張 希 廖宇嬌 楊 卓 陳志敏 李文兵 胡昌江*

（1.成都中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院， 四川成都611137； 2.成都市婦女兒童中心醫(yī)院藥學(xué)部， 四川成都611137；3.四川新綠色藥業(yè)科技發(fā)展有限公司， 四川成都611930）

五子衍宗丸作為中醫(yī)補(bǔ)腎益精的經(jīng)典名方，臨床上廣泛用于治療腎虛腰痛、遺精滑精、陽(yáng)痿不育等癥［1］，由枸杞子、炒菟絲子、覆盆子、蒸五味子、鹽車(chē)前子組成。方中枸杞子、菟絲子共為君藥，補(bǔ)腎益精，益陰扶陽(yáng)；輔以覆盆子、五味子固腎澀精；佐以車(chē)前子利尿泄熱［2］，諸藥合用，具有補(bǔ)中有瀉、澀中有利、補(bǔ)陰扶陽(yáng)的配伍特點(diǎn)，主要用于男性陽(yáng)痿不育、遺精早泄、生殖能力低下等癥。

復(fù)方發(fā)揮療效是多味藥共同協(xié)作的結(jié)果，相比單味藥來(lái)說(shuō)，其治療范圍更廣泛確切，但其所含成分也更復(fù)雜多樣。因此，為了更加明確復(fù)方發(fā)揮療效的物質(zhì)基礎(chǔ)成分并尋找到其集散群，就需要根據(jù)藥物作用建立相應(yīng)動(dòng)物模型，將物質(zhì)基礎(chǔ)定位到某極性部位來(lái)進(jìn)行研究。

本實(shí)驗(yàn)以NO、FSH、T 作為檢測(cè)指標(biāo)，篩選五子衍宗丸補(bǔ)腎澀精有效部位，建立其HPLC 特征圖譜，采用灰關(guān)聯(lián)度法研究它與補(bǔ)腎澀精藥效之間的關(guān)聯(lián)性［3?4］，以期為闡明該制劑物質(zhì)基礎(chǔ)提供理論依據(jù)。

1 材料

1.1 試劑與藥物 枸杞子、菟絲子、覆盆子、五味子、車(chē)前子各10 批，均由四川新綠色藥業(yè)科技發(fā)展股有限公司提供，經(jīng)成都中醫(yī)藥大學(xué)盧先明教授鑒定為正品。聚山梨酯?80 （成都市科龍化工試劑廠）；綠原酸 （批號(hào)110753?201415）、金絲桃苷（批號(hào)11521?201205）、槲皮素（批號(hào)100081?201610）、山柰酚（批號(hào)110861?201611） 對(duì)照品均由中國(guó)食品藥品檢定研究院提供。大鼠FSH （批號(hào)TWRYNAIQ）、T （批號(hào) C0116080151 ）、NO （批號(hào)20180609） ELISA 試劑盒均由武漢賽維爾生物技術(shù)有限公司提供。乙腈、磷酸為色譜純；水為超純水；其他試劑均為分析純。

1.2 動(dòng)物 清潔級(jí)SD 大鼠，雄性，體質(zhì)量180～220 g，由四川達(dá)碩動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)SCXK（川） 2015?030。

1.3 儀器 Shimadzu LA?2040C 四元泵高效液相色譜儀（日本島津株式會(huì)社）；KQ5200DB 數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；控溫冰箱（青島海爾電冰箱生產(chǎn)廠）；JY20002 電子天平（0.01 g，上海方瑞儀器有限公司）；XPE26 電子天平（百萬(wàn)分之一，梅特勒?托利多儀器有限公司）；TG?16 離心機(jī) （四川蜀科儀器有限公司）；DPD?700 電熱恒溫水浴鍋（天津市泰斯特儀器有限公司）；摩爾1810A 細(xì)胞型超純水機(jī)（上海摩勒科學(xué)儀器有限公司）；RE?52A 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（上海亞榮生化儀器廠）。

