李玉生 陳 龍 程和禾 趙艷華 吳雅琴 李友剛 吳永杰

(河北省農(nóng)林科學(xué)院 昌黎果樹研究所，河北 昌黎 066600)

利用基因工程技術(shù)對果樹進行基因改造，可以克服傳統(tǒng)果樹育種的局限性[1-2]，同時也是研究基因功能和調(diào)控機制的一個重要手段。轉(zhuǎn)基因植物的離體保存需要進行多次繼代培養(yǎng)，在此過程中培養(yǎng)的外植體有可能發(fā)生遺傳變異[3-4]，包括染色體的缺失、增加[5]和染色體組的加倍[6-8]，甚至遺傳物質(zhì)的改變，其中遺傳物質(zhì)的改變主要表現(xiàn)為DNA甲基化水平的改變，并且甲基化水平的改變會隨著繼代次數(shù)的增加而改變[9-10]。從而導(dǎo)致外源基因的丟失、失活或基因重排進而影響外源基因在轉(zhuǎn)基因植株中傳遞的穩(wěn)定性。

外源基因能夠穩(wěn)定遺傳并高水平表達是轉(zhuǎn)基因果樹進入生產(chǎn)環(huán)節(jié)的先決條件[11]。目前，關(guān)于外源基因遺傳穩(wěn)定性的研究在轉(zhuǎn)基因水稻[12-13]、大豆[14-16]、玉米[17]、棉花[18-19]以及蘋果[2]等作物中有很多報道，但這些研究主要集中在有性繁殖方面。在無性繁殖情況下關(guān)于外源基因在轉(zhuǎn)基因蘋果中的遺傳穩(wěn)定性方面的研究只有少量報道，如王倩倩等[20]對繼代培養(yǎng)13年的轉(zhuǎn)CpTI基因和NPTII基因蘋果中外源基因的DNA進行檢測，發(fā)現(xiàn)外源基因可以在長期繼代保存的組培苗中穩(wěn)定存在，此研究中只在染色體DNA水平上驗證了外源基因的穩(wěn)定性，并沒有驗證轉(zhuǎn)錄水平和轉(zhuǎn)錄后水平上外源基因的穩(wěn)定性。Flachowsky等[21]研究結(jié)果表明在部分繼代4年的轉(zhuǎn)attE基因組培苗中T-DNA可以穩(wěn)定遺傳，并發(fā)現(xiàn)在部分株系間呈現(xiàn)表達差異及基因沉默現(xiàn)象，但在此研究中并沒有研究功能基因attE基因的遺傳表達穩(wěn)定性。有研究表明受體中的內(nèi)源基因有可能與外源基因產(chǎn)生共抑制從而導(dǎo)致外源基因沉默或表達不穩(wěn)定的現(xiàn)象[22]。

許多國家對轉(zhuǎn)基因植物的大田試驗有著嚴格的限制，以防止基因漂移等潛在的生態(tài)安全問題。利用組織培養(yǎng)無性繁殖的方法保存轉(zhuǎn)基因植物種質(zhì)可以防止這種情況的出現(xiàn)[23-24]。然而，關(guān)于利用無性繁殖手段進行長期繼代保存的轉(zhuǎn)基因蘋果中外源基因的遺傳穩(wěn)定性的研究鮮有報道。本研究以離體培養(yǎng)9年(繼代95次)的轉(zhuǎn)基因蘋果組培苗為試材，采用卡那霉素(Kan)抗性篩選、PCR/RT-PCR、qRT-PCR和熒光顯微檢測等技術(shù)對長期培養(yǎng)的蘋果組培苗中外源基因的遺傳穩(wěn)定性和不同株系間的表達差異進行分析，旨在為轉(zhuǎn)基因蘋果后代穩(wěn)定地離體保存提供參考,以期為進一步研究轉(zhuǎn)基因蘋果中外源基因的整合及表達機制奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試材料為本實驗室保存9年的蘋果(MalusdomesticaBorkh．)品種‘嘎拉’的同一個轉(zhuǎn)化試驗中7個獨立轉(zhuǎn)基因株系組培苗。轉(zhuǎn)化用根癌農(nóng)桿菌菌株為EHA105，購自生工生物工程(上海)股份有限公司；轉(zhuǎn)化載體為攜帶GFP基因(綠色熒光蛋白基因)的pCAMBIA-1302載體，購自武漢轉(zhuǎn)導(dǎo)生物實驗室有限公司；轉(zhuǎn)化方法為農(nóng)桿菌介導(dǎo)的葉盤轉(zhuǎn)化法[25]。繼代培養(yǎng)基為：MS+3.0 mg/L 6-BA+0.25 mg/L NAA+200 mg/L 羧芐青霉素(Cef)+50 mg/L Kan+30 g/L蔗糖+6.8 g/L瓊脂；繼代培養(yǎng)條件為：25 ℃，2 500 lx光照強度，每5周繼代1次。

