宋艷波 趙小慧 王科杰 李耀霞 陳雙建 梅 霞 李 宏 吳國良

(1.山西農(nóng)業(yè)大學 生命科學學院，山西 太谷 030801； 2.山西省呂梁市科技交流中心，山西 呂梁 033000； 3.山西省農(nóng)業(yè)科學院 果樹研究所, 山西 太谷 030801; 4.山西農(nóng)業(yè)大學 園藝學院，山西 太谷 030801)

桃(Prunuspersica(L.) Batseh.)原產(chǎn)中國，具有一定的耐寒特性。盡管，近年來全球氣候變暖，但是晚春霜凍的發(fā)生頻率和嚴重程度并沒有降低[1-2]，因為氣候變暖使植物春季物候期提前，秋季物候期推遲[3-5]，造成毀滅性春凍越來越多和更加常見[6]。對桃樹調(diào)查表明，仲春最高氣溫升溫極快，最低氣溫升溫相對較慢，這種較大溫差更容易使嫩芽、嫩葉、花朵和幼果受到霜害[2,7]，影響果實的發(fā)育進程，造成桃樹減產(chǎn)[7-8]；嚴重時造成桃的絕收， 2013年4月中旬的低溫和降雪以及2018年盛花期的低溫造成山西省大面積的桃樹受凍，當年產(chǎn)量近乎為零。因此，研究桃樹抗寒機理，培育抗寒品種勢在必行。

低溫會誘導相關(guān)功能基因的表達[9]，而植物對低溫等逆境的抵抗能力是受多基因共同調(diào)控的數(shù)量性狀。CBF/DREB1(C-repeat binding factor/dehydration-responsive element binding factor)是低溫信號轉(zhuǎn)導過程中的一個關(guān)鍵調(diào)控因子[10]。研究表明，CBF調(diào)控著許多與冷誘導相關(guān)功能基因的表達，通過增強該調(diào)節(jié)因子的作用就能使植物的抗冷性得到顯著提高[11]。目前已在多種植物中分離到該基因并進行了相關(guān)研究，例如將擬南芥的CBF1轉(zhuǎn)入番茄[12]，轉(zhuǎn)基因植株的耐冷性顯著提高；將擬南芥CBF3基因?qū)胗衩譡13]、OsCBF基因轉(zhuǎn)化水稻[14]，轉(zhuǎn)化植株的抗寒、抗旱和抗鹽等能力都有所提高；將南極草中的DaCBF7(D.antarcticaC-repeat binding factor 7)轉(zhuǎn)入粳稻(OryzasativaL. japonica variety ‘Dong-Jin’)，增強了水稻對寒冷脅迫的耐受性[15]。CBF是一類含有AP2(APETALA2)保守結(jié)構(gòu)域的轉(zhuǎn)錄激活因子，在植物中常以多基因家族形式存在，家庭成員編碼相關(guān)的蛋白質(zhì)，共享一個同源DNA結(jié)合域。Welling等[16]從文庫中分離到4個樺樹CBF基因；在蘋果基因組中，有5個CBF基因[17]；Badawi等[18]2007年在小麥中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)25個CBF基因，Mohseni等[19]進一步研究表明，在小麥中CBF家族至少包含65個CBF基因；Jung等[20]在Campoli等[21]的研究基礎(chǔ)上鑒定了12個新的黑麥CBF基因。在草本[22-23]和木本植物[24-26]冷響應和冷適應中CBF的功能都已經(jīng)被證明。但CBF基因的表達模式在不同組織中是不同的[27]。Xiao等[28-30]從葡萄中克隆得到對逆境脅迫響應的4個CBF：VvCBF1、VvCBF2、VvCBF3和VvCBF4，發(fā)現(xiàn)其中前3個基因在幼嫩組織中表達強度比成熟組織中高，而VvCBF4基因在成熟的老葉和花芽中也表達。低溫(0 ℃)不能誘導葡萄果肉和果皮中VvcCBF1或VvcCBF4表達[31]。CBF基因家族的不同成員在低溫誘導下有著不同的表達模式，說明不同成員對低溫脅迫響應不同。已有研究證明番茄LeCBF1在低溫下快速轉(zhuǎn)錄積累，24 h后降低到常溫下水平，番茄LeCBF4基因在低溫下也表現(xiàn)與LeCBF1類似的表達模式[32]。但是，與LeCBF1和LeCBF4相比，LeCBF2和LeCBF3對低溫都沒有響應。在擬南芥中超表達AtCBF1和AtCBF3均可顯著提高對低溫的抵抗能力，并且研究顯示CBF1和CBF3的調(diào)控路徑與CBF2不同，在冷適應條件下二者的表達順序均先于CBF2，說明各成員可能具有不同的功能活性[33]，成員間通過協(xié)同調(diào)控誘導植物冷馴化的形成[33-34]。研究表明，桃樹中有6個CBF成員，并且在果實冷藏中PpCBF1，PpCBF5和PpCBF6的表達受低溫誘導，而其他基因保持相對不變[35]。