2 方法與結(jié)果

2.1 有效部位篩選

2.1.1 提取物制備 炒菟絲子、鹽車(chē)前子、蒸五味子均按照2015 年版《中國(guó)藥典》 方法炮制，采用醇水雙提法以使其提取完全。按照《中國(guó)藥典》 比例，取枸杞子20 g、炒菟絲子20 g、覆盆子10 g、鹽車(chē)前子5 g、蒸五味子2.5 g，粉碎（過(guò)2 號(hào)篩），依次用6 倍量95%、70%、50%乙醇回流提取，每次1.5 h，合并濾液，作為醇提液；剩余藥渣加入6 倍量水回流提取2 次，每次1 h，合并濾液，作為水提液，醇提液減壓回收至無(wú)醇味后與水提液合并，濃縮得到藥液浸膏，加入適量硅藻土拌干，依次用石油醚（60～90 ℃）、乙酸乙酯、水飽和正丁醇、水索氏提取，即得［5］，揮干溶劑后加入5%吐溫?80 助溶，再加水制成10 g／mL 相應(yīng)溶液。

2.1.2 對(duì)大鼠NO、T、FSH 水平的影響 取SD 大鼠60只，隨機(jī)分為正常組、模型組、石油醚組、乙酸乙酯組、水飽和正丁醇組、水部位組，每組10 只，除正常組外其他各組大鼠每天均灌胃給予20 mg／kg 雷公藤多苷溶液［6］，連續(xù)30 d。造模后4 h，除正常組、模型組外其他各組大鼠均灌胃給予“2.1.1” 項(xiàng)下相應(yīng)提取物溶液（10 g／kg），正常組、模型組大鼠灌胃給予等量生理鹽水，連續(xù)30 d。

末次給藥后，大鼠禁食不禁水24 h，乙醚麻醉后腹動(dòng)脈取血，4 000 r／min 離心15 min，取上層血清，-20 ℃下保存，檢測(cè)卵泡刺激素 （FSH）、睪酮 （T）、一氧化氮（NO） 水平。通過(guò)SPSS 21.0 軟件進(jìn)行處理，計(jì)量資料以（） 表示，組間比較采用完全隨機(jī)設(shè)計(jì)單因素方差分析（ANOVA），以P＜0.05 為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，結(jié)果見(jiàn)表1。由此可知，與模型組比較，水飽和正丁醇提取物組NO、T 水平升高（P＜0.05），F(xiàn)SH 水平降低（P＜0.05）；與正常組比較，水飽和正丁醇提取物組三者水平均無(wú)明顯變化（P＞0.05），故選擇該部位作為有效部位。

表1 各提取物對(duì)大鼠NO、T、FSH 水平的影響（， n＝10）

表1 各提取物對(duì)大鼠NO、T、FSH 水平的影響（， n＝10）

注：與正常組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與模型組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01。

2.2 HPLC 指紋圖譜建立

2.2.1 色譜條件 Wondasil?C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相乙腈（A） -0.2% 磷酸 （B），梯度洗脫（0～20 min，3%～7% A；20～25 min，7%～10% A；25～40 min，10%A；40～65 min，10%～15% A；65～100 min，15%～30% A；100～110 min，30% A）；體積流量1.0 mL／min；柱溫30 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)254 nm；進(jìn)樣量10 μL。

2.2.2 供試品溶液制備 按“2.1.1” 項(xiàng)下方法制備各提取物后，精密稱取水飽和正丁醇提取物適量，甲醇?氯仿（7 ∶3） 溶解（由于水飽和正丁醇部位極性大，單用甲醇不能完全溶解），定容至10.0 mL，制成10.46 g／L 溶液，0.45 μm 微孔濾膜過(guò)濾，即得。

2.2.3 方法學(xué)考察

2.2.3.1 精密度試驗(yàn) 取同一批“2.2.2” 項(xiàng)下供試品溶液6 份，各精密吸取10 μL，在“2.2.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，測(cè)得各色譜峰相對(duì)保留時(shí)間、相對(duì)峰面積RSD 均小于3.0%，表明儀器精密度良好。

