacteria，22%）、藍(lán)細(xì)菌門（Cyanobac?teria，8%）、擬桿菌門 （Bacteroidetes，1%），另有未得到分類學(xué)注釋的菌群豐度值為5%，其他細(xì)菌菌門豐度值均小于1% （圖1 S2?B）；真菌群主要包括擔(dān)子菌門（Basidiomycota，57%）、子囊菌門（Ascomycota，25%）、接合菌門 （Zygomycota，9%），另有未得到分類學(xué)注釋的菌群豐度值為8%，其他真菌菌門豐度值小于1% （圖1 S2?F）。相對(duì)于酒曲，酒糟中細(xì)菌在門分類水平上還包括相對(duì)豐度值較大的放線菌門和藍(lán)細(xì)菌門，并有未得到分類學(xué)注釋的菌群；而真菌群中兩者在門分類水平上種類差異較小，但各菌門的相對(duì)豐度值差異較大。

圖1 樣品中細(xì)菌和真菌在門水平分布圖Fig.1 Bacteria and fungus species distribution map of samples in the phylum lever

2.2.4 樣品中微生物在屬水平的組成 由于高通量測(cè)序技術(shù)分析酒曲與酒糟檢測(cè)出大量微生物，多數(shù)菌群相對(duì)豐度值較低，為方便直觀查看，擬選擇在屬水平上的優(yōu)勢(shì)菌屬（豐度≥1.0%） 進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，其他菌門 （豐度＜1.0%） 同樣歸納為其他（Others），結(jié)果見圖2。

酒曲中細(xì)菌屬的分類水平按其豐度值排序，主要包括乳桿菌屬（Lactobacillus，31%）、魏斯氏菌屬 （Weissella，15%）、芽孢桿菌屬 （Bacillus，11%）、不動(dòng)桿菌屬（Acinetobacter，9%）、片球菌屬（Pediococcus，8%）、食單胞菌屬 （Stenotroph?omonas，2%）、Chishuiella（7%）、葡萄球菌屬（Staphylococcus，5%）、克雷伯菌屬 （Klebsiella，2%） 及泛菌屬（Pantoea，1%） 等，其他菌群豐度均小于1%，約占總菌群豐度的9% （圖2 S1?B）。酒曲中乳酸菌作為優(yōu)勢(shì)細(xì)菌對(duì)于白酒中風(fēng)味物質(zhì)的產(chǎn)生至關(guān)重要［17］。真菌屬則主要包括根霉屬（Rhizopus，64%）、絲孢酵母屬（Trichosporon，24%）、假絲酵母屬 （Candida，3%）、曲霉屬（Aspergillus，2%）、伊薩酵母屬 （Issatchenkia，2%）、嗜熱真菌屬 （Thermomyces，1%）、熱子囊菌屬（Thermoascus，1%） 等；其他菌群豐度均小于1%，約占總菌群豐度的3% （圖2 S1?F）。已有學(xué)者通過(guò)優(yōu)選百藥煎的炮制工藝研究，發(fā)現(xiàn)以根霉曲發(fā)酵五倍子的發(fā)酵效果最好［7］，而本實(shí)驗(yàn)檢測(cè)出酒曲中根霉屬真菌相對(duì)豐度高達(dá)64%，是否意味著酒曲中根霉屬真菌為五倍子發(fā)酵百藥煎的功能微生物及酒曲中的細(xì)菌菌群，在發(fā)酵過(guò)程中的作用均需進(jìn)一步研究。

圖2 樣品中細(xì)菌和真菌在屬水平分布圖Fig.2 Bacteria and fungus species distribution map of samples in the genus level