綜上所述，CBF轉(zhuǎn)錄因子與植物抗寒性密切相關(guān)，但是由于桃的遺傳背景復雜、品種繁多，對于其轉(zhuǎn)錄因子CBF的序列與功能研究鮮有報道。本研究選取生產(chǎn)中主栽的17個桃品種，通過PCR與RT-PCR技術(shù)從中分離克隆PpCBF2基因，并分析該基因在品種間序列差異和表達特性，旨在探討不同桃品種間抗寒性差異的分子機制，以期為抗寒性育種提供相關(guān)基因資源和調(diào)控信息。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

4 ℃處理毛桃(Prunuspersica)幼苗12 h，選取葉片，迅速投于液氮中；選擇長勢一致的‘早紅霞’(P.persicavar.nectarina‘Zaohongxia’)和‘大久?！?(P.persica(L.) Batsch ‘Okubo’) 一年生嫁接苗(砧木是山桃(Pdavidiana.(Carr.)Franch)各3株進行4 ℃低溫處理，于0.0、0.5、1.0、6.0、12.0、24.0和48.0 h采摘葉片，并迅速投入液氮，存于-80 ℃。選取‘Okubo’，‘端玉’，‘金秋’，‘寒露’，‘81715’，‘三臺肉桃’，‘早金’，‘9618’,‘B6832’，‘秀峰’，‘Italia3’，‘NJN76’，‘錦霞’，‘丹墨’，‘Zaohongxia’，‘白芒蟠桃’和‘早露蟠桃’的葉片，放于冰盒中帶回實驗室，4 ℃處理1～2 d后進行基因組DNA提取。以上材料均來源于山西省農(nóng)業(yè)科學院果樹研究所桃資源圃。

1.2 試驗方法

1.2.1DNA、總RNA 提取及cDNA合成

總RNA提取是用RNA快速提取試劑盒(華越洋生物有限公司，北京)根據(jù)說明書進行，DNA提取是參照宋艷波等[36]改良CTAB法對桃葉片基因組進行提取。反轉(zhuǎn)錄根據(jù)PrimeScript反轉(zhuǎn)錄試劑盒(TaKaRa生物有限公司，大連，中國)提供程序進行。10 μL反應體系：2.0 μL 5×Prime Scipt?緩沖液，1.0 μL總RNA模板，7.0 μL無RNA酶的水。反應程序： 37 ℃ 15 min，85 ℃ 5 s，然后產(chǎn)物儲存在-20 ℃。

1.2.2引物設(shè)計與合成

以梨樹CBF基因(AEG64738)的氨基酸序列為信息探針，搜索GenBank數(shù)據(jù)庫中的桃樹EST數(shù)據(jù)，并根據(jù)高度同源的EST序列體外拼接桃樹的CBF基因，進而根據(jù)拼接序列采用Premier 5.0引物設(shè)計軟件(Premier Biosoft International，帕洛阿爾托，加利福尼亞州，美國)設(shè)計CBF特異引物對PpCBFf0/PpCBFr0(GTTTCTAACTACAAAATCCACCTTTCC/GAAGTACAAAATTTAACAATTTCTCACAAC)，根據(jù)Li等[35]報道設(shè)計熒光定量表達引物PpCBFf1/PpCBFr1(GCGTCAGAAAGCAAGTCAGC/CTCGGTGTAAAGAGGTGGAGACA)，預測產(chǎn)物長度126 bp。引物由上海生工生物工程股份有限公司合成。

1.2.3常規(guī)RT-PCR

15 μL反應體系：正反向引物(10 μmol/L)各0.6 μL，cDNA或DNA模板0.8 μL，ddH2O 5.5 μL，2× Es Taq Master Mix (含染料)(中科瑞泰生物科技有限公司，北京，中國) 7.5 μL。反應條件：94 ℃ 4 min；94 ℃ 40 s，56.5 ℃ 45 s，72 ℃ 60 s，34個循環(huán)；72 ℃ 10 min，瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.2.4序列測定及質(zhì)粒提取