2.2.3.2 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批“2.2.2” 項(xiàng)下供試品溶液6 份，各精密吸取10 μL，在“2.2.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，測(cè)得各色譜峰相對(duì)保留時(shí)間、相對(duì)峰面積RSD 均小于3.0%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.2.3.3 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一批“2.2.2” 項(xiàng)下供試品溶液6 份，各精密吸取10 μL，于0、2、6、12、24、48 h 在“2.2.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，測(cè)得各色譜峰相對(duì)保留時(shí)間、相對(duì)峰面積RSD 均小于3.0%，表明供試品溶液在48 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.2.4 指紋圖譜生成 在“2.2.1” 項(xiàng)色譜條件下建立10批樣品指紋圖譜，見(jiàn)圖1～2。共有20 個(gè)共有峰，其中7 號(hào)峰為綠原酸，11 號(hào)峰為鞣花酸，12 號(hào)峰為金絲桃苷，14號(hào)峰為槲皮素，18 號(hào)峰為山柰酚。

圖1 10 批樣品HPLC 指紋圖譜

圖2 對(duì)照指紋圖譜

2.3 譜效關(guān)系研究 通過(guò)兩序列曲線幾何形狀的相似程度來(lái)判斷聯(lián)系的緊密性，曲線越接近，相應(yīng)序列之間的關(guān)聯(lián)性越大，其大小用關(guān)聯(lián)度來(lái)表示，用于判別因素對(duì)指標(biāo)的影響程度［7?8］。

2.3.1 原始數(shù)據(jù)變換 采用均值化變換法，不僅消除了指標(biāo)量綱和數(shù)量的影響，而且能更全面地反映原始數(shù)據(jù)中各指標(biāo)變異程度和相互影響程度的信息，與中心化處理相比其所得結(jié)果更準(zhǔn)確。本實(shí)驗(yàn)選擇NO、FSH、T 水平作為母序列，各共有峰峰面積作為子序列，變換原始數(shù)據(jù)后得到均值化處理序列。

2.3.2 絕對(duì)差序列 經(jīng)數(shù)據(jù)變換后的母序列記為 ｛X0（t） ｝，子序列記為｛Xi（t） ｝。在時(shí)間t＝k時(shí)（k為峰號(hào)），母序列記為｛X0（k） ｝，子序列記為｛Xi（k） ｝，兩者絕對(duì)差序列Δ0i（k） ＝｜X0（k） -Xi（k） ｜（1≤i≤m）。

2.3.3 關(guān)聯(lián)系數(shù) 取分辨系數(shù)ρ＝0.5 （ρ≤0.546 3 時(shí)分辨率最高，通常取0.5），計(jì)算公式為關(guān)聯(lián)系數(shù)η（k） ＝（Δ0imin＋ρΔ0imax） ／ （Δ0i＋ρΔimax）。

2.3.4 關(guān)聯(lián)度 參考文獻(xiàn)［9］ 報(bào)道計(jì)算關(guān)聯(lián)度r，公式為（n為子序列的數(shù)據(jù)數(shù)量），結(jié)果見(jiàn)表2。由此可知，對(duì)藥效貢獻(xiàn)較大（關(guān)聯(lián)度＞0.6） 的共有峰有17 個(gè)，依次為7 號(hào)峰（綠原酸） ＞14 號(hào)峰（槲皮素） ＞16 號(hào)峰＞13 號(hào)峰＞15 號(hào)峰＞4 號(hào)峰＞3 號(hào)峰＞17 號(hào)峰＞9 號(hào)峰＞8 號(hào)峰＞18 號(hào)峰（山柰酚） ＞10 號(hào)峰＞6 號(hào)峰＞20 號(hào)峰＞5 號(hào)峰＞1 號(hào)峰＞19 號(hào)峰。