1.2 試驗方法

1.2.1PCR/RT-PCR擴增檢測轉(zhuǎn)基因植株中外源GFP基因的遺傳穩(wěn)定性

采用CTAB法提取對照植株和轉(zhuǎn)GFP基因植株基因組DNA，根據(jù)質(zhì)粒載體pCAMBIA-1302中GFP基因序列設(shè)計PCR/RT-PCR反應(yīng)特異引物GFPS/GFPA(表1)，進行PCR擴增，檢測基因組中GFP基因存在情況；用Trizol提取試劑盒(天根生化科技(北京)有限公司)根據(jù)操作說明提取野生型和轉(zhuǎn)化株系總RNA；用生工生物工程(上海)股份有限公司的AMV First strand cDNA Synthesis Kit進行反轉(zhuǎn)錄合成第一鏈cDNA，利用PCR/RT-PCR反應(yīng)特異引物GFPS/GFPA(表1)進行RT-PCR擴增，檢測GFP基因在長期保存的轉(zhuǎn)基因蘋果組培苗中的轉(zhuǎn)錄情況。

PCR/RT-PCR反應(yīng)程序為：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性40 s，53 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，共30個循環(huán)；最后72 ℃延伸10 min。擴增片段約620 bp。1.0%瓊脂糖凝膠進行電泳，溴化乙錠染色，在紫外凝膠成像系統(tǒng)下觀察結(jié)果并拍照。

1.2.2轉(zhuǎn)基因植株中外源NPTII基因及卡那霉素抗性檢測

以基因組DNA為模板，擴增引物NPTII-S/NPTII-A(表1)，進行PCR擴增。PCR/RT-PCR反應(yīng)程序為：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性40 s，49 ℃ 退火1 min，72℃延伸1 min，共30個循環(huán)；最后72 ℃延伸10 min。擴增片段長為790 bp。

取繼代培養(yǎng)的轉(zhuǎn)化株系和非轉(zhuǎn)基因植株組培苗新梢，接種在含有Kan 50 mg/L的繼代培養(yǎng)基(MS+3.0 mg/L 6-BA+0.25 mg/L NAA+200 mg/L Cef+30 g/L蔗糖+6.8 g/L瓊脂)中，40 d后觀察對照植株與轉(zhuǎn)化植株的生長狀況。

1.2.3熒光顯微觀察檢測轉(zhuǎn)基因植株中外源GFP基因的表達穩(wěn)定性

在Olympus BX51(Olympus Optical Co．，Japan激發(fā)光譜450～490 nm)熒光顯微鏡下檢測7個轉(zhuǎn)基因株系組培苗剛發(fā)育成葉的莖尖組織，觀察不同轉(zhuǎn)化株系中外源GFP基因的表達情況，拍照記錄并用Image J軟件分析光密度值。

1.2.4外源GFP基因的相對熒光定量PCR分析

采用1.2.1節(jié)中方法提取野生型和7個獨立的轉(zhuǎn)化株系總RNA，并進行反轉(zhuǎn)錄合成第一鏈cDNA，-20 ℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

根據(jù)GFP基因序列設(shè)計熒光定量特異引物GFP-F/GFP-R(表1)，擴增長度為116 bp。內(nèi)參基因為蘋果Actin-7基因，內(nèi)參基因引物為Actin-Fn/Actin-Rn(表1)，擴增長度為151 bp。GFP基因的相對熒光定量分析，按照ABI公司的SybrGreen PCR Master Mix試劑盒說明進行擴增。熒光定量PCR反應(yīng)在Roche公司的LightCycler480 Software Setup型熒光定量PCR儀上進行，反應(yīng)程序是 95 ℃ 預(yù)熱3 min；隨后95 ℃ 15 s，60 ℃ 40 s，進行40個循環(huán)，然后4 ℃保存。根據(jù)2-ΔΔCT法[26]計算GFP基因在mRNA水平上的相對表達量。