按照pEASY?-T3 克隆試劑盒(北京全式金生物技術(shù)有限公司，北京，中國)說明，將回收的DNA片段連接至pEASY-T3克隆載體，25 ℃ 恒溫10 min，使回收產(chǎn)物與T3載體充分連接。37 ℃ 過夜培養(yǎng)12～16 h。將擴增片段與pEASY-T3載體的連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入Trans1-T1抗性噬菌體的化學感受態(tài)細胞(北京全式金生物技術(shù)有限公司，北京，中國)，并由北京華大中生基因有限公司測序。序列分析采用Clustal W及Boxshade聯(lián)配，以及在線NCBI數(shù)據(jù)庫(www. ncbi.nlm.nih.Gov)，二級結(jié)構(gòu)分析采用在線軟件(http:∥www.expasy.org/cgi-bin/prosite/)，疏水性/親水性分析利用在線的 ProtScale 軟件(http:∥www.expasy.org/cgibin/ protscale.pl)進行，采用Clustal X (version 1.81) 推導氨基酸序列，系統(tǒng)進化樹用MEGA(version 7.0)鄰近法默認參數(shù)獲得。

1.2.5實時熒光定量 PCR

qRT-PCR是采用Bio-Ra1d實時熱循環(huán)系統(tǒng)(赫拉克勒斯，加利福尼亞州，美國)和SYBR-Green試劑盒對基因特異性引物和看家基因引物進行實時聚合酶鏈式反應，分析基因的表達。擴增反應：95 ℃ 預變性10 s，95 ℃變性5 s(40個循環(huán))，55 ℃退火10 s，在第二階段72 ℃延伸15 s，最后55～95 ℃ 確定擴增產(chǎn)物的熔解曲線。所有反應3個重復。計算2-ΔΔCt[37]獲得基因相對表達。

1.3 統(tǒng)計分析

數(shù)據(jù)的平均值、標準誤差和顯著性分析采用SPSS 19.0 (IBM有限公司，紐約，美國)進行。數(shù)據(jù)生成圖形是采用SigmaPlot 12.5 (Systat軟件公司, 英國)。結(jié)果用平均值±標準誤差 (mean±SE)表示，P<0.05為顯著性。

2 結(jié)果與分析

2.1 PpCBF基因的克隆及序列分析

以毛桃的基因組DNA和cDNA為模板，經(jīng)過PCR和RT-PCR擴增均獲得894 bp的片段，兩者序列一致，表明桃樹PpCBF不含內(nèi)含子。分析顯示(圖1)其包含121 bp的5′端非編碼序列，83 bp的3′端非編碼序列，以及690 bp的開放閱讀框，編碼229個氨基酸，分子量約為24.976 98 ku，等電點為5.058，屬于酸性蛋白。該序列提交到GenBank，登錄號為KC885952。序列比對表明該基因為PpCBF2。利用生物信息學軟件(http:∥www.expasy.org/cgi-bin/prosite/)對推導的氨基酸序列分析，PpCBF2含有CBF家族的AP2/EREBP功能域(V67-A124)，表明該蛋白屬于CBF家族。信號肽預測 (Signal P 4.0) 顯示，PpCBF2不含信號肽，表明該蛋白無需跨膜運輸。此外，該蛋白還存在2個蛋白激酶C磷酸化位點(31～33，76～78)，1個酰胺化位點(55～58)，1個cAMP和cGMP依賴的蛋白激酶磷酸化位點(73～76)，2個N-豆蔻?；稽c(12～17，34～39)以及5個酪蛋白激酶II磷酸化位點(25～28，40～43，144～147，175～178，210～213)，2個GLYCOSYLATIONN-糖基化位點(29～32，38～41)，表明在PpCBF2的生物合成過程中需要多種翻譯后加工修飾作用才能成為具有天然功能的成熟肽。

下劃線部分為AP2/EREBP功能域。 The underlined part is AP2/EREBP domain.圖1 桃PpCBF2 cDNA的核苷酸序列及其推導的氨基酸序列Fig.1 Nucleotide sequence in cDNA and deduced amino acid sequence of peach PpCBF2