酒糟中細(xì)菌屬的分類水平按其豐度值排序，主要包括魏斯氏菌屬（Weissella，11%）、未定義藍(lán)細(xì)菌（Unidentified Cyanobacteria，8%）、芽孢桿菌屬 （Bacillus，7%）、食 單 胞 菌 屬（Stenotrophomonas，7%）、葡萄球菌屬 （Staphylo?coccus，6%）、短桿菌屬 （Brevibacterium，5%）、短狀桿菌屬 （Brachybacterium，4%）、乳桿菌屬（Lactobacillus，3%）、微桿菌屬 （Microbacterium，3%）、馬賽菌屬（Massilia，2%）、腸球菌屬（En?terococcus，2%）、片球菌屬 （Pediococcus，2%）、微球菌屬 （Micrococcus，2%）、庫(kù)克菌屬（Kocuria，2%）、纖維菌屬 （Cellulosimicrobium，2%）、巨球菌屬（Macrococcus，1%） 及擬桿菌屬（Bacteroides，1%） 等，另有未得到分類學(xué)注釋的菌群豐度為5%，其他菌群豐度占總菌群豐度的27% （圖2 S2?B）。真菌屬則主要包括絲孢酵母屬（Trichosporon，34%）、伊薩酵母屬 （Issatchenkia，9%）、Cutaneotrichosporon（8%）、Naganishia（7%）、根霉屬 （Rhizopus，5%）、毛霉屬（Mucor，4%）、Papiliotrema（2%）、威克漢姆酵母屬 （Wickerhamomyces，2%）、畢 赤 酵 母 屬（Pichia，2%）、紅酵母屬 （Rhodotorula，2%）、Apiotrichum（1%）、鐮刀菌屬 （Fusarium，1%）、Diutina（1%）、鏈格孢屬（Alternaria，1%）、散囊菌屬（Eurotium，1%）、曲霉屬（Aspergillus，1%）等，另有未得到分類學(xué)注釋的菌群豐度為12%，其他菌群豐度占總菌群豐度的6% （圖2 S2?F）。從真菌屬的分類水平來(lái)看，酒糟中主要優(yōu)勢(shì)真菌屬包括絲孢酵母屬和伊薩酵母屬，其中絲孢酵母屬是一種非釀酒酵母，但其具有豐富的酶系（如蛋白酶和脂肪酶），可以參與并促進(jìn)葡萄酒發(fā)酵而形成特有的品質(zhì)與風(fēng)味［18］。

2.2.5 樣品OTU?Venn 圖 從圖3 中可知，酒曲與酒糟中高相似度細(xì)菌OTU 有90 個(gè)，占酒曲總OTU 的84.11%，占酒糟總OTU 的22.84%；而高相似度真菌OTU 有65 個(gè)，占酒曲總OTU 的85.53%，占酒糟總OTU 的35.52%。

圖3 樣品中細(xì)菌和真菌OTU?Venn 圖Fig.3 OTU?Venn of bacteria and fungus species in samples

高相似度細(xì)菌和真菌OTU 數(shù)占酒曲總OTU 的比均較高，表明酒曲與酒糟共同的菌群可能是酒曲自有的微生物，也可能是宜賓地區(qū)酒曲特有的微生物體系，這與當(dāng)?shù)氐闹魄?dú)具地域性特色密切相關(guān)。而對(duì)于酒曲和酒糟間存在微生物體系的較大差異性，則可能與廠家發(fā)酵生產(chǎn)白酒的環(huán)境（原料、用水、空氣、窖池等） 及樣品的加工與儲(chǔ)存環(huán)境相關(guān)。因此可以認(rèn)為，酒曲與酒糟中微生物的多樣性，不僅與所處的地理環(huán)境有關(guān)，還可能與白酒生產(chǎn)過(guò)程、樣品的加工與儲(chǔ)存有緊密聯(lián)系。