表1 PCR/qRT-PCR引物序列Table 1 Primer sequences for the PCR and qRT-PCR amplification

1.2.5拷貝數(shù)與表達量相關(guān)性分析

使用SPSS Statistics 17.0數(shù)據(jù)處理軟件對不同轉(zhuǎn)基因株系的外源基因的拷貝數(shù)與mRNA水平表達量進行皮爾森相關(guān)性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 轉(zhuǎn)基因蘋果中外源GFP基因的PCR/RT-PCR檢測

由圖1可知，對照組均未擴增出任何條帶，而在所有蘋果轉(zhuǎn)基因植株中均擴增符合預(yù)期的條帶。PCR/RT-PCR擴增結(jié)果說明GFP基因在蘋果‘嘎拉’轉(zhuǎn)基因組培苗中離體繼代培養(yǎng)9年后仍然穩(wěn)定存在，并且能夠正常轉(zhuǎn)錄。

M, 2 000 bp marker; C,對照 control; 1， gp6410； 2， gp5601； 3， gp1414； 4， gp3408； 5， gp3417； 6， gp3418； 7， gp3602。圖1 轉(zhuǎn)GFP基因蘋果‘嘎拉’組培苗PCR(a)和RT-PCR(b)檢測Fig.1 PCR (a) and RT-PCR (b) analysis of GFP gene in transgenic plantlets in vitro of ‘Gala’ apple

2.2 轉(zhuǎn)基因植株中外源NPT II基因及卡那霉素抗性檢測

由圖2可知，所有轉(zhuǎn)基因株系均擴增出1條790 bp的特異條帶，野生型對照植株未擴增出特異條帶。說明外源NPTII基因在蘋果轉(zhuǎn)基因組培苗中離體繼代培養(yǎng)9年后仍然穩(wěn)定存在。

對在含有Kan 50 mg/L的繼代培養(yǎng)基上生長40 d后的野生型植株及各轉(zhuǎn)化系植株進行形態(tài)學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)，在卡那霉素的篩選壓力下7個轉(zhuǎn)化株系均能正常生長，葉片均表現(xiàn)出有活力的綠色(圖2(b))。野生型植株呈現(xiàn)出活力下降、生長緩慢，并且葉片變?yōu)樽睾稚?，趨于死?圖2(c))。結(jié)果表明，NPTII基因在繼代9年的轉(zhuǎn)化株系中不但穩(wěn)定存在而且還可以正常表達，并表現(xiàn)出卡那霉素抗性。

M, 2 000 bp marker; C, 對照 control; 1， gp6410； 2， gp5601； 3， gp1414； 4， gp3408； 5， gp3417； 6， gp3418, 7， gp3602。圖2 轉(zhuǎn)基因植株中外源NPT II基因及卡那霉素抗性檢測Fig.2 Detection of exogenous NPT II gene and kanamycin resistance in transgenic plants

2.3 轉(zhuǎn)基因蘋果外源基因拷貝數(shù)

內(nèi)參Actin-7基因標準曲線的直線回歸相關(guān)系數(shù)R2=0.997 5，說明線性關(guān)系重復(fù)性較好，可以滿足熒光定量的標準曲線精度要求。Actin-7基因Ct值與模板初始拷貝數(shù)之間的相關(guān)性方程為：y=-3.212x+52.64，其中y代表Ct值，x代表模板初始拷貝數(shù)對數(shù)值。

GFP基因的標準曲線的直線回歸相關(guān)系數(shù)R2=0.996，線性關(guān)系重復(fù)性較好。GFP基因Ct值與模板初始拷貝數(shù)之間的相關(guān)性方程為：y=-3.140x+49.13，其中y代表Ct值，x代表模板初始拷貝數(shù)對數(shù)值。

對7個不同轉(zhuǎn)化株系進行絕對熒光定量PCR反應(yīng)，每個株系設(shè)置3個重復(fù)。獲得各轉(zhuǎn)化株系Ct值(表2)。根據(jù)內(nèi)外源基因的標準曲線方程，計算各轉(zhuǎn)化株系對應(yīng)的外源基因初始模板拷貝數(shù)，并由外源基因相對于內(nèi)參基因的比值估算相對拷貝數(shù)[27-28](表2)。