2.2 不同桃品種PpCBF基因的克隆與序列分析

由表1可知，13個品種桃PpCBF2基因發(fā)生23處堿基改變，其中8處是A和G轉(zhuǎn)換(5處A轉(zhuǎn)換為G)，13處T與C的轉(zhuǎn)換(只有1處是C變?yōu)門)；2處發(fā)生G顛換為T。供試品種PpCBF2基因編碼的氨基酸數(shù)目相同，均為229個，相似性介于98.3%～100%。由表2可知，有9個品種的氨基酸殘基發(fā)生突變，其中‘白芒蟠桃’第1個N-豆蔻酰化位點中的C變成了R、‘81715’第1個酪蛋白激酶II磷酸化位點中的S變成了P、‘大久?！?個酪蛋白激酶II磷酸化位點中的D變成了G，而‘Italia 3’、‘寒露’和‘B6832’ 的突變發(fā)生在AP2/EREBP功能域。由表3可知，它們雖然都屬于親水性蛋白，但發(fā)生氨基酸殘基突變后蛋白的親水性發(fā)生不同程度的變化，親水性平均數(shù)為-0.485～-0.430。對這些蛋白的二級結(jié)構(gòu)預測表明， 毛桃(Prunuspersica)的CBF蛋白由 26.20% 的α-螺旋、16.59%的延伸鏈、3.93%的β-轉(zhuǎn)角和53.28%的無規(guī)則卷曲組成，其他品種與之相比所含成分比例均略有差異，由此可以看出，不同品種間的二級結(jié)構(gòu)在空間上發(fā)生了一定的變異。

2.3 不同桃品種PpCBF2基因推導蛋白的系統(tǒng)進化分析

由圖2可知，在供試品種中，除‘Okubo’外，其他品種PpCBF2基因先聚為一類，再與‘Okubo’聚類，之后與蘋果等其他蛋白聚類?？梢?，桃不同品種中該基因進化較為保守，但還是會有變化，比如‘Okubo’，因此該品種的PpCBF2基因在抗冷性方面的不同值得進一步研究。

表1 不同品種桃CBF基因堿基變異Table 1 Base mutation of CBF gene in different peach varieties

表2 不同桃品種CBF基因的氨基酸殘基突變位點統(tǒng)計表Table 2 Amino acid residues mutations of CBF gene in different peach varieties

表3 發(fā)生突變的PpCBF2蛋白親水性和二級結(jié)構(gòu)變化Table 3 Changes in hydrophilicity and secondary structure of mutated PpCBF2 protein

2.4 ‘早紅霞’(‘Zaohongxia’)和‘大久保’(‘Okubo’)PpCBF2基因在低溫下表達

由表4可知， ‘早紅霞’(‘Zaohongia’)的CBF2在冷處理0.5 h表達顯著增加，在6.0 h表達量達到最高值，12～48 h緩慢下降，最大達10.91倍，差異極顯著(P<0.01)；‘大久?！?‘Okubo’)的CBF2在冷處理0.5 h雖未檢測到表達量顯著增加，但 1.0 h 時表達量達到最大，達6.24倍，差異極顯著(P<0.01)。兩品種的CBF2基因均被4 ℃低溫強烈誘導，且表達趨勢相同，但‘大久保’(‘Okubo’)的CBF2在低溫誘導的相同時間下均沒有‘早紅霞’(‘Zaohongxia’)的表達量高，品種之間表達差異極顯著(P<0.01)。

3 討 論

低溫脅迫是影響作物品質(zhì)和產(chǎn)量的主要環(huán)境脅迫。在冷調(diào)節(jié)信號通路中，CBF被認為是應對冷應激的主調(diào)節(jié)因子[38]。Champ等[39]研究發(fā)現(xiàn)，CBF1基因上調(diào)表達的時間和表達量的不同導致了枳(Poncirustrifoliata)和葡萄柚(Citrusparadisi)抗寒性的不同。翟瑞寧[40]對抗寒性不同的2個木薯品種研究表明，CBF1基因序列差異導致蛋白結(jié)構(gòu)不完整是其抗寒性弱的原因。桃樹不同品種抗寒性也存在差異[41]，為了探求這種差異的分子基礎(chǔ)，研究分析了毛桃和17個品種桃的PpCBF2基因序列，發(fā)現(xiàn)它們均含有由57 個氨基酸組成的 AP2 結(jié)合域，表明其屬于AP2/ERF家族基因[42]；在 AP2結(jié)構(gòu)域上下游分別含有PKKP/RAGRx KFxETRHP(51～66位)和 DSAWR(125～129位)兩段特殊的高保守序列，分別稱為核定位序列(nuclear localization signal，簡稱NLS)和CBF信號基序，是區(qū)別CBF 轉(zhuǎn)錄因子與AP2/ERF家族其他成員的特征短肽序列[43]，說明PpCBF2是典型的CBF轉(zhuǎn)錄因子。聚類分析顯示所有供試品種均聚合為一類，說明該基因在不同品種中具有相似功能。