3 討論

本實(shí)驗(yàn)采用高通量測(cè)序技術(shù)系統(tǒng)分析了同一酒廠的酒曲與酒糟細(xì)菌和真菌菌群結(jié)構(gòu)。Alpha 多樣性分析結(jié)果表明，2 樣品的測(cè)序深度均足以覆蓋其微生物的種類，也能有效地反映其微生物的多樣性。OTU 物種統(tǒng)計(jì)結(jié)果表明，酒曲與酒糟中細(xì)菌菌群多樣性均高于真菌菌群，且酒糟中細(xì)菌與真菌菌群多樣性則分別高于酒曲。對(duì)微生物的相對(duì)豐度進(jìn)行統(tǒng)計(jì)表明，在門的分類水平上酒曲與酒糟真菌菌群的種類差異較小但各菌門的相對(duì)豐度差異較大；相比于酒曲，酒糟細(xì)菌菌群多了放線菌門和藍(lán)細(xì)菌門。在屬的分類水平上，酒曲中的優(yōu)勢(shì)細(xì)菌類群主要包括乳桿菌屬、魏斯氏菌屬、芽孢桿菌屬等，而酒糟中優(yōu)勢(shì)細(xì)菌類群則主要包括魏斯氏菌屬、未定義藍(lán)細(xì)菌、芽孢桿菌屬等，兩者中細(xì)菌菌群種類和相對(duì)豐度均差異較大。對(duì)于兩者的真菌菌群，酒曲中優(yōu)勢(shì)真菌主要為根霉屬、絲孢酵母屬、假絲酵母屬等，而酒糟中優(yōu)勢(shì)真菌主要為絲孢酵母屬、伊薩酵母屬、Cutaneotrichosporon等，且兩者中真菌菌群種類和豐度也差異較大。此外，酒糟中檢測(cè)出部分未得到分類學(xué)注釋的微生物。

根據(jù)各省炮制工藝操作，酒曲與酒糟均可作為五倍子發(fā)酵生成百藥煎的主要輔料（占全處方量的19.05%），然而同一酒廠的酒曲與酒糟中微生物物種存在較大差異。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)酒糟的微生物物種較酒曲豐富，主要由于其微生物多樣性反映的是白酒釀造全過(guò)程的微生物菌群結(jié)構(gòu)，特別是與窖泥中豐富的微生物有關(guān)。高通量測(cè)序技術(shù)是對(duì)DNA 分子進(jìn)行序列測(cè)定，與樣品中微生物是否為活菌無(wú)關(guān)。酒糟，別名紅糟、酒醅糟、粕等，實(shí)為釀酒后剩余的殘?jiān)?，在酒醅形成酒糟的過(guò)程中有個(gè)高溫蒸餾環(huán)節(jié)，多數(shù)不耐高溫的細(xì)菌和真菌則可能會(huì)被殺死，相反酒曲則可能帶有更多活菌參與發(fā)酵過(guò)程。加之酒曲與酒糟因來(lái)源不同而提供給微生物生長(zhǎng)所需的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)及類型也存在差異，但兩者均可參與五倍子發(fā)酵形成百藥煎，其科學(xué)依據(jù)及兩者在參與五倍子的發(fā)酵過(guò)程中，其“異中有同” 的關(guān)鍵均是進(jìn)一步研究關(guān)注的重點(diǎn)。另外，本次測(cè)序分析發(fā)現(xiàn)酒曲中有相對(duì)豐度值較大的葡萄球菌屬和克雷伯菌屬細(xì)菌，它們?yōu)槭吃葱灾虏∥⑸?，可能因酒曲在生產(chǎn)、運(yùn)輸及儲(chǔ)存過(guò)程中污染所致。

目前，雖已有五倍子發(fā)酵百藥煎的發(fā)酵工藝優(yōu)化研究，但是不同文獻(xiàn)報(bào)道酵曲的選擇不一，然而選擇何種酵曲才能使發(fā)酵效果更好并確保臨床用藥安全有效仍有待于深入研究。本研究采用高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)酒曲與酒糟中的菌群結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，該技術(shù)能較全面反映樣品中微生物多樣性，與傳統(tǒng)分離培養(yǎng)方法相比具有一定優(yōu)勢(shì)，以期為繼續(xù)深入研究酒曲與酒糟對(duì)五倍子發(fā)酵百藥煎的影響，特別是對(duì)發(fā)酵過(guò)程中微生物菌群結(jié)構(gòu)多樣性、演替規(guī)律及發(fā)酵功能等影響提供參考，同時(shí)也為后續(xù)結(jié)合化學(xué)成分和藥理作用的變化研究，建立五倍子發(fā)酵百藥煎的微生物體系指標(biāo)（功能微生物群） 及進(jìn)一步優(yōu)化其制備工藝奠定基礎(chǔ)。