表2 HPLC 指紋圖譜與補(bǔ)腎澀精藥效的關(guān)聯(lián)度

3 討論

FSH 主要作用于睪丸的曲細(xì)精管上皮細(xì)胞，可通過(guò)誘導(dǎo)青春發(fā)育期睪丸間質(zhì)細(xì)胞的成熟和增加間質(zhì)細(xì)胞受體的數(shù)量，從而間接促進(jìn)精子生成；T 是睪丸的主要內(nèi)分泌產(chǎn)物，它作為經(jīng)典的內(nèi)分泌因子是精子發(fā)生的關(guān)鍵局部調(diào)節(jié)劑，兩者共同促進(jìn)睪丸曲細(xì)精管生長(zhǎng)發(fā)育，促進(jìn)精子發(fā)生和成熟［10?11］。NO 在男性生殖系統(tǒng)功能的調(diào)節(jié)中具有重要作用，它參與了精子發(fā)生、獲能，并影響其質(zhì)量，介導(dǎo)陰莖勃起、調(diào)節(jié)睪丸血供、激素分泌等，從而影響男性生育能力［12?14］。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，與正常組比較模型組大鼠的T、NO 水平顯著下降，F(xiàn)SH 水平顯著升高，經(jīng)五子衍宗丸水飽和正丁醇部位干預(yù)后三者水平明顯改善，表明該部位可促進(jìn)生殖器官發(fā)育生長(zhǎng)，維持睪丸生精調(diào)控。

本實(shí)驗(yàn)建立了五子衍宗丸水飽和正丁醇部位的HPLC指紋圖譜，該方法簡(jiǎn)便，重復(fù)性良好?？疾炝艘译?0.2%磷酸、乙腈?0.4%磷酸、［乙腈?甲醇（10 ∶1）］ ?0.4%磷酸、乙腈?0.1%甲酸流動(dòng)相體系，發(fā)現(xiàn)乙腈?0.2%磷酸分離效果最佳；考察了3 種柱溫，發(fā)現(xiàn)30 ℃時(shí)色譜峰分離效果較好；采用DAD 檢測(cè)器考察了254、290、365 nm 檢測(cè)波長(zhǎng)，發(fā)現(xiàn)在254 nm 處色譜峰數(shù)量最多，分離效果最佳。

石油醚部位單用甲醇溶解時(shí)呈渾濁，不能完全溶解，放置后有沉淀析出，故又同時(shí)比較了石油醚、乙酸乙酯、水飽和正丁醇、水部位的HPLC 指紋圖譜。為了防止溶劑對(duì)指紋圖譜的影響，本實(shí)驗(yàn)結(jié)合文獻(xiàn)和樣品性質(zhì)，發(fā)現(xiàn)甲醇?氯仿（7 ∶3） 對(duì)各部位浸膏均能溶解。

灰色關(guān)聯(lián)度是研究變量間相關(guān)關(guān)系的常用統(tǒng)計(jì)方法，可預(yù)測(cè)各成分與藥效之間的關(guān)聯(lián)性，對(duì)樣本容量、數(shù)據(jù)分布規(guī)律的要求較低，容易程序化，而且在數(shù)據(jù)較少或分布不典型時(shí)結(jié)果更穩(wěn)定［15］。通過(guò)對(duì)五子衍宗丸各提取部位的HPLC 指紋圖譜進(jìn)行比較后發(fā)現(xiàn)，主要有效化學(xué)成分群集中在水飽和正丁醇部位，色譜峰數(shù)量也最多，主要有效成分也能指認(rèn)；乙酸乙酯部位藥效也有一定的改善趨勢(shì)，提取過(guò)程中也發(fā)現(xiàn)有較多有效成分溶出，雖然色譜峰數(shù)量與某些峰含有量比石油醚、水部位豐富，但與水飽和正丁醇部位相比還有較大差異。由此推測(cè)，五子衍宗丸有效成分集散群可能大多集中在乙酸乙酯、水飽和正丁醇部位的極性區(qū)間內(nèi)。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)初步揭示了五子衍宗丸補(bǔ)腎澀精有效部位的譜效關(guān)系，可為今后相關(guān)藥效成分的定性鑒定和定量分析奠定基礎(chǔ)，也為闡明其物質(zhì)基礎(chǔ)提供依據(jù)。