遺傳距離 Genetic distance 圖2 擬南芥、楊樹、番茄、蘋果、葡萄和桃PpCBF2蛋白的系統(tǒng)發(fā)育分析Fig.2 Phylogenetic analysis of the CBF proteins of Arabidopsis， poplar, tomato, apple, grape and peach (PtCBF2 (ACR39134), PtCBF3 (ACR39133), MdCBF1 (HM992942)，VrCBF4 (AY706986)， LeCBF3 (AAS77819)，AtCBF4 (At5g51990))

表4 PpCBF2基因在‘早紅霞’和‘大久保’低溫處理0～48 h的表達Table 4 Expression of PpCBF2 in ‘Zaohongxia’ and ‘Okubo’ from 0-48 h after low temperature treatment

所有供試品種PpCBF2基因編碼的氨基酸數(shù)目相同，相似性介于98.3%～100.0%，與前人研究的CBF在植物中高度保守的結(jié)論一致[44]。其中，有9個品種氨基酸殘基發(fā)生了突變，涉及AP2結(jié)構(gòu)域內(nèi)的是‘Italia 3’(81位的C變?yōu)閅)、‘B6832’(95位G變?yōu)閂)和‘Hanlu’(121位L變?yōu)镾)，‘早金’在51～66位的核定位信號區(qū)域中發(fā)生突變(65位E變?yōu)镚)，這兩個區(qū)域?qū)BF的DNA結(jié)合特異性和轉(zhuǎn)錄活性至關(guān)重要[45-46]，AP2結(jié)構(gòu)域發(fā)生單個突變通?？梢愿淖冎参矬w的形態(tài)[45]；核定位序列中的缺失或突變會阻礙CBF1誘導其靶基因表達的能力，影響CBF1與CRT/DRE元素結(jié)合[43]。蛋白質(zhì)的翻譯后修飾影響蛋白質(zhì)的活性和基因表達[47]，‘白芒蟠桃’在第一個N-豆蔻酰化位點(14位的C變?yōu)镽)內(nèi)發(fā)生，‘81715’(25位S變?yōu)镻)和‘大久?！?213位D變?yōu)镚)分別在第一個和第五個酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位點發(fā)生突變。磷酸化位點在植物CBF/DREB1轉(zhuǎn)錄因子中大量存在，但其確切的磷酸化作用報道較少，Parinita等[47]研究發(fā)現(xiàn)御谷(Pennisetumglaucum)PgDREB2A蛋白在體外磷酸化位點是蘇氨酸殘基，且磷酸化后負調(diào)控其對DNA的結(jié)合活性。這些位點的變化還改變了蛋白的親水性，或增強或減弱，這種特性也可能與不同品種抗寒性差異有關(guān)[40]。但是彭婷[48]對梅花的研究認為，導致梅花品種抗寒性差異的決定因素并不是CBFa基因編碼區(qū)序列上的差異，而是CBF基因表達調(diào)控上的差異。

Karimi等[49]研究發(fā)現(xiàn)，4 ℃處理對葡萄不同品種的4個CBF轉(zhuǎn)錄因子均在冷脅迫初期呈上升趨勢，隨后下降，且寒冷地區(qū)的品種4個轉(zhuǎn)錄因子表達水平更高。PpCBF2在‘大久?！汀缂t霞’2個不同品種中表達趨勢與葡萄中一致，‘早紅霞’的CBF2表達量始終高于‘大久保’，但僅僅由此并不能說明哪個品種耐寒性更好。在擬南芥中CBF2缺失會使其在冷馴化前后對低溫的耐受性增加，認為CBF2負調(diào)控CBF1和CBF3的表達，CBF1和CBF3的水平增加使得植株抗性增強[34]。Li 等[35]分析桃果實在采后冷貯藏中CBF基因?qū)Φ蜏孛{迫的響應不一致，PpCBF1，PpCBF5和PpCBF6的轉(zhuǎn)錄被低溫誘導，而PpCBF2，PpCBF3和PpCBF4相對保持不變。對葡萄的研究同樣發(fā)現(xiàn)，不同CBF家族成員在不同組織中對低溫響應模式不同[28-30]，這可能與不同家族成員功能差異有關(guān)。因此，對CBF家族各成員在桃樹中的功能和互作機制進一步研究是全面分析不同品種抗性差異的基礎(chǔ)。

4 結(jié) 論

基因克隆獲得毛桃和17個品種桃的PpCBF2基因序列；發(fā)現(xiàn)一些品種在該基因的重要結(jié)構(gòu)位點發(fā)生突變，突變后蛋白質(zhì)的親水性和二級結(jié)構(gòu)都有所改變；‘早紅霞’和‘大久?！瘍善贩N的PpCBF2基因均受低溫誘導，且表達規(guī)律相似，但表達差異極顯著。