表2 Actin-7基因和GFP基因在7個轉(zhuǎn)化株系中的Ct值及拷貝數(shù)Table 2 Ct values and copy number of Actin-7 gene and GFP gene in 7 transformed lines

2.4 熒光顯微鏡檢測轉(zhuǎn)基因株系GFP基因的表達情況

在熒光顯微鏡下檢測，7個轉(zhuǎn)GFP基因株系的嫩葉均不同程度地發(fā)出綠色熒光(圖3)。由表3可知，7個轉(zhuǎn)GFP基因株系的嫩葉發(fā)出的綠色熒光表達強度有明顯差異，其熒光強度由弱至強的排序為：gp3417

(a) 對照植株 Control; (b) gp6410; (c) gp5601; (d) gp1414; (e) gp3408; (f) gp3417; (g) gp3418; (h)gp3602圖3 熒光顯微鏡觀察繼代培養(yǎng)9年的轉(zhuǎn)基因蘋果葉片GFP基因表達情況(標尺=500 μm)Fig.3 Expression of GFP gene in transgenic apple leaves cultures for 9 years under fluorescence microscope (Scale bar=500 μm)

表3 7個不同轉(zhuǎn)基因株系的綠色熒光平均光密度值Table 3 The average density of the green fluorescent in 7 different transgenic lines

2.5 不同轉(zhuǎn)化株系間GFP基因相對表達量測定

由圖4可知，野生型植株中沒有檢測到GFP基因的表達；7個蘋果轉(zhuǎn)化株系中GFP基因均有轉(zhuǎn)錄表達，相對表達量分別為1.00、0.53、0.51、2.76、0.21、1.44和5.80，GFP基因表達量有顯著差異(圖4)，表達量由低至高的排序為：gp3417

2.6 轉(zhuǎn)基因蘋果外源基因拷貝數(shù)與表達量的關(guān)系

將外源GFP基因的拷貝數(shù)與轉(zhuǎn)基因蘋果的GFPmRNA的表達量進行皮爾森相關(guān)性分析結(jié)果顯示：皮爾森相關(guān)系數(shù)r=-0.009，說明拷貝數(shù)與表達量呈極弱負線性相關(guān)；雙尾檢驗的顯著性P為0.984，說明GFP基因在mRNA水平上的表達量與其拷貝數(shù)無顯著相關(guān)性(表4)。

3 討 論

外源基因的遺傳穩(wěn)定性主要包括目的基因整合的遺傳穩(wěn)定性、目的基因表達的穩(wěn)定性和目標性狀表現(xiàn)的穩(wěn)定性等方面[29]。已有研究表明離體培養(yǎng)的植物在多次的擴繁與繼代過程中經(jīng)常會出現(xiàn)體細胞無性系變異，變異率最高可以達到30%～40%[30]，轉(zhuǎn)基因植株經(jīng)過多次繼代保存后也有可能受到體細胞無性系變異的影響，從而導(dǎo)致外源基因的丟失、失活或基因重排進而影響外源基因在轉(zhuǎn)基因植株后代中的遺傳穩(wěn)定性，制約了轉(zhuǎn)基因植物在生產(chǎn)中的應(yīng)用。

WT, 野生型植株wild type plants; gp6410, gp5601, gp1414, gp3417, gp3418 and gp3602 represent transgenic lines. 不同字母表示在0.05水平上差異顯著。Different letters in each column indicate significant difference at 0.05 level according to Tukey Test.圖4 轉(zhuǎn)基因蘋果外源GFP基因mRNA表達量Fig.4 Expression of GFP gene mRNA in transgenic apple

表4 轉(zhuǎn)基因蘋果外源基因拷貝數(shù)與GFP mRNA 表達量的相關(guān)性Table 4 Correlation analysis between GFP mRNA expression and exogenous gene copy number of transgenic apples

本研究在外源基因的整合穩(wěn)定性、轉(zhuǎn)錄水平以及表達水平3個方面評價了7個長期在含有 50 mg/L 卡那霉素篩選壓下培養(yǎng)的轉(zhuǎn)基因蘋果株系。7個轉(zhuǎn)化株系均由含有NPTII、GFP基因的pCAMBIA-1302載體進行轉(zhuǎn)化。

通過PCR/RT-PCR擴增，所有株系中均可檢測到NPTII基因和GFP基因，將7個轉(zhuǎn)化株系的組培苗接種在含有卡那霉素的培養(yǎng)基上，所有轉(zhuǎn)基因株系均表現(xiàn)有卡那霉素抗性，而非轉(zhuǎn)基因植株則逐漸死亡，同時，熒光檢測結(jié)果顯示7個轉(zhuǎn)化株系均呈現(xiàn)不同強度的綠色熒光。以上研究結(jié)果說明外源基因可以在長期保存的組培苗中穩(wěn)定遺傳，并且在轉(zhuǎn)基因植株中能正常表達NPTⅡ蛋白和GFP蛋白，但7個不同株系間GFP基因的表達強度并不一致。此現(xiàn)象在其他轉(zhuǎn)基因植物中也廣泛存在[31-33]，說明在轉(zhuǎn)基因植物中經(jīng)常會發(fā)生外源基因在受體植物中的表達活性受到抑制而導(dǎo)致不同轉(zhuǎn)化株系間外源基因表達不一致、各獨立轉(zhuǎn)化體間表型出現(xiàn)顯著差異的現(xiàn)象[34]。

基因的表達水平高低直接由其轉(zhuǎn)錄本的豐度體現(xiàn)，轉(zhuǎn)錄本的豐度越高，則該基因的表達水平越高[35]。相對熒光定量PCR結(jié)果表明，7個不同轉(zhuǎn)化株系間GFP基因的表達量有顯著差異，且各株系間外源基因表達量與熒光平均光密度值基本一致(表3和圖4)，只有g(shù)p5601和gp1414這2個株系綠色熒光強度和mRNA表達量對應(yīng)關(guān)系相反。綜上，7個不同轉(zhuǎn)化株系之間外源基因的遺傳差異主要發(fā)生在轉(zhuǎn)錄水平上，即由DNA轉(zhuǎn)錄為mRNA的過程中。轉(zhuǎn)錄水平的基因沉默主要有2種影響因素：一是外源基因整合位點處于高度甲基化的轉(zhuǎn)錄活性較低的區(qū)域，導(dǎo)致外源基因失活不穩(wěn)定引起基因沉默[32,35-36]；二是外源基因在轉(zhuǎn)基因植物中的拷貝數(shù)也可以引起基因沉默，當(dāng)外源基因以單拷貝整合到多個位點或串聯(lián)的多拷貝整合到一個位點或多個位點均可造成外源基因不同程度的失活[33,37]。

本研究通過對外源基因表達有顯著差異的7個轉(zhuǎn)基因株系進行外源基因拷貝數(shù)鑒定發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)基因蘋果不同株系間外源基因的拷貝數(shù)并不盡相同(表2)，并且將外源基因的拷貝數(shù)分別與mRNA的表達量進行皮爾森相關(guān)性分析后發(fā)現(xiàn)兩者呈現(xiàn)極弱負相關(guān)，并沒有顯著的相關(guān)性。在組培過程中DNA甲基化水平的變化趨勢不同與外植體的類型有較大關(guān)系[10]，如：在火龍果中隨著繼代次數(shù)增加，DNA甲基化水平增加0.9%[38]；在大麥上的研究結(jié)果表明隨著繼代次數(shù)的增加DNA甲基化水平反而降低[39]；而石斛組培苗在經(jīng)過4次繼代后并沒有發(fā)現(xiàn)DNA的甲基化[40]。在本研究中同為單拷貝的株系gp6410、gp5601、gp1414和gp3602之間mRNA表達量有顯著差異，這種現(xiàn)象說明外源基因的整合位點的確可以影響其mRNA的表達量，但這種表達量的差異是由于外源基因整合位點基因組序列本身的差異引起，還是因為繼代過程中整合位點的DNA序列甲基化水平變化造成，還有待進一步研究。在7個轉(zhuǎn)基因株系中以單拷貝gp3602株系表達量最高，而多拷貝的株系gp3408、gp3417和gp3418的表達量并沒有隨著拷貝數(shù)的增加而升高，此現(xiàn)象可能是由于多個高度相似的內(nèi)源基因的存在抑制了外源基因的表達，相關(guān)性分析結(jié)果顯示它們之間并沒有顯著相關(guān)性，說明還有其他因素影響轉(zhuǎn)基因蘋果中外源基因的表達，也有待進一步